达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离解决方案

小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1. 培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。

2. 脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。

3. 无菌条件下将腹部剪开，脱皮。

(2min)
4. 选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5. 用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。

6. 脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。

(3min)
7. 离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml 离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。

(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8. 在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。

（6min）
9. 在显微镜下将细胞浓度调为5×106个/ml备用。

从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。

解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过解刨小鼠，提取脾细胞，以便进行后续的免疫学研究。

二、实验材料和仪器
1. 实验材料：小白鼠、生理盐水、70%乙醇、福尔马林、石蜡等。

2. 实验仪器：手术刀、注射器、组织培养皿、显微镜等。

三、实验步骤
1. 解剖小白鼠：将小白鼠放入无菌条件下，用70%乙醇消毒表面。

然后用手术刀在胸部进行切口，打开胸腔，找到心脏，将心脏割断。

接
着将小白鼠向上抬起头部，用手术刀在颈部进行切口，打开颈部皮肤
和肌肉层，在颈动脉两侧夹住气管和食管，并清除周围组织。

最后将
气管和食管割断，并将颈动脉及其分支全部割断。

2. 取出脾脏：用注射器注入生理盐水，将脾脏从周围组织中分离出来，然后将脾脏放入组织培养皿中加入生理盐水洗涤。

3. 细胞处理：将清洗干净的脾脏放入福尔马林中固定30分钟，再用酒精和石蜡等物质进行包埋。

最后用显微镜观察并提取细胞。

四、实验结果
通过本实验，成功地解剖出小白鼠，并提取了脾细胞。

经过显微镜观察，我们可以看到细胞形态正常，并且数量充足。

五、实验注意事项
1. 实验操作要求严格无菌。

2. 解剖小白鼠时要保持手术刀的锋利度。

3. 在取出脾脏时要注意不要损伤其结构。

4. 细胞处理过程中要避免污染。

六、实验结论
通过本实验，我们成功地解剖了小白鼠并提取了脾细胞。

这为后续的免疫学研究奠定了基础。

同时，在操作过程中也需要注意无菌和仪器使用等方面的细节。

Mouse IL-4 precoated ELISPOT kit说明书Cat# : DKW22-2040-500产品描述：达科为公司生产的达优®系列ELISPOT预包被试剂盒采用原装进口高亲和力高效价抗体对，经预包被PVDF 板、低温冷冻干燥、真空密封包装等工艺流程制备。

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达优®系列预包被ELISPOT试剂盒使实验检测时间从3天缩短为2天，大幅度减少无菌操作的实验步骤，减轻实验者的劳动强度和减少污染的机会。

使得实验者能够轻松、高效地完成复杂的ELISPOT检测实验。

试剂盒提供的试剂、规格：名称规格（5 ×96T）Biotinylated antibody 100μL× 5Streptavidin-HRP 500μLDilution buffer R（10×） 10mLWashing buffer (50×) 25mL×2AEC dilution 25mL×2AEC solutionⅠ（20×） 5mLAEC solutionⅡ（20×） 3mLAEC solution Ⅲ（200×） 500μL预包被PVDF板5块需要实验者自行准备的试剂与仪器：1.RPMI-1640基本培养基（需要添加双抗，不需要添加血清）2.无血清培养基（完全培养基，即用型）3.超净工作台4.CO2细胞培养箱5.微量移液器及配套Tip头6.8通道微量移液器7.0.5mL, 1.5mL EP管8.Biosys Bioreader自动读板仪试剂的配制：1．Washing buffer (50×):用去离子水稀释(1:50)，制成1× Washing buffer备用。

2．Dilution buffer R(10×)：用1×PBS稀释(1:10)，制成Dilution buffer R(1×)备用。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101012449A [43]公开日2007年8月8日[21]申请号200610063555.6[22]申请日2006.11.09[21]申请号200610063555.6[71]申请人深圳市达科为生物技术有限公司地址518067广东省深圳市南山区蛇口工业六路科健大厦四楼西[72]发明人朱义鑫 [74]专利代理机构深圳创友专利商标代理有限公司代理人罗瑶[51]Int.CI.C12N 5/06 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 8 页[54]发明名称淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法[57]摘要本发明公开了一种淋巴细胞分离液，所述分离液中包含重量体积百分浓度为14.0～17.5％的碘克沙醇(Iodixanol)。

本发明还公开了采用上述分离液分离脾脏淋巴细胞的方法，该方法包括：将脾脏直接在分离液中研磨，制备成单细胞悬液，并将悬有脾脏细胞的分离液进行离心操作。

本发明的分离液及方法无毒、便于操作且易于分离得到的状态好、活力高的淋巴细胞。

200610063555.6权 利 要 求 书第1/1页 1、一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述分离液中包含重量体积百分浓度为14.0～17.5％的碘克沙醇(Iodixanol)。

2、根据权利要求1所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液的渗透压为230～310mOsm，内毒素含量小于1EU/mL，pH 值为7.0～7.2。

3、根据权利要求2所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液还包含体积百分浓度为70.8～76.7％的RPMI1640培养基以及体积百分浓度为9.3～11.7％的超纯水。

4、根据权利要求2或3所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液的密度为1.077～1.095g/mL。

5、根据权利要求4所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液用于分离小鼠或大鼠的脾脏淋巴细胞。

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。

２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。

室温水平离心2000转/分钟，30分钟。

３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。

吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。

４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。

方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。

加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法000000需要提前准备的材料：0000000提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，0000000除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。

0000000红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。

00000001、配制的percoll工作液：配制15 ml0000000100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。

0 000002、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml000000070%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。

0000003、小鼠脾脏细胞分离00000000（1）颈椎脱臼处死小鼠。

75%酒精浸泡10min0000000（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。