免疫组织化学技术ppt优秀课件

荧光显微镜或电子显微镜观察。
抗体的标记
为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记， 利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大， 并转换成可见的荧光或呈现出颜色。
免疫组化常用标记物
① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（FITC）呈绿色荧光；四乙基罗达明（rho—damine RB200） -橙红色荧光。
1.取材：从动物或者患者取下组织材料。 2.固定：将所需要的材料进行固定，使得组织内蛋白质迅速凝 固液（甲醛），细胞内结构和成分不再发生改变。 3.脱水：固定后的组织内进行脱水，以便石蜡的浸入。脱水用 梯度酒精进行脱水。（自动脱水机） 4.浸蜡与包埋：组织放置刚过熔点的石蜡中，然后进行包埋， 将透明后浸了蜡的组织块放到盛有熔化石蜡的模块中，并使之 凝固成蜡块。（包埋机） 5.切片与贴片：（ 组织切片机） （1）切片 （2）展片 （3）贴片
② 酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。 ③ 生物素：（Biotin） ④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
染色方法
1.直接法
用标记物（荧光素，酶等）直接标记在一抗上，标记抗体与抗原 结合。在通过显色或者荧光激发后在显微镜下观察；
2.间接法
免疫组化染色（石蜡切片）
1.烤片 65℃ 1-2h 2.常规二甲苯脱蜡，和梯度酒精水化 3.灭活内源性过氧化物酶 4.抗原修复 5.封闭 6.一抗过夜 7.加入有标记的二抗 8.显色 9.苏木素复染 10.常规梯度酒精脱水，透明，干燥 ，封片。
免疫组化应用
➢在临床上的应用 ➢在科研中的应用
在临床上的应用：
荧光素，酶标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。
3.非标记Ab桥法

26
27
28
未封闭内源性过氧化物酶
29
30
胃固有膜腺体
31
3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
32
五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
2
Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
58
59
60
61
62
63
64
抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
12
（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
Vector

➢荧光标记:荧光素标记抗体
•异 硫 氰 酸 荧 光 素 ( Fluorescien isothioyarale, FITC)520－530nm
•四甲基异硫氰酸罗达明(Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC) 620nm
•四 乙 基 罗 达 明 ( Teraethyle rhodamine B200, RB200)590－600nm
⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min;
⑧用过氧化物酶基质液(DAB基质液)显色5－15min。 在光镜下观察。
⑨自来水冲洗,苏木素浅染,自来水冲洗还蓝, 梯度 酒精脱水,干燥,二甲苯透明,中性树胶封固。
免疫组化常见问题的处理: ✓组织材料的处理:
固定液为:10%中性福尔马林液; 4%多聚甲醛磷酸缓冲液(PH7、4);
免疫组织化学的结果判断应特别严谨,阳性细胞 的染色分布有三种类型:胞浆型、细胞核型与细胞膜 表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度,并 以此作为定性、定量与定位的依据。
阳性细胞的染色常定位于细胞,并于阴性细胞间有 明显间隔,而非特异性染色常不限于单个细胞,而是累 及一片细胞,两者可显著区别。
阳性细胞的染色特征: ①阳性细胞的染色分布有三种:
AP与不同的底物(萘酚As-Mx、快蓝、快红)作用, 可形成不同颜色的终产物。用新品红(New fuchsine) 显色,可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀,不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,)
HRP:底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺,产生棕色 沉淀,不溶于有机溶剂,不褪色。
以LSAB法为例简单介绍染色步骤: ①石蜡切片脱蜡－水; ②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min; ③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清,室温孵育 5min; ④加特异性一抗,370C孵育30－60min,or 40C过夜; ⑤加20ul生物素标记的第二抗体,370C ,30min;

切片：
石蜡切片：
(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52－60℃烤片18h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年
冰冻切片：
(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理
24h，冰冻切片。
(2)冰冻切片后需凉干后立即固定
(3)冰冻切片固定后-80℃保存备用
细胞爬片制作
将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养 瓶或六孔板内。
待细胞生长达到60％以上后取出玻片。 用4%的多聚甲醛固定2h以上。 可加甘油封存置于零下20度保存。
细胞涂片制作
离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗 2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。
吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴 至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。
固定时间：
固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温 度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固 定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。
组织石蜡包埋
大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～
120min，95％醇Ⅰ 2h，95％乙醇Ⅱ 2h，95％乙醇 Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30 ～60min，无水乙醇Ⅱ30～ 60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min 石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。
进 入 夏 天 ，少 不了一 个热字 当头， 电扇空 调陆续 登场， 每逢此 时，总 会想起 那 一 把 蒲 扇 。蒲扇 ，是记 忆中的 农村， 夏季经 常用的 一件物 品。 记 忆 中 的故 乡 ， 每 逢 进 入夏天 ，集市 上最常 见的便 是蒲扇 、凉席 ，不论 男女老 少，个 个手持 一 把 ， 忽 闪 忽闪个 不停， 嘴里叨 叨着“ 怎么这 么热” ，于是 三五成 群，聚 在大树 下 ， 或 站 着 ，或随 即坐在 石头上 ，手持 那把扇 子，边 唠嗑边 乘凉。 孩子们 却在周 围 跑 跑 跳 跳 ，热得 满头大 汗，不 时听到 “强子 ，别跑 了，快 来我给 你扇扇 ”。孩 子 们 才 不 听 这一套 ，跑个 没完， 直到累 气喘吁 吁，这 才一跑 一踮地 围过了 ，这时 母 亲总是 ，好似 生气的 样子， 边扇边 训，“ 你看热 的，跑 什么？ ”此时 这把蒲 扇， 是 那 么 凉 快 ，那么 的温馨 幸福， 有母亲 的味道 ！ 蒲 扇 是 中 国传 统工艺 品，在 我 国 已 有 三 千年多 年的历 史。取 材于棕 榈树， 制作简 单，方 便携带 ，且蒲 扇的表 面 光 滑 ， 因 而，古 人常会 在上面 作画。 古有棕 扇、葵 扇、蒲 扇、蕉 扇诸名 ，实即 今 日 的 蒲 扇 ，江浙 称之为 芭蕉扇 。六七 十年代 ，人们 最常用 的就是 这种， 似圆非 圆 ， 轻 巧 又 便宜的 蒲扇。 蒲 扇 流 传 至今， 我的记 忆中， 它跨越 了半个 世纪， 也 走 过 了 我 们的半 个人生 的轨迹 ，携带 着特有 的念想 ，一年 年，一 天天， 流向长