详解硝基呋喃类药物代谢物残留量检测
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超标。 • 2006年，宁波慈溪某进出口公司的27.5吨冻烤鳗由于检出AOZ而遭日本方面退货，
损失高达五十多万美元。 • 2006年11月的“多宝鱼事件”，由于养殖厂在养殖过程中违规添加大量抗生素，
让中国的多宝鱼产业深受影响，
（3） 硝基呋喃类药物管理——禁用情况
• 美国和日本：分别在1975年、1977年禁止呋喃唑酮作为医药使用 • 美国：1993年禁止呋喃唑酮作为兽药，美国21CFR530.41中规定食源性动物禁止使用呋喃唑酮和呋喃
检测标准对比
2.2 方法原理
用盐酸水解样品中的蛋白结合态硝基呋喃代谢物，邻硝基苯甲醛过夜衍生，调节 pH值至中性后，用乙酸乙酯提取，浓缩吹干后，用流动相定容，正己烷净化除脂， 高效液相色谱/串联质谱测定，内标法定量。
硝基呋喃及其代谢物化学结构
硝基呋喃代谢物与邻硝基苯甲醛衍生反应过程
硝基呋喃代谢物与邻硝基苯甲醛衍生反应过程
Q1 SCAN模式， 观察M/Z 335，236，249，209及同位素内标峰， 通过调节fragment电压，使这几个峰最强，平均后确认小数点后数值，准确到0.1，例如249.1 。
100V 80V
120V
选择最高响应对应的碎裂电压值
140V
仪器条件优化
step2：以第一步测得值为母离子，做PRODUCT ION SCAN（MS2），调节CE等参数，使母， 子离子都具有一定强度，平滑后得到MS2谱，从各母离子中各选择2个最高的子离子，准确到0.1， 分别为
保证色谱峰具有足够的数据点数
获得最佳灵敏度、重现性
设置Time segment 定量离子分配更长的Dwell time
仪器条件优化
MRM监测条件
化合物 Compound
母离子 Precursor Ion
AMOZ
335.0
D5-AMOZ
340.2
SEM
208.9
C13-SEM
212.0
AHD
249.2
离子的分离、分析、检测 数据采集与处理
ESI的特点
ESI是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解； 适合于分析极性强的大分子有机化合物，乳蛋白质、肽、糖等，在电离的过程中容易形成多电荷离子
02
检测方法
2.1 检测标准
硝基呋喃残留量分析方法国内外主要采用液质联用法进行测定。我国目前有多项有关 硝基呋喃残留量测定的国家和行业标准。
（2）硝基呋喃类药物性质——毒理学资料
毒性物质
呋喃西林毒性最大，呋喃唑酮毒性最小(为呋喃西林的1/10)
致癌物质
FDA指出呋喃唑酮在动物体内降解非常迅速，具有致癌性 呋喃唑酮具中等强度致癌性、呋喃它酮具有强致癌性 呋喃唑酮可诱发乳腺癌和支气管癌
诱导机体突变物质
硝基呋喃类化合物是直接诱变剂 呋喃唑酮是一种强致突变剂 呋喃西林诱变性与硝基相连碳原子的电子密度有关
制成浓度为0.01mg/L的混合标准工作溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1周。
3.1 试剂与材料
内标物质
（19）3-氨基-2恶唑酮的内标物，D4-AOZ；5-吗啉甲基-3-氨基-2恶唑烷基酮的内标物，D5-AMOZ；1-氨 基-乙内酰脲的内标物，13C-AHD；氨基脲的内标物，13C15N-SEM，纯度≥99%
呋喃西林
分子式为 C6H6N4O4，CAS 号为 59-87-0，相对分子质量为 198.14。呋喃西林为黄色结晶粉末，味苦，无 臭，遇光色渐变深，几乎不溶于水。体内代谢产物主要为氨基脲（SEM）
呋喃它酮
分子式为 C13H16N4O6，CAS 号为 139-91-3，相对分子质量为 324.29。呋喃它酮为黄色结晶固体，难溶 于水。体内代谢产物主要为 5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮（AMOZ）
奶和蜂蜜
从原始样品取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器做为试样， 密封，并标明标记。将试样置于4℃冷藏避光保存。
3.4 检测流程
提取
3.4 检测流程
净化
仪器条件优化
step1：配制衍生化后的硝基呋喃代谢物标准溶液，乙腈/水体系，浓度10ppm 确认仪器已经校准，气体、电压工作正常。 测试条件：离子化方式: ESI+
（20）内标储备液：准确称取适量内标物质（精确至0.0001g），用乙腈溶解，配制成浓度为100mg/L的标准 储备溶液，-18℃冷冻避光保存，有效期3个月。
（21）中间内标标准溶液：准确移取中间内标标准溶液各0.1ml于10ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成 浓度为0.01mg/L的混合内标标准溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1周。
03
试验程序
3.1 试剂与材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
试剂
（1）甲醇：高效液相色谱级（HPLC）。 （2）乙腈：高效液相色谱级（HPLC） 。 （3）乙酸乙酯：高效液相色谱级（HPLC） 。 （4）正己烷：高效液相色谱级（HPLC） 。 （5）甲酸：高效液相色谱级（HPLC） （6）氢氧化钠。 （7）浓盐酸。 （8）邻硝基苯甲醛，三水磷酸钾，乙酸铵。
动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方 法LC-MS/MS（GB/T21311-2007）
Contents
一、背景资料
二、检测方法
目 三、实验程序
录 四、数据分析
五、讨论
01
背景资料
1.1硝基呋喃类药物概述
定义
硝基呋喃类药物（nitrofurans）是一种广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等 病原体均有杀灭作用。
呋喃它酮（AMOZ）
呋喃唑酮（AOZ）呋喃唑酮（AZ）内标呋喃妥因（AHD）
呋喃妥因（AHD）内标
呋喃西林（SEM）
呋喃西林（SEM）内标
选择最高响应对应的碰撞能量值
每个化合物一般选择两个强度最高的子离子，分 别作定性离子与定量离子
仪器条件优化
step3：以第二步选定的离子对，例如335.2/262.0 等，做MRM SCAN ，调整驻留时间值使每 个物质峰采集有足够的数据点，强的离子对可短些，弱的可长些。 手动优化SOURCE/GAS项下面的参数值。得到优化好的质谱条件
妥因。
• 欧盟：1995年禁止使用呋喃唑酮，欧盟指令96/23/EC：硝基呋喃类药物是A类禁用药；EEC2377/90
规定动物源食品中不得检出硝基呋喃类药物
• 韩国：2002年版《食品公典》规定猪肉中呋喃唑酮不得检出。
• 中国：2002年4月发布的中华人民共和国农业部公告（第193号）——所有硝基呋喃类药物在所有食品动 物中的使用都被严令禁止，同年农业部规定，该药在所有动物性食品中严禁检出。2003年水产品中硝基 呋喃代谢物被纳入残留监控计划
3.1 试剂与材料
试验溶液
（9）0.2mol/L盐酸溶液：准确量取17mL浓盐酸，用水定容至1L， （10）2.0mol/L氢氧化钠溶液：准确称取80g氢氧化钠，用水溶解并定容至1L。 （11）0.1mol/L邻硝基苯甲醛溶液：准确称取1.5g邻硝基甲醛，用甲醇溶解并定容至100mL。 （12）0.3mol/L磷酸钾溶液：准确称取79.893g三水磷酸钾，用水溶解并定容至1L。 （13）乙腈饱和的正己烷：量取正己烷80mL于100mL分液漏斗中，加入适量乙腈后，剧烈振摇，待分配平 衡后，弃去乙腈层即得。
呋喃它酮AMOZ： M/Z 291，262； 呋喃唑酮AOZ： M/Z 134，104； 呋喃妥因AHD： M/Z 134，104或178； 呋喃西林SEM： M/Z 192，166。
注意：母离子要采用Q1SCAN测得值，子离子采用PRODUCT ION SCAN测得值。典型MS2谱图 如下，如子离子与之不符合，则可能是标准品有问题。
内标物质
微孔滤膜：0.20μm有机相， 氮气：纯度≥99.999%； 氩气：纯度≥99.999%.
3.2 仪器和设备
（8）离心机：10000r/min。
（1）液相色谱/串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 （9）氮吹仪。
（2）组织捣碎机。
（10）漩涡混合器。
（3）分析天平：感量0.0001g，0.01g。
作用机理
主要作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢， 从而起抑菌作用。
广泛应用
因其抗菌谱广、杀菌能力强、耐药性好和价格低廉等优点，曾大量应用于由大肠杆菌或沙 门氏菌引起的家禽、家畜和水产等养殖动物的肠炎、疥疮和溃疡等疾病，也用作畜禽生长 促进剂
（2）硝基呋喃类药物——化学性质
（2）硝基呋喃类药物性质——代谢动力学
• 迅速代谢，半衰期几个小时内 • 以母体的形式迅速排泄 • 用14C-标记呋喃唑酮研究，残留物是
以同蛋白质结构转载存在其他硝基呋喃 类
（3）硝基呋喃类药物管理——残留检出
• 2002年3月：泰国、越南、印尼、印度、孟加拉，77个样中有16个样本含量超标； • 荷兰和英国水产品中检出； • 2005年，据日本检疫所的监测检查，我国的烤鳗被检出硝基呋喃类代谢物（AOZ）
1.2 液质联用分析技术
概念
质谱法是将样品离子化，变为气态离子混合物，然后利用不同离子在电场或磁场中运动行为的不同，把离子按 质荷比（M/Z）分离的分析技术，通过所得到的样品的质谱和相关信息，进行定性和定量分析
质谱分析的基本过程
用适当的方法使样品分子转变为气态离子，对于有机化合物，如果在离子化过程中接受了过多的能量，新生成 的分子离子（molecular ion）会进一步裂解，生成各种碎片离子(fragment ions).
C13-AHD
252.0
AOZ
236.1
D4-AOZ
240.0
子离子 Product Ion
损失高达五十多万美元。 • 2006年11月的“多宝鱼事件”，由于养殖厂在养殖过程中违规添加大量抗生素，
让中国的多宝鱼产业深受影响，
（3） 硝基呋喃类药物管理——禁用情况
• 美国和日本：分别在1975年、1977年禁止呋喃唑酮作为医药使用 • 美国：1993年禁止呋喃唑酮作为兽药，美国21CFR530.41中规定食源性动物禁止使用呋喃唑酮和呋喃
检测标准对比
2.2 方法原理
用盐酸水解样品中的蛋白结合态硝基呋喃代谢物，邻硝基苯甲醛过夜衍生，调节 pH值至中性后，用乙酸乙酯提取，浓缩吹干后，用流动相定容，正己烷净化除脂， 高效液相色谱/串联质谱测定，内标法定量。
硝基呋喃及其代谢物化学结构
硝基呋喃代谢物与邻硝基苯甲醛衍生反应过程
硝基呋喃代谢物与邻硝基苯甲醛衍生反应过程
Q1 SCAN模式， 观察M/Z 335，236，249，209及同位素内标峰， 通过调节fragment电压，使这几个峰最强，平均后确认小数点后数值，准确到0.1，例如249.1 。
100V 80V
120V
选择最高响应对应的碎裂电压值
140V
仪器条件优化
step2：以第一步测得值为母离子，做PRODUCT ION SCAN（MS2），调节CE等参数，使母， 子离子都具有一定强度，平滑后得到MS2谱，从各母离子中各选择2个最高的子离子，准确到0.1， 分别为
保证色谱峰具有足够的数据点数
获得最佳灵敏度、重现性
设置Time segment 定量离子分配更长的Dwell time
仪器条件优化
MRM监测条件
化合物 Compound
母离子 Precursor Ion
AMOZ
335.0
D5-AMOZ
340.2
SEM
208.9
C13-SEM
212.0
AHD
249.2
离子的分离、分析、检测 数据采集与处理
ESI的特点
ESI是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解； 适合于分析极性强的大分子有机化合物，乳蛋白质、肽、糖等，在电离的过程中容易形成多电荷离子
02
检测方法
2.1 检测标准
硝基呋喃残留量分析方法国内外主要采用液质联用法进行测定。我国目前有多项有关 硝基呋喃残留量测定的国家和行业标准。
（2）硝基呋喃类药物性质——毒理学资料
毒性物质
呋喃西林毒性最大，呋喃唑酮毒性最小(为呋喃西林的1/10)
致癌物质
FDA指出呋喃唑酮在动物体内降解非常迅速，具有致癌性 呋喃唑酮具中等强度致癌性、呋喃它酮具有强致癌性 呋喃唑酮可诱发乳腺癌和支气管癌
诱导机体突变物质
硝基呋喃类化合物是直接诱变剂 呋喃唑酮是一种强致突变剂 呋喃西林诱变性与硝基相连碳原子的电子密度有关
制成浓度为0.01mg/L的混合标准工作溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1周。
3.1 试剂与材料
内标物质
（19）3-氨基-2恶唑酮的内标物，D4-AOZ；5-吗啉甲基-3-氨基-2恶唑烷基酮的内标物，D5-AMOZ；1-氨 基-乙内酰脲的内标物，13C-AHD；氨基脲的内标物，13C15N-SEM，纯度≥99%
呋喃西林
分子式为 C6H6N4O4，CAS 号为 59-87-0，相对分子质量为 198.14。呋喃西林为黄色结晶粉末，味苦，无 臭，遇光色渐变深，几乎不溶于水。体内代谢产物主要为氨基脲（SEM）
呋喃它酮
分子式为 C13H16N4O6，CAS 号为 139-91-3，相对分子质量为 324.29。呋喃它酮为黄色结晶固体，难溶 于水。体内代谢产物主要为 5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮（AMOZ）
奶和蜂蜜
从原始样品取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器做为试样， 密封，并标明标记。将试样置于4℃冷藏避光保存。
3.4 检测流程
提取
3.4 检测流程
净化
仪器条件优化
step1：配制衍生化后的硝基呋喃代谢物标准溶液，乙腈/水体系，浓度10ppm 确认仪器已经校准，气体、电压工作正常。 测试条件：离子化方式: ESI+
（20）内标储备液：准确称取适量内标物质（精确至0.0001g），用乙腈溶解，配制成浓度为100mg/L的标准 储备溶液，-18℃冷冻避光保存，有效期3个月。
（21）中间内标标准溶液：准确移取中间内标标准溶液各0.1ml于10ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成 浓度为0.01mg/L的混合内标标准溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1周。
03
试验程序
3.1 试剂与材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
试剂
（1）甲醇：高效液相色谱级（HPLC）。 （2）乙腈：高效液相色谱级（HPLC） 。 （3）乙酸乙酯：高效液相色谱级（HPLC） 。 （4）正己烷：高效液相色谱级（HPLC） 。 （5）甲酸：高效液相色谱级（HPLC） （6）氢氧化钠。 （7）浓盐酸。 （8）邻硝基苯甲醛，三水磷酸钾，乙酸铵。
动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方 法LC-MS/MS（GB/T21311-2007）
Contents
一、背景资料
二、检测方法
目 三、实验程序
录 四、数据分析
五、讨论
01
背景资料
1.1硝基呋喃类药物概述
定义
硝基呋喃类药物（nitrofurans）是一种广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等 病原体均有杀灭作用。
呋喃它酮（AMOZ）
呋喃唑酮（AOZ）呋喃唑酮（AZ）内标呋喃妥因（AHD）
呋喃妥因（AHD）内标
呋喃西林（SEM）
呋喃西林（SEM）内标
选择最高响应对应的碰撞能量值
每个化合物一般选择两个强度最高的子离子，分 别作定性离子与定量离子
仪器条件优化
step3：以第二步选定的离子对，例如335.2/262.0 等，做MRM SCAN ，调整驻留时间值使每 个物质峰采集有足够的数据点，强的离子对可短些，弱的可长些。 手动优化SOURCE/GAS项下面的参数值。得到优化好的质谱条件
妥因。
• 欧盟：1995年禁止使用呋喃唑酮，欧盟指令96/23/EC：硝基呋喃类药物是A类禁用药；EEC2377/90
规定动物源食品中不得检出硝基呋喃类药物
• 韩国：2002年版《食品公典》规定猪肉中呋喃唑酮不得检出。
• 中国：2002年4月发布的中华人民共和国农业部公告（第193号）——所有硝基呋喃类药物在所有食品动 物中的使用都被严令禁止，同年农业部规定，该药在所有动物性食品中严禁检出。2003年水产品中硝基 呋喃代谢物被纳入残留监控计划
3.1 试剂与材料
试验溶液
（9）0.2mol/L盐酸溶液：准确量取17mL浓盐酸，用水定容至1L， （10）2.0mol/L氢氧化钠溶液：准确称取80g氢氧化钠，用水溶解并定容至1L。 （11）0.1mol/L邻硝基苯甲醛溶液：准确称取1.5g邻硝基甲醛，用甲醇溶解并定容至100mL。 （12）0.3mol/L磷酸钾溶液：准确称取79.893g三水磷酸钾，用水溶解并定容至1L。 （13）乙腈饱和的正己烷：量取正己烷80mL于100mL分液漏斗中，加入适量乙腈后，剧烈振摇，待分配平 衡后，弃去乙腈层即得。
呋喃它酮AMOZ： M/Z 291，262； 呋喃唑酮AOZ： M/Z 134，104； 呋喃妥因AHD： M/Z 134，104或178； 呋喃西林SEM： M/Z 192，166。
注意：母离子要采用Q1SCAN测得值，子离子采用PRODUCT ION SCAN测得值。典型MS2谱图 如下，如子离子与之不符合，则可能是标准品有问题。
内标物质
微孔滤膜：0.20μm有机相， 氮气：纯度≥99.999%； 氩气：纯度≥99.999%.
3.2 仪器和设备
（8）离心机：10000r/min。
（1）液相色谱/串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 （9）氮吹仪。
（2）组织捣碎机。
（10）漩涡混合器。
（3）分析天平：感量0.0001g，0.01g。
作用机理
主要作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢， 从而起抑菌作用。
广泛应用
因其抗菌谱广、杀菌能力强、耐药性好和价格低廉等优点，曾大量应用于由大肠杆菌或沙 门氏菌引起的家禽、家畜和水产等养殖动物的肠炎、疥疮和溃疡等疾病，也用作畜禽生长 促进剂
（2）硝基呋喃类药物——化学性质
（2）硝基呋喃类药物性质——代谢动力学
• 迅速代谢，半衰期几个小时内 • 以母体的形式迅速排泄 • 用14C-标记呋喃唑酮研究，残留物是
以同蛋白质结构转载存在其他硝基呋喃 类
（3）硝基呋喃类药物管理——残留检出
• 2002年3月：泰国、越南、印尼、印度、孟加拉，77个样中有16个样本含量超标； • 荷兰和英国水产品中检出； • 2005年，据日本检疫所的监测检查，我国的烤鳗被检出硝基呋喃类代谢物（AOZ）
1.2 液质联用分析技术
概念
质谱法是将样品离子化，变为气态离子混合物，然后利用不同离子在电场或磁场中运动行为的不同，把离子按 质荷比（M/Z）分离的分析技术，通过所得到的样品的质谱和相关信息，进行定性和定量分析
质谱分析的基本过程
用适当的方法使样品分子转变为气态离子，对于有机化合物，如果在离子化过程中接受了过多的能量，新生成 的分子离子（molecular ion）会进一步裂解，生成各种碎片离子(fragment ions).
C13-AHD
252.0
AOZ
236.1
D4-AOZ
240.0
子离子 Product Ion
