小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol

iPS细胞制备技术随着对iPS细胞重编程机制研究的不断深入，iPS细胞的制备体系不断完善，目前iPS细胞的制备方法多种多样，但以Yamanaka的“四因子”诱导体系较为经典，本书在此简要阐述此制备方法。

一、小鼠iPS细胞制备【实验步骤】1.建立小鼠胎儿成纤维细胞系（1）脱颈处死13.5天孕鼠，分离出子宫并用PBS浸洗。

（2）用手术镊将胚胎从胎盘和周围膜系组织分离开，去除头、性腺和内脏组织。

（3）将胚胎转移至一个新100mm皿进行PBS清洗，剪刀剪碎组织，放于含有0.1%胰酶/0.1mmol/L EDTA溶液的50ml离心管，于37℃消化20分钟，重新加酶，再次消化。

（4）加入等体积FP溶液（含10%FBS，50U&50mg/ml青霉素和链霉素的DMEM）中止消化，吹打数次以帮助组织破碎。

（5）室温（20～25℃）放置5分钟以沉降大块组织，取上悬液体于离心管进行离心，1200r/min×5min，弃上悬液并用新鲜液体重悬。

（6）计数细胞，并调节细胞浓度至1×106/ml。

一般约1×107细胞/胚胎，1×107细胞/100mm皿于37℃，5%CO2培养24小时。

（7）次日，PBS清洗去除未贴壁细胞，待细胞铺满皿底，换掉FP液，用PBS清洗一次，1ml 0.05%胰酶/0.53mmol/L EDTA消化5分钟，加入9ml FP液并吹打成细胞悬液，传代按1∶4进行（用于iPS 诱导的MEFs代次最好选用3代以内）。

2.饲养层细胞准备（1）复苏 SNL 细胞1）由液氮罐中取出SNL冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，并晃动冻存管直到融化。

2）乙醇擦拭冻存管盖及冻存管壁，将管内冻存悬液转移入预先准备的SNL液体中，800r/min×5min，弃去上液。

3）重新加入10ml SNL液体重悬细胞，转入明胶铺被的100mm皿中，于37℃，5%CO2培养至细胞80%～90%汇合。

以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。

不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。

一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。

为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。

建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。

将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。

下文中暂不提及Feed细胞。

Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。

分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。

通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。

贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。

然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是一类在小鼠早期胚胎内分化产生的多能干细胞。

培养和研究ESC可以为了解细胞发育和分化提供重要的实验材料。

下面将为您介绍小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤。

一、准备实验所需材料和器械：1.小鼠胚胎干细胞系（ES细胞系）。

2.ESC培养基：一般使用含有LIF（鼠胚性干细胞生长因子）的培养基，如DMEM/F12或DMEM培养基，添加血清、LIF等。

3.ESC传代培养基：与ESC培养基相同，但不含LIF。

4.ESC学习培养基：免LIF和血清的无血清培养基，可以用于学习ES细胞的分化能力。

5. ESC传递板（T25细胞培养板、10 cm细胞培养板等）。

6.培养皿：培养皿的选择可以根据不同的实验目的选用，如离体实验可以选择培养皿或培养碟等。

7.显微镜：用于观察和鉴定细胞形态。

8.细胞培养箱：用于多肽瓶、培养皿等细胞培养。

9.无菌注射器、移液器、离心管等常见实验器材，以及媒液和试剂。

二、实验步骤：1.将小鼠胚胎干细胞系解冻至细胞存储液解冻的方法，迅速转移到预先加热培养皿中。

添加完整的ESC培养基，将细胞孵育在37℃、5%CO2的培养箱中。

2.每两天更换一次ESC培养基，观察细胞的形态和生长情况。

当细胞接近80%的密度时，可以进行传代。

3.小鼠胚胎干细胞的传代通常采用机械法和酶解法两种方法。

机械法是直接使用离心管头吸吸细胞，然后用超声波吹散细胞，最后转入新的培养皿中。

酶解法则是先用胰酶等酶溶解细胞，形成单细胞悬液，然后接种入新的培养皿中。

4.传代完成后，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，并定期更换培养基。

5.ESC的分化实验通常采用去除LIF和血清的无血清培养基。

将小鼠胚胎干细胞移到含有学习培养基的培养皿中，观察和记录细胞的分化情况。

6.对于特定的实验要求，如体外器官培养、离体实验等，可以将小鼠胚胎干细胞移至特定的培养皿或装置中，进行相关实验。

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。

不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。

一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。

为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。

建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。

将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。

下文中暂不提及Feed细胞。

Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。

分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。

通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。

贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。

然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。

借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。

• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。

e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。

f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。

继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。

b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。

c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。

-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。

-洗手并戴上合适的培养操作手套。

2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。

-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。

-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。

3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。

-用细胞计数计算细胞的数目。

-计算细胞的分裂倍增时间。

4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。

-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。

-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。

5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。

- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。

-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。

6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。

-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。

-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。

-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。

7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。

-检查细胞的形态和活力。

-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。

-控制培养基和细胞的污染。

以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。

为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。

细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。

借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。

• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。

e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。

f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。

继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。

b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。

c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。

我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。

细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。

一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。

具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。

二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。

1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。

2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。

3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。

5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。

弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。

6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。

1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。

7. 形成胚状体需要4天时间。

在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。

这一天被认为是第2步和第3步的分界。

三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。

2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。

3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。

4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。

当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。

《小鼠新型胚胎干细胞在不同培养条件下的转换》篇一一、引言小鼠胚胎干细胞（mESCs）作为生物学研究的重要工具，具有巨大的潜力和应用前景。

近年来，随着科研技术的不断进步，新型的mESCs培养条件和方法不断涌现，为干细胞的研究和应用提供了新的可能。

本文将探讨小鼠新型胚胎干细胞在不同培养条件下的转换过程及其影响。

二、小鼠新型胚胎干细胞简介小鼠新型胚胎干细胞（mESCs）是一种具有自我更新能力和多潜能性的细胞，可以分化为各种组织和器官的细胞类型。

由于其独特的生物学特性，mESCs在再生医学、药物研发、疾病模型构建等领域具有广泛的应用价值。

三、不同培养条件下的转换过程1. 传统培养条件下的转换传统培养条件下，mESCs通常在含有特定生长因子和血清的培养基中生长。

这些生长因子和血清为细胞提供了必要的营养和生长信号，使细胞得以维持其多潜能性和自我更新能力。

然而，这种培养方法存在一些局限性，如对培养基成分的依赖性较高，难以实现大规模的细胞培养等。

2. 新型培养条件下的转换随着科研技术的进步，新型的培养条件和方法不断涌现。

这些方法主要包括无血清培养、无动物成分培养、三维培养等。

在这些新型培养条件下，mESCs的转换过程发生了显著的变化。

无血清培养可以降低对血清成分的依赖性，提高细胞的纯度和稳定性；无动物成分培养可以避免动物源性污染和疾病传播的风险；三维培养则可以提高细胞的生长速度和分化效率。

四、不同培养条件对mESCs的影响1. 生长速度和分化效率不同培养条件对mESCs的生长速度和分化效率有着显著的影响。

在新型培养条件下，mESCs的生长速度通常较快，分化效率也较高。

这主要得益于新型培养条件下的营养供应和生长信号更加均衡和稳定，有利于细胞的生长和分化。

2. 细胞纯度和稳定性新型培养条件还可以提高mESCs的纯度和稳定性。

例如，无血清培养可以降低血清中的杂质和污染物的含量，从而减少对细胞的干扰；无动物成分培养则可以避免动物源性污染和疾病传播的风险，提高细胞的纯度和安全性。

胚胎干细胞和iPS细胞的分化分子机制生物科技领域中，胚胎干细胞和iPS细胞是两个备受瞩目的研究方向。

这两者都具有广泛的分化潜能，但胚胎干细胞存在伦理争议，而iPS细胞相对较为安全。

分子机制的研究对于胚胎干细胞和iPS细胞的应用与开发有着重要的作用。

一、胚胎干细胞分化分子机制胚胎干细胞可以分化为多种类型的细胞，因此它们的分化分子机制十分重要。

研究发现，胚胎干细胞分化主要受到多种因素的调控，包括基因表达、细胞因子、激素和糖基化等。

其中，基因表达调控是主要的分子机制之一。

胚胎干细胞的基因调控网络十分复杂，包括多个信号转导通路和转录因子。

Wnt、BMP、Nodal等通路以及Nanog、Oct4、Sox2等转录因子都可以调控胚胎干细胞的分化和自我更新。

研究表明，这些因子之间相互作用，形成了一个动态平衡状态，才能维持胚胎干细胞的稳定性和多向分化潜能。

在特定的时期或环境下，这些因子的调控方式会发生改变，从而导致胚胎干细胞向某个特定细胞系的分化。

胚胎干细胞还对外界的生长因子与核受体激素作出反应，如FGF、Activin、LIF和Retinoic Acid等。

这些生长因子可以通过信号通路间接或直接调节胚胎干细胞的分化。

在内部，胚胎干细胞通过众多的库欣（Kuxin）蛋白质及其下游基因家族调控。

库欣是一个典型的重塑蛋白质，在细胞分化、形态学发育和肿瘤发展等过程中发挥着重要作用。

总之，胚胎干细胞的分化分子机制极其复杂，涉及多个通路和因子的相互作用及其动态平衡，其研究将对未来的干细胞治疗和再生医学有着至关重要的意义。

二、iPS细胞分化分子机制与胚胎干细胞相比，iPS细胞的来源更加安全。

iPS细胞通过基因重编程，使人体成熟细胞回到干细胞状态。

虽然iPS细胞的分化分子机制与胚胎干细胞有着相似之处，但也存在一定的差异。

目前，对于iPS细胞分化的控制主要是通过在培养液中添加不同的生长因子、生物纳米材料和小分子化合物等物质来实现的。