荧光标记复合扩增讲解

PCR扩增的原理和步骤聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。

它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。

但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。

人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，具有里程碑意义。

目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领域研究中。

本文对实时荧光定量PCR的原理、分类和应用进行阐述。

一、实时荧光定量PCR技术的原理real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。

(1)荧光域值(t hreshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。

15个常染色体和18个Y染色体STR基因座r复合扩增检测体系及法医学应用顾丽华;杨帆;梅兴林;周怀谷【摘要】目的建立15个常染色体和18个Y染色体STR基因座以及性别基因座的六色荧光标记复合PCR直扩检测体系,并评估其法医学应用价值.方法采用六色荧光标记技术,建立15个常染色体STR基因座(D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D8S1179、D5S818、FGA)和18个Y染色体STR基因座(DYS527a/b、DYS448、DYS456、DYS385a/b、DYS458、DYS391、DYS390、DYS19、DYS438、DYS393、DYS389Ⅰ、DYS439、DYS389Ⅱ、DYS392、GATA、DYS635)以及Amelogenin的复合扩增体系,收集800份无关人员血样进行基因座检测,评估所建复合扩增体系的稳定性、灵敏度、种属特异性、直扩可行性以及抗抑制性.结果本检测体系对800份无关人员血样复合扩增后,结果准确,灵敏度达0.125ng;种属特异性高;38份案件检材全部准确分型.在对照男性与女性的DNA浓度比值大于等于1:4时,男性DNA的所有基因座均能准确分型.若模板DNA中含一定浓度的已知抑制剂时,所有基因座也均准确分型.结论本文建立的复合扩增检测体系可同时检测15个常染色体和18个Y染色体基因座以及性别基因座,结果稳定准确,灵敏度高,可为法医DNA检测分析提供一个新选择.【期刊名称】《刑事技术》【年(卷),期】2018(043)001【总页数】5页(P30-34)【关键词】STR;复合PCR;直扩体系;六色荧光标记;法医遗传学【作者】顾丽华;杨帆;梅兴林;周怀谷【作者单位】上海市公安局物证鉴定中心,法医物证学现场应用技术公安部重点实验室,上海市现场物证重点实验室,上海 200083;上海市公安局物证鉴定中心,法医物证学现场应用技术公安部重点实验室,上海市现场物证重点实验室,上海 200083;无锡中德美联生物技术有限公司,江苏无锡 214174;上海市公安局物证鉴定中心,法医物证学现场应用技术公安部重点实验室,上海市现场物证重点实验室,上海 200083【正文语种】中文【中图分类】DF795.2司法鉴定中，常染色体和Y染色体的STR基因座检测已成为常规手段。

str嵌合率报告解读
方法采集健康献血者外周血按白细胞比例两两混合制备不同供受者比例的体外嵌合体模型,对15个STR位点进行荧光标记复合扩增,扩增产物进行序列分析仪毛细管电泳,计算嵌合率。

结果实验测得嵌合率与扩增前样本嵌合率呈显著直线相关,r=0.999 7,最小检出供者细胞嵌合率1%。

供者嵌合率≥5%的嵌合体模型嵌合率的检测值与理论值差别无统计学意义(P0.05),5%的模型嵌合率检测值与理论值差别有统计学意义(P0.05)。

结论荧光标记复合扩增STR基因结合序列分析仪毛细管电泳检测嵌合率方法个体识别力高,特异,敏感,当供者嵌合率≥5%时能准确反映异基因造血干细胞移植后患者的嵌合状态。

实验二十三复合扩增STR基因座的激光荧光自动检测分型一原理：将多个STR基因座的引物同时加入一个扩增管，优化引物设计和扩增条件，可实现对多个STR基因座的同步扩增。

当不同基因座的扩增产物片段大小不同时，可通过电泳分离并区分不同基因座的等位基因片段。

对基因片段大小相近和重叠的基因座引物标记不同的荧光物质，可获得荧光标记的扩增产物，通过识别标记的不同荧光物质，可识别电泳分离时片段大小重叠的不同基因座产物。

荧光物质含有共轭双键，能够吸收激光并被激发至高能量激发态，处于不稳定激发态的荧光物质跃迁回到基态时，多余的能量以光子的形式释放，可用荧光信号识别记录设备记录下荧光染料发出的光信号。

不同的荧光染料具有不同的激发波长和吸收波长，可被光信号检测设备准确识别和记录。

310基因分析仪整合了毛细管电用技术和激光激发荧光检测技术，样品电泳进样采用计算机控制的自动电进样，当荧光标记的复合扩增等位基因片断通过毛细管电泳通过检测窗时，电泳时间和荧光种类与强度被自动收集和记录。

每个样品电泳中加入已知片段大小的分子量内标，测算每个等位基因片段的相对大小，与基因座等位基因分型标准物比较，确定每个基因座的各个等位基因，对样本的各基因座自动分型。

二设备器材与试剂：310基因分析仪，PCR扩增仪，台式高速离心机，恒温水箱，水浴锅；0.5∼2.5µl、0.5∼10µl、10∼100µl、100∼1000µl连续可调移液器，0.5∼10µl、10∼100µl、100∼1000µl高温灭菌塑料吸头，离心管水浴支架，离心管架，0.5ml、1.5ml离心管，0.2ml薄壁PCR扩增管；Chelex，含0.11mmol/L EDTA-Na2的pH8.0、0.005mol/L Tris-HCl缓冲液，荧光标记和非标记的多个基因座混合引物，混合PCR反应液，热启动Taq酶，ROX标记分子量内标，超纯去离子甲酰胺，高温灭菌蒸馏水。

qpcr扩增原理qPCR扩增原理解析1. 什么是qPCR？qPCR全称为定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction），是一种利用特定的酶和荧光探针来测量DNA或RNA 的数量的技术。

它可以在非常短的时间内测定起始样本中特定序列的拷贝数。

2. PCR扩增的基本原理qPCR是PCR技术的一种变种，因此我们首先来了解一下PCR的基本原理。

1.Denaturation（变性）：将待扩增DNA双链变性，将其分离成两条单链。

这一步通常在94-98°C的高温下进行，以破坏DNA的双氢键。

2.Annealing（退火）：将引物与已变性DNA单链相结合。

引物是已知序列的DNA片段，它们与目标DNA序列的两端互补配对。

退火温度一般选择在50-65°C之间。

3.Extension（延伸）：通过加入DNA聚合酶酶（例如Taq酶），引物在目标DNA上进行扩增。

聚合酶可以按照DNA的模板合成新的DNA链。

延伸温度通常在72°C左右。

重新循环以上三个步骤，每个循环都会使目标DNA的数量翻倍。

PCR扩增可以通过进行多次循环来构建指数级增长。

3. qPCR与PCR的不同之处qPCR相比于传统PCR，可以对扩增产物进行实时定量测定，而传统PCR只能获得是否成功扩增的信息。

qPCR采用荧光探针来监测扩增过程中的产物，而PCR只是通过检测末端标记的引物或染色剂来判断是否有扩增产物。

荧光探针中包含一个探针序列、一个荧光染料和一个辅助染料。

荧光探针能够与扩增产物的特定序列互补，同时荧光染料与辅助染料的相互作用导致荧光信号的释放。

4. qPCR扩增原理使用qPCR测量DNA或RNA数量的过程分为两个主要步骤：第一步：引物和荧光探针设计在qPCR实验之前，需要设计引物和荧光探针。

引物是一对针对目标序列的短DNA片段，其中一对引物分别位于目标序列的两侧。

荧光探针包含一个专门针对目标序列的探针序列和荧光染料。

荧光定量pcr原理和操作方法荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）是一种基于PCR技术，通过荧光信号来实时监测和定量PCR反应中的目标序列数量的方法。

本文将从原理和操作方法两个方面来详细介绍荧光定量PCR。

一、原理：荧光定量PCR的原理基于PCR反应进行，但其独特之处在于在PCR反应中引入荧光探针，通过荧光信号的实时监测来定量PCR反应中的目标序列数量。

1.引物设计：荧光定量PCR中仍需要设计引物。

引物是一对DNA片段，分别位于目标序列的上下游，用于对目标序列进行扩增。

扩增反应是由引物特异性地结合到目标序列上，并在PCR过程中进行DNA链的合成，增加DNA片段的数量。

2.荧光标记探针：与常规PCR不同的是，荧光定量PCR还需要引入荧光标记的探针。

探针是一个具有荧光标记物和荧光猝灭物（quencher）的特殊DNA片段。

探针要与目标序列上某一特定区域的序列互补，使探针与目标序列结合。

在探针结合的情况下，荧光标记物和荧光猝灭物相互靠近，导致荧光信号被猝灭。

3.荧光信号监测：荧光定量PCR在PCR反应过程中，实时检测荧光信号。

在荧光信号监测仪器的作用下，对PCR试管中的荧光强度进行连续采样。

在PCR初期，目标序列数量较少，探针与目标序列结合较少，荧光信号较小。

随着PCR反应的进行，目标序列数量增加，探针与目标序列结合增多，荧光信号增强。

通过监测PCR过程中荧光信号的变化，可以得到PCR反应过程中目标序列的实时数量。

二、操作方法：荧光定量PCR的具体操作步骤如下：1.实验室准备：准备好PCR试剂盒，包括引物、探针、聚合酶、dNTPs等。

根据实验需要，配制PCR试剂的工作液。

2.样品提取：根据实验的需要，从样本中提取出DNA模板。

如血液、组织、细胞等。

3.PCR反应体系的配制：根据实验需求和试剂盒说明书，配制PCR反应体系。

包括目标序列特异性的引物和探针，以及其他试剂如聚合酶、dNTPs等。

法庭科学人类荧光标记str 复合扩增检测试剂质量基本要求
法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂的质量基本要
求如下：
1. 纯度要求：荧光标记STR复合扩增检测试剂应具有高纯度，确保不会引入任何其他无关杂质。

这可以通过高效液相色谱（HPLC）或质谱等分析方法进行验证。

2. 稳定性要求：荧光标记STR复合扩增检测试剂应在储存期
间能够保持稳定，不会出现明显的分解或降解现象。

可以通过长期稳定性试验来验证其稳定性。

3. 敏感性要求：荧光标记STR复合扩增检测试剂应具有较高
的敏感性，能够在样本中检测到低浓度的目标DNA片段。

可
以通过模拟样品进行适当稀释，然后进行验证实验来评估其敏感性。

4. 特异性要求：荧光标记STR复合扩增检测试剂应具有较高
的特异性，能够准确识别目标DNA片段而不受其他杂质的干扰。

可以通过在样本中引入其他DNA样本或杂质，然后进行
验证实验来评估其特异性。

5. 一致性要求：荧光标记STR复合扩增检测试剂的不同批次
之间应具有较高的一致性，即不同批次的产品在性能和质量方面应保持一致。

可以通过批间比对实验来评估其一致性。

6. 检测效率要求：荧光标记STR复合扩增检测试剂应具有较
高的检测效率，能够在较短的时间内完成扩增反应并产生可靠的结果。

可以通过实时荧光定量PCR（qPCR）等方法来评估其检测效率。

总之，法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂的质量要求应包括纯度、稳定性、敏感性、特异性、一致性和检测效率等方面的考虑。

这些要求是确保测试剂在法庭科学人类鉴定中能够提供准确、可靠结果的基础。