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245doi:10.3969/j.issn.0253-9608.2018.04.003“人造精子”介导半克隆技术的建立与应用晏萌①②，李劲松①②†①中国科学院上海生命科学研究院 生物化学与细胞生物学研究所，上海 200031；②中国科学院上海生命科学研究院GTP 中心，上海 200031摘要 “人造精子”，也即单倍体胚胎干细胞，为正向遗传学和反向遗传学的研究提供了巨大的帮助，使得研究对象从细胞层面，扩展到更为可信的动物层面。
作为胚胎干细胞的一种，“人造精子”拥有着胚胎干细胞可以无限扩增，且保持着很高的多能性的优势；同时，它具备精子的特性，携带有稳定的单倍体基因组遗传信息，能够与卵细胞融合为合子，并发育成健康的半克隆个体。
“人造精子”的技术不仅推动了基础研究的速度，而且对医学遗传病的研究和治疗提供了革命性的工具。
文章主要讲述了“人造精子”的起源、半克隆技术的实现，以及“人造精子”目前最新的应用研究。
关键词 精子；人造精子；单倍体胚胎干细胞；遗传学；基因组标签计划；蛋白质云图“人造精子”是近些年来科学家利用先进的胚胎操作技术创造的一种可以替代精子，使卵细胞“受精”，并能产生出正常后代的单倍体胚胎干细胞。
其背后凝结着科学家对干细胞技术和细胞显微操作技术的探索，以及动物胚胎发育和各种相关学科的理论完善，如胚胎发育学、蛋白质组学和表观遗传学。
本文就来讲述 “人造精子”的来源、半克隆技术的发展，以及“人造精子”在生命科学和医学等领域中的应用。
1 什么是精子？想要了解什么是“人造精子”，首先要知道什么是精子。
按照定义上来说，精子是男性的生殖细胞，英文名称sperm 来源于希腊文sperma ，意思为种子。
高等动物的有性生殖靠精子和卵细胞结合，从而形成合子，再由合子经过一系列有规律的细胞分裂与分化过程，最终发育成一个成熟的下一代个体，而精子所携带的父亲一方的基因也由此遗传至下一代[1]。
成熟的小鼠精子分为4个部分：头部，包含被顶体包裹的致密化细胞核；颈部，主要包含精子的中心粒；中段，包含了轴丝和大量外围的线粒体，可以产生大量ATP ，为精子在母体中的运动提供能量；尾部或者鞭毛，是精子的主要运动部位。
精原干细胞研究进展宋瑞高;姚晓磊;石磊【摘要】Spermatogonial stem cells are oocytes of male mamals germ cells which not only can maintain the number of themselves but also can differentiate to spermatocyte. Spermatogonial stem cells are also closely related to the genetic background of the next male generation individuals. Therefore, the study of spermatogonial stem cells in the field of cell biology,medicine and transgene has broad application prospects. In this review,biological characteristics,isolation,purification,cultivation and transplantation of spermatogonial stem cells were discussed.%精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是各种雄性动物生殖细胞的母细胞，是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，并且在雄性个体中精原干细胞与下一代的遗传背景密切相关。
因此，精原干细胞在细胞生物学、医学、转基因等领域的研究有着广阔的应用前景。
文章根据国内外相关研究进展，对精原干细胞的生物学特性、分离纯化与培养、移植等作一概述。
【期刊名称】《中国草食动物科学》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】4页(P54-56,57)【关键词】精原干细胞;生物学特性;分离纯化;移植【作者】宋瑞高;姚晓磊;石磊【作者单位】山西农业大学动物科技学院，太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，太谷 030801【正文语种】中文【中图分类】Q2哺乳动物雄性成体中的精子发生系统在雄性配子的产生和进化过程中起着基因传递的作用，这一系统的基础就是精原干细胞（spermatogonial stemcells，SSCs）。
细胞培养技术中的细胞诱导分化方法细胞培养技术是一种重要的研究方法，它可以用来研究细胞的生物学特性和功能，也可以用来治疗一些疾病。
在细胞培养技术中，细胞诱导分化方法是一项关键技术，它可以将多能干细胞分化为特定功能的细胞类型，如心脏细胞、神经元等。
本文将介绍几种常见的细胞诱导分化方法。
首先，一种常见的细胞诱导分化方法是传统的化学诱导法。
这种方法通过添加一系列的化学物质到培养基中，来模拟细胞发育过程中的信号通路，从而诱导细胞向特定细胞类型分化。
例如，要诱导多能干细胞分化为心脏细胞，可以添加一些心脏发育相关的化学物质，如心肌生成因子。
然而，化学诱导法往往存在效率低、稳定性差等缺点，且可能对细胞产生不可逆的损害。
另一种常见的细胞诱导分化方法是基因转导法。
这种方法通过将特定基因导入到细胞中，来激活或抑制细胞内的信号通路，从而诱导细胞分化成特定细胞类型。
基因转导可以通过病毒载体或基因转染剂实现。
例如，要诱导多能干细胞分化为神经元，可以将神经相关基因导入到细胞中，如神经生长因子。
然而，基因转导法可能引发基因突变或不受控制的基因表达，从而导致不可预测的后果。
除了化学诱导和基因转导法，还有一种新兴的细胞诱导分化方法是体外模拟法。
这种方法通过模拟胚胎发育中的微环境，如松弛力、机械刺激等，来诱导细胞分化。
体外模拟法可以通过调节培养基的成分，如细胞外基质、生理条件等，以及应用一些外部机械刺激装置，如牵拉力装置、压力装置等来实现。
例如，要诱导多能干细胞分化为心脏细胞，可以在培养基中添加心肌发育所需的生长因子，同时施加适当的机械刺激。
体外模拟法具有操作简单、效率较高等优点，但其分化效果受多种因素影响，如培养条件、细胞外基质等。
细胞诱导分化方法的选择应根据具体研究目的和细胞类型来确定。
不同的方法有不同的优缺点，研究人员应结合实际情况进行选择。
此外，细胞诱导分化仍然存在许多挑战，如诱导效率提高、稳定性改善等，研究人员需要在不断探索中完善和优化这些方法。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
细胞分化实验报告一、实验目的本次细胞分化实验旨在深入了解细胞分化的过程、机制以及影响因素，通过实际操作和观察，掌握细胞分化的基本特征和规律。
二、实验原理细胞分化是指同一来源的细胞在形态、结构和功能上发生稳定性差异的过程。
在细胞分化过程中，基因的选择性表达起着关键作用，导致不同细胞产生特定的蛋白质，从而表现出不同的特征。
三、实验材料与方法（一）实验材料1、小鼠胚胎干细胞2、细胞培养基（含血清、生长因子等）3、诱导分化试剂（如维甲酸等）4、显微镜5、细胞培养箱（二）实验方法1、细胞培养将小鼠胚胎干细胞接种在培养皿中，加入适量的细胞培养基，置于细胞培养箱中培养，定期更换培养基，保持细胞的良好生长状态。
2、诱导分化当细胞生长至一定密度时，加入诱导分化试剂，继续培养，观察细胞的形态和生长情况。
3、观察与分析在不同时间点，使用显微镜观察细胞的形态变化，如细胞的大小、形状、细胞器的分布等，并通过免疫荧光染色等方法检测特定蛋白质的表达，以确定细胞的分化方向和程度。
四、实验结果（一）细胞形态变化在诱导分化后的第 1 天，细胞形态开始发生轻微变化，细胞体积略有缩小。
随着时间的推移，细胞逐渐变得扁平，呈现出多边形的形态。
（二）蛋白质表达变化通过免疫荧光染色检测发现，在未分化的胚胎干细胞中，某些干细胞标志物（如 Oct4、Sox2 等）高表达。
而在诱导分化后，这些标志物的表达逐渐降低，同时特定分化细胞的标志物（如神经细胞的Nestin、肌肉细胞的 MyoD 等）开始出现并逐渐增加。
（三）细胞功能变化进一步的实验检测发现，分化后的细胞具有相应分化类型细胞的功能特征。
例如，神经细胞分化后能够产生动作电位，肌肉细胞分化后能够收缩。
五、结果分析与讨论（一）细胞分化的启动与进程实验结果表明，诱导分化试剂能够有效地启动细胞分化过程。
在分化的早期，细胞形态和蛋白质表达的变化相对较缓慢，随着时间的推移，变化逐渐明显，这表明细胞分化是一个逐渐进行的过程，需要一定的时间来完成基因表达的调整和细胞结构与功能的重塑。
第二章精子和卵子发生（spermatogenesis and oogenesis）在许多动物，如昆虫、蛔虫以及脊椎动物中，有在早期即与体细胞分开的，区分明显的生殖细胞。
在其他几个动物门（以及整个植物界），尚没有建立这种生殖细胞与体细胞的区分。
在这些物种中，包括腔肠动物（cnidarians）、扁虫类动物（flatworms）和被囊类动物（tunicates），即使是在成体中体细胞也可以很容易地变为生殖细胞。
许多无脊椎动物门的游动孢子，芽等都被证实其体细胞具有产生出新个体的能力。
生殖细胞（germ cell, reproductive cell）是行有性生殖的多细胞生物体内承担繁殖后代任务的细胞的总称，包括从原始生殖细胞到最终分化的精子和卵子。
生殖细胞是个体发生的基础。
此术语由A 恩勒和K 普兰特尔于1897年提出以与体细胞分开。
体细胞最终都会死亡，只有生殖细胞有延续至下一代的机会。
物种主要靠生殖细胞延续和繁衍。
长期的自然选择使每一物种的结构都为其生殖细胞的存活提供最好的条件。
进行有性生殖的高等生物，必须经历生殖细胞发生，产生出称为配子（gamete）的精子和卵子才能实现世代交替。
生殖细胞发生也称为配子发生（gametogenesis），是精子和卵子形成的过程。
在那些生殖细胞在发育早期即与体细胞分开而建立起了生殖细胞系的有机体中，生殖细胞不是由性腺本身产生的。
相反，生殖细胞的前体细胞，称为原生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）是在其他地方产生后迁移到发育中的性腺中的。
生殖细胞发生包括（1）原生殖细胞的形成和迁移到将形成性腺的生殖嵴中；（2）性别的决定与分化；（3）精子和卵子的发生等事件。
在此我们先讨论精子和卵子的发生，到胚胎发育和器官发生时再讨论原生殖细胞的形成与迁移以及性别的决定和分化。
第一节：精子发生（spermatogenesis）精子发生的启动精子发生就是从原生殖细胞产生成熟精子的过程。
新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细胞（作者： _________ 单位：___________ 邮编： ___________ ）作者：毕聪明，王珅，王军，费东亮，肖银霞【摘要】目的探讨小鼠精原干细胞体外诱导分化精子样细胞的可行性。
方法以7~8日龄小鼠睾丸为材料，采用小鼠睾丸支持细胞作为饲养层，应用维甲酸诱导、成年小鼠睾丸组织液诱导以及低温诱导精原干细胞分化，应用流式细胞仪分析诱导精子样细胞的染色体倍性。
采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞，观察受精卵的发育状况。
结果三种方法诱导精子样细胞比例分别为5.9% 1.6%、0.35%;流式细胞仪分析维甲酸诱导单倍体比率为19.3%; 诱导精子样细胞能激活卵母细胞，囊胚发育率20.36%。
结论新生小鼠精原干细胞体外可以诱导分化为精子样细胞，并具有激活卵母细胞的能力。
【关键词】精原干细胞分化单倍体小鼠Abstract: Objective To discuss the possibility of SSCs ofNewly-born mice in due ing the differe ntiat ing Sperm-like cells. Methods Taking the testis of male mice of 7~8 days for material andadopti ng the testis of mice , SSCs differe ntiat ing wereinduced by using retinoic acid, tissue fluid of adult mice andlow temperature. Flow cytometry was used to analyse the ploidy of chromosome inducing sperm-like cells. Microinjection was used to inject the sperm-like cells into oocytes and enucleate oocytes to observe the development situation of zygotes. Results The proportions of sperm-like cells induced by the three methods were 5.9%,1.6%,0.35% respectively. The rate of Flow cytometry to an alyse reti noic acid haploid is19.3% .The sperm-like cells achieved could activate bovine oocytes by sperm injecti on (ICSI), and the developme nt rate of blastosphere was 20.36%. Con clusi ons SSCs of n ewly -born mice can be induced and differentiated into sperm-like cells and are also capable of activati ng oocytes.Key words:SSCs; differe ntiat ing; haploid; mice在生精过程中，原始生殖细胞在胚胎期迁移到生殖嵴，经有丝分裂，迅速增殖形成精原干细胞(spermatogoial stem cells ，SSCs)，然后进一步形成精原细胞。
吴应积等］1］利用曲细精管体外共培养法长期培养精原干细胞自分化为精子样细胞，另外应用外源基因修饰的雄性生殖细胞系或青春期的精原干细胞也可分化出精子样细胞］2 -5］，通过体内移植使无内源性精子的动物产生精子。
但在体外研究SSCs诱导精子的很少，某些雄性性原细胞可以直接分化成精原细胞:6],这提示具有一少部分雄性性原细胞维持在干细胞状态。
本实验通过体外诱导新生小鼠SSCs分化为精子样细胞，探讨不同诱导方法的诱导效率；采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞，探讨其体外重构胚的发育能力，为SSCs体外分化研究打下基础。
1材料与方法1.1动物与材料1.1.1实验动物清洁级7〜8日龄雄性昆明乳鼠(辽宁医学院实验动物中心提供)。
1.1.2 材料碘化丙锭(propidium iodide ，PI )维甲酸(retinoic acid ，RA)、EGF(epidermal growth factor )、二氢睾酮(dihydrotestosterone )、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone)均为SIGMA公司产品。
1.1.3培养液的配制A基础培养液DMEM+10%BS培养液+6 mM谷氨酰胺+0.5 mM 丙酮酸钠+0.1%非必需氨基酸+10 n g/mL EGF+10 ng/mL类胰岛素样生长因子+500 ng/mL促卵泡生成素+133 mIU人生长激素+ 5 mg/mL胰岛素+5 mg/mL转铁蛋白+5 mM维生素A+ 0.1 mM视黄醛+ 0.1 mM睾酮+0.1 mM二氢睾酮+0.01%核苷+0.5%青霉素。
B条件培养液基础培养液+30%成年小鼠睾丸组织浸提液。
1.2方法1.2.1 SSCs的获取采用组合酶消化法分离SSCs采用支持细胞和SSCs共培养的方法培养，接种密度为1.0 X 105/mL,每周换液体2次。
1.2.2 SSCs的诱导A. RA诱导原代培养用基础培养液，添加10-5 mol/L RA处理48 h，培养4 d，更换为基础培养液，37 C培养，定时观察细胞生长状况，显微镜观察照相。
B. 条件培养液诱导原代培养用基础培养液培养，3 d换上条件培养液（50%细胞基础培养液+50%睾丸组织浸提液培养液），37 C培养，每2〜3 d半量换液1次，定时观察细胞生长状况，显微镜观察照相。
C. 低温培养诱导原代培养用基础培养液培养，37.8 C培养3 d，然后34.8 C继续培养，每2〜3 d半量换液1次，定时观察细胞生长状况，显微镜观察照相。
123新生小鼠SSCs向精子样细胞诱导分化检测A. 流式细胞仪分选诱导细胞及DNA倍性分析根据细胞核DNA含量，利用在碘化丙啶(PI)染色区分RA诱导体系中的细胞群［7, 8］。
B. 卵母细胞胞浆内授精(intracytoplasmic sperm injection , ICSI)试验用浓度为0.2%的透明质酸酶消化卵丘，去卵丘后选择有第一极体的成熟卵母细胞进行ICSI。
对照组用支持细胞作供体细胞重构核移植胚胎和孤雌激活胚胎，显微镜下观察受精卵的发育状况。
C. RT-PCF分析利用RT-PCR佥测新分化的悬浮细胞PRM-2 TP1、TP2这三个单倍体的特异性标志基因，引物设计见表1。
PCR T 增采用94.8 °C 3 min，94.8 °C 1 min，57、58、59.8 C (TP2,PRM-2,TP1) 1 min，72.8 C 1 min。
用精子作阳性对照，成纤维细胞作阴性对照。
表1 RT-PCR引物靶基因(略)2结果2.1不同诱导方法结果采用三种方法诱导新生小鼠SSCs向单倍体分化，结果在不同时间内均能出现类似精子样细胞和形态较大的圆形细胞，体外诱导培养的新生小鼠SSCs可以形成具有尾巴的精子样结构细胞，不同方法诱导产生具有尾巴样结构的细胞的时间和比例有一定差异（表2）。
表2不同方法诱导新生小鼠SSCs形成精子样细胞比例（略）表中不同肩标代表不同处理间经方差分析比较差异显著（P V 0.05）2.2诱导精子样细胞培养特性2.2.1 RA诱导SSCs与支持细胞共培养，接种后2〜3 h支持细胞开始贴壁，12 h完全贴壁并伸出短伪足，SSCs 24 h后贴于支持细胞表面，但不牢固，轻轻吹打有SSCs游离出来，SSCs开始细胞呈圆形或椭圆形，RA诱导后培养至4 d，许多具有单突起的细胞贴于细胞层上或悬浮于培养液中，形态与具有尾巴的精子细胞相似，其细胞体形态椭圆形、三角形、圆形和梭形。
圆形细胞体较小，尾巴较短，这种形状的细胞相对较少（图1A）;椭圆圆形细胞具有单鞭毛或另一端有突起细胞体较大，尾巴细长（图1B）,而梭形细胞多出现双突起（图1C），培养7 d，精子样细胞和圆形细胞增多（图1D）。
2.2.2条件培养液诱导原代培养用基础培养液培养，支持细胞能迅速贴壁，SSCs贴附于支持细胞表面，4 d后形成克隆突起明显的克隆，加入条件培养液后 3 d，在SSCs集落周围，出现圆形或椭圆形的细胞，细胞较SSCs大,部分细胞悬浮，游离的精子很少（图1巳，贴壁的圆形细胞摇动培养皿或轻轻吹打即脱离支持细胞。
圆形的细胞较多，但具有精子样形态的细胞很少。
223低温培养诱导用基础培养液37.8 C培养3 d , 有克隆产生，转为34.8 C继续培养6 d后在集落周围有少量散在的圆形细胞，个别细胞有鞭毛（图1F）。
2.3流式细胞仪分拣精子样细胞收集上述诱导产生的悬浮细胞，以未定向诱导细胞作为对照，处理用PI荧光染料染色，流式细胞仪分拣见图2。
细胞进行流式细胞仪分析显示，诱导细胞明显的3类细胞群，在DNA直方图出现了明显三个峰中，包括单倍体细胞峰、二倍体细胞峰和四倍体细胞峰，也可见细胞染色体碎片形成其他小峰。
而对照组小鼠成纤维细胞出现2个细胞类群，对照显示出现的2峰为二倍体细胞峰和四倍体细胞峰，对照精子组出现一个细胞峰位单倍体峰，因此认为所收集的悬浮细胞中含有单倍体细胞，约占所有悬浮细胞（检测细胞）总数的19.3%。
2.4卵母细胞体外显微授精试验将具有精子样结构的细胞，注入成熟培养24 h未被激获的小鼠卵母细胞的胞质中，对照组注射支持细胞和孤雌胚胎，胚胎发育情况结果如表3。
表3小鼠卵母细胞体外显微授精胚胎发育结果（略）表中一列中不同肩标表示经方差分析差异显著（P0.05）表3显示，诱导精子样细胞可以使小鼠卵母细胞卵裂并进一步发育为囊胚，其卵裂率、8/16细胞胚比率高于支持细胞重构胚的卵裂率（P0.05），诱导精子样细胞ICSI形成囊胚的能力高于支持细胞核移植重构胚和孤雌激活胚（P0.05），图3。
2.5 RT-PCR 分析经过RT-PCF分析，诱导的精子样细胞表达PRM-2（282bp）、TP1（175bp）、TP2（ 152bp）这三个单倍体的特异性标志基因，见图4。
3讨论SSCs来源于原始生殖细胞，来源于胚胎的生殖干细胞可以在体外，经RA诱导形成SSCs体内移植后，形成的SSCs可在无内源精原干细胞的曲细精管种克隆增殖，直接参与精子发生的减数分裂过程。
