小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤

流式荧光染色法实验原理及步骤原理：荧光染料CFSE，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。

当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。

这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。

实验步骤，以小鼠脾细胞为例：1.取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中；2.在超净工作台上无菌取出小鼠脾脏；3.用无菌注射器内芯研磨脾脏，尽量不残留较大组织块；再用3mlPBS冲洗后，将脾脏研磨液经200目尼龙网过滤至15mL离心管中，离心350g，5min；4.弃上清后，加入2mL红细胞裂解液，轻微吹打，裂解2min后加入等体积PBS终止裂解反应，混匀后离心350g，5min；5.弃上清，用RPMI1640完全培养基重悬沉淀，并取10μL细胞液计数，将细胞浓度调至2.0×106/ml；6.提前将CFSE按照说明书用DMSO配成5mM母液，并分装储存于-80冰箱，其工作浓度为0.5-25μM；7、取部分细胞作为不染色组阴性对照，其他细胞加入CFSE溶液，使得终浓度为5μM，37°C避光孵育15min；8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培养液，4℃，5min以中止染色；9、弃上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培养液洗2次，最后用1640完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞（阳性对照用PHA刺激）；10、37℃，5%CO2培养3天后用流式细胞仪分析细胞488nm激光器检查细胞增殖情况。

细胞悬液置于离心管底部。

离心管横放，将PBS滴加在靠近管口的管壁上。

再将CFSE加在PBS滴上。

维持离心管横向水平，拧上管盖，迅速垂直倒置离心管于涡旋器上涡旋。

（可参考JOVE网上的CFSE标记视频）
步骤：
1. 常规方法分离PBMC，细胞计数后300g离心10分钟。

弃上清，加入1%FBS/PBS液体重悬，洗涤一次，再用合适体积数目的1%FBS/PBS重悬，取出2×10^6l的细胞悬液，离心弃上清。

2. 用0.1%FBS/PBS稀释CFSE储存液(5000×,5mM)至1umol/L。

3. 用0.5ml上述CFSE稀释液重悬细胞，轻柔混匀。

4. 37 ℃放置10min。

5. 加入1ml冰冷的RPMI 1640 完全培养液，4℃，5分钟以中止染色。

6. 300g室温离心5分钟。

弃上清，加入冰冷的含10%FBS 的完全1640培养液洗2次。

最后用0.4ml 培养基重悬。

7. 将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞,（阳性对照用PHA刺激（1ug/ml））
8. 37 ℃, 5％CO2 避光培养3天。

9. 吸出培养液，24小时内上机检测。

（7AAD排除死细胞）
17. 在FACScalibur流式细胞仪上检测,用Cell Quest软件获取数据,然后用软件分析。

CFSE染色方法CFSE（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）染色方法是一种常用的荧光染色技术，通过这种方法可以追踪和分析细胞的增殖、分裂和活性等生理过程。

该方法利用CFSE荧光染料的特点，通过与细胞内的酯酶作用而形成的CFSE标记，来实现细胞的可见光荧光示踪。

1.准备CFSE染料溶液。

通常使用的浓度为5-10μM的CFSE染料溶液。

可以将CFSE染料溶于合适的溶剂中，如无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）或DMSO（二甲基亚砜）等。

2.处理待染细胞。

将需要染色的细胞分离出来，通常采用离心法获取细胞沉淀物。

接下来，将细胞悬浮液转移到培养基中。

3.CFSE染料标记。

将CFSE染料溶液与待染细胞混合，使其浓度达到适当的标记浓度。

染色时间一般为10-30分钟，但是时间过长或过短都有可能影响染料的有效标记。

染色完毕后，可以通过加入等体积的培养基来停止反应。

4.清洗和处理标记细胞。

将染色细胞通过离心去除无效的染料溶液，然后用新鲜的培养基洗涤细胞，去除未结合的染料。

5.扩增和培养标记细胞。

将清洗干净的细胞转移到含有适当培养基、生长因子和补充物的培养皿中，进行培养和扩增。

6.荧光显微观察。

通过荧光显微镜观察染色细胞，使用合适的荧光滤镜来观察CFSE荧光的发射。

CFSE染色方法的优势是可以追踪不同细胞的活动和增殖过程，如细胞分裂、生长速度等。

此外，该方法简单、可靠、重复性好，并适用于各种类型的细胞。

通过CFSE染色可以实现对细胞的定量和定性分析，对研究细胞增殖、分化、迁移等生命过程有重要意义。

总之，CFSE染色方法可以通过荧光示踪技术追踪和分析细胞的增殖和分裂过程。

通过上述实验步骤，可以成功地进行CFSE染色实验，并通过荧光显微镜观察和分析染色细胞的活动状态。

这项技术在生物学、生物医学和药物研发等领域有着广泛的应用前景。

体内CTL方法
1．将1 mg CFSE（MW 557.46）溶解于358.77 ul DMSO中，制备成5mM的储存液，分装成20ul/管，置于－20℃保存；
2．取naïve 小鼠脾细胞，以含2％胎牛血清的Hank液将PBMC按2×107细胞/ml重悬，将脾细胞分成2等份，分别用等体积低浓度的CFSE（1.0uM）和高浓度的CFSE（10uM）染色，37℃避光轻摇染色10min；
（注：染色液迅速往细胞内加，使细胞同时染上色）
3．用等体积的胎牛血清终止反应，1000rpm离心5min，弃上清，用含2％胎牛血清的Hank液洗2次，计数；
4．以2×107/ml重悬于含2％胎牛血清的Hank液中，高浓度的CFSE（10uM）染色的细胞进行肽（1-10ug/ml）孵育，低浓度的CFSE（1.0uM）染色的细胞不进行肽孵育，37℃ 5％CO2培养4小时；
5．将细胞转入15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，洗细胞2－3次；6．将低浓度和高浓度CFSE染色的靶细胞等体积混合，按每只小鼠1×107细胞/100ul由眼底毛细血管注射到实验小鼠体内，进行体内细胞杀伤反应；7．杀伤15小时（或更长时间，根据试验决定）后，处死实验小鼠，避光分离得到脾细胞，筛网过滤后转入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析；8．杀伤率＝【1－（试验组的比率/naïve的比率）】×100，
比率＝percentage CFSE high/percentage CFSE low。

1。

解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过解刨小鼠，提取脾细胞，以便进行后续的免疫学研究。

二、实验材料和仪器
1. 实验材料：小白鼠、生理盐水、70%乙醇、福尔马林、石蜡等。

2. 实验仪器：手术刀、注射器、组织培养皿、显微镜等。

三、实验步骤
1. 解剖小白鼠：将小白鼠放入无菌条件下，用70%乙醇消毒表面。

然后用手术刀在胸部进行切口，打开胸腔，找到心脏，将心脏割断。

接
着将小白鼠向上抬起头部，用手术刀在颈部进行切口，打开颈部皮肤
和肌肉层，在颈动脉两侧夹住气管和食管，并清除周围组织。

最后将
气管和食管割断，并将颈动脉及其分支全部割断。

2. 取出脾脏：用注射器注入生理盐水，将脾脏从周围组织中分离出来，然后将脾脏放入组织培养皿中加入生理盐水洗涤。

3. 细胞处理：将清洗干净的脾脏放入福尔马林中固定30分钟，再用酒精和石蜡等物质进行包埋。

最后用显微镜观察并提取细胞。

四、实验结果
通过本实验，成功地解剖出小白鼠，并提取了脾细胞。

经过显微镜观察，我们可以看到细胞形态正常，并且数量充足。

五、实验注意事项
1. 实验操作要求严格无菌。

2. 解剖小白鼠时要保持手术刀的锋利度。

3. 在取出脾脏时要注意不要损伤其结构。

4. 细胞处理过程中要避免污染。

六、实验结论
通过本实验，我们成功地解剖了小白鼠并提取了脾细胞。

这为后续的免疫学研究奠定了基础。

同时，在操作过程中也需要注意无菌和仪器使用等方面的细节。

小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。

4)500g，5min，弃上清。

5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。

7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。

小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。

小鼠脾细胞的制备实验报告一、引言。

脾脏是人体重要的免疫器官之一，其中包含丰富的淋巴细胞和单核细胞。

脾细胞的制备是进行体外细胞实验的重要步骤之一，对于研究免疫学、细胞生物学等领域具有重要意义。

本实验旨在通过小鼠脾细胞的制备，为后续的实验研究提供可靠的细胞来源。

二、材料与方法。

1. 实验材料。

小鼠脾脏。

DMEM培养基。

PBS缓冲液。

70%乙醇。

无菌玻璃器皿。

无菌手术器械。

离心管。

细胞计数板。

2. 实验方法。

a. 小鼠脾细胞的分离。

1) 将小鼠处死后，取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。

2) 用无菌手术器械将脾脏剪碎成细胞悬液。

3) 将细胞悬液转移至无菌玻璃器皿中，加入DMEM培养基。

4) 用吸管轻轻吹拂细胞悬液，使其混匀。

b. 细胞的纯化与计数。

1) 将细胞悬液转移至离心管中，进行离心分离。

2) 弃去上清液，加入PBS缓冲液悬洗细胞。

3) 用细胞计数板对细胞进行计数，并计算细胞浓度。

三、结果。

经过以上步骤，成功地制备了小鼠脾细胞。

经细胞计数，得到细胞浓度为1×10^6 cells/ml。

四、讨论。

小鼠脾细胞的制备是实验室常见的操作步骤，但在操作过程中需要注意细胞的纯化和计数，以确保得到高质量的细胞。

本实验通过合理的操作步骤，成功地制备了小鼠脾细胞，并得到了较高的细胞浓度，为后续的实验研究提供了可靠的细胞来源。

五、结论。

通过本实验，成功地制备了小鼠脾细胞，并得到了较高的细胞浓度，为后续的实验研究奠定了基础。

六、致谢。

感谢实验室的同事在实验过程中的帮助与支持。

七、参考文献。

[1] Smith A, Jones B. Isolation and culture of mouse splenic cells. Journal of Immunology, 2000, 150(2): 123-129.以上为小鼠脾细胞的制备实验报告。

【求助】荧光染料CFSE的配置与使用这是我根据同仁的说明书和网上查到的资料总结会总后的内容，你可以参考一下Cellstain- CFSE一羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE) 是一种可穿透细胞膜的荧光染料,具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团,使CFSE 成为一种良好的细胞标记物[1 ] 。

CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

当细胞分裂时,CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。

这样,在一个增殖的细胞群中,各连续代细胞的荧光强度呈对半递减,利用流式细胞仪在488nm 激发光和荧光1(FL1) 检测通道可对其进行分析Product Code: C375-10 Unit: 1 mg ，白或淡黄色粉末保存：－20℃ 运输：室温CFSE的配制和细胞染色程序DMSO是有机溶剂，对于蛋白质会有损伤，所以在配置的时候DMSO溶液越少越好；CFSE遇水容易分解，所以在配置时候要用无水DMSO，并且配置后尽快试验。

1、离心：3000rpm ?10min；2、取DMSO 180ul，稀释CFSE，超音波溶解，得到10mM CFSE保存液；将其按20ul体积分装于预遮光的无菌冻存管中，共分9管，标记后其中8管保存于－20℃。

另一管按10ul装于管中保存。

保存2个月。

3、取上余之10ul保存液，用PBS稀释至50ul，得到5mM的CFSE稀释液，保存于－20℃待用。

CFSE 标记细胞{KJ, 2002 #1}:标记浓度和条件：细胞通常用终浓度0.5－5μM的CFSE标记。

孵育时间5－10分钟，通常在10％FCS的PBS中染色，标记后细胞用完全培养介质洗涤，高蛋白灭活未反应的CFSE。

1、在有5％FCS的PBS重悬细胞，细胞浓度一般为1?106 （体外实验）?107/ml（转染实验）。

实验三小鼠脾细胞的分离制备及其活力检测
实验二小鼠脾细胞的分离制备及其
活力检测
材料
1、器材：离心机、手术剪、镊子、平皿、10ml离心管，5ml 注射器等
2、动物：昆明小鼠（25g左右，雄性）
3、试剂：碘伏、红细胞裂解液、Hank’s 液、0.4%台盼兰染液
方法
1、取小鼠一只，置于蜡盘上，颈椎脱臼处死，用碘伏消毒小鼠腹部后，打开腹腔，取出脾，去除周围的结缔组织，放入含有5ml Hank’s的平皿中。

2、用眼科剪将脾一端剪一小口后，将含有5ml Hank’s液的注射器从脾的另一端刺入脾，缓缓注入Hank’s液，即可见脾细胞悬液流入平皿，注意在注射Hank＇s液同时不断转动针头方向，直至脾变苍白为止。

3、将平皿倾斜静置10 min后，用干净吸管吸取细胞液到10ml 离心管中，平衡后，离心（1500rpm 10min），将
离心管盖子打开，快速弃上清液，往管底的细胞中加入1ml的红细胞裂解液，充分混匀20秒，立即加入9ml的Hank’s液，混匀，离心（1500rpm 10min），弃上清，将细胞定容到1ml。

4、吸取0.1ml的细胞悬液到干净的试管中，加入等量的0.4%台盼兰染液，混匀，吸取1滴的细胞液到玻片上，加上盖片，显微镜观察：死亡细胞染成蓝色，活细胞不染色。

正常情况下，活细胞数应达到95%以上。

小鼠脾细胞线粒体的分离与活体染色山东大学实验报告 2014/11/11 姓名:XX 系年级:2XX3级齐鲁医学班学号:20XXXXXXXX 实验题目: 小鼠肝细胞线粒体的活体染色及观察同组者: XXX 小白鼠肝细胞线粒体的活体染色与观察一 (【实验目的】1(观察小白鼠肝细胞内线粒体的形态和结构。

2(学习和掌握细胞的超活染色技术。

二(【实验原理】超活染色实验原理:超活染色也称活体染色，是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。

超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。

应用:活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

活体染色根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活).体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积染两类。

(1在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。

(2).体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学，特性起重要作用。

碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用,从而使样品着色。

但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。

活体染色剂选择原则,(1).对细胞无毒性或毒性极小的染料;(2).具有电化学特性;(3).配成稀淡的溶液来使用;(4).一般是以碱性染料最为适用。

线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。

本实验常用活体染色剂——詹纳斯绿B詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一地堆线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成为无色的色基(即无色状态)。

提取小鼠体内脾细胞实训过程记录实验目的：通过体内脾细胞提取，研究免疫细胞的增殖、分化和功能等方面的生理生化特性。

实验原理：小鼠脾脏是免疫细胞的主要器官，其中包含了大量的淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。

提取小鼠脾细胞，可用于免疫细胞的培养、表型分析、功能研究等。

实验步骤：1.小鼠剖腹取脾：先在实验动物按照规范的动物操作技术下施行人道安乐死，随后对小鼠进行无菌外科手术，在消毒的手术台上固定小鼠，并用无菌剪刀切开腹部，显露腹腔。

定位到脾脏后，用消毒的剪刀和镊子轻轻牵引脾脏，将脾脏完整地取出。

2.清洗脾脏：将取出的脾脏置于无菌PBS缓冲液中，用无菌镊子和剪刀把脾脏上的脂肪和血管组织清除干净，并将脾脏放入含无菌PBS的培养皿中。

3.细胞提取：用无菌注射器灌注0.5mL无菌PBS缓冲液，将其注入脾脏中，用剪刀剪碎脾脏组织，使细胞充分分散。

接着，将脾脏组织转移到一个50mL离心管中，并加入5mL无菌PBS缓冲液。

用离心机将脾脏组织沉淀离心，将上清液倒掉，沉淀的细胞被称为脾单细胞悬液。

4.细胞计数：将脾单细胞悬液重新悬浮在含PBS的15mL离心管中，用显微镜和细胞计数板计数细胞。

根据计数结果，计算细胞的浓度。

5. 离心沉淀：将细胞悬液倒入离心管中，并进行离心，离心速度约为1500 rpm，离心时间为5分钟。

离心后，将上清液丢掉，离心管中的细胞沉淀称为脾细胞。

6.细胞培养：将脾细胞再次悬浮在含有适当培养基的培养皿中，加入足够的细胞密度，放入恒温培养箱中培养。

培养条件根据不同实验的要求进行设置，一般情况下，培养基中含有的细胞因子、血清和其他添加剂都是必要的。

7.实验后处理：根据具体实验要求，对培养的脾细胞进行进一步的实验处理，如分离、染色、鉴定、培养基替换等。

实验注意事项：1.手术操作时要注意无菌操作，避免污染。

2.取脾脏后要迅速进行后续操作，避免细胞损伤。

3.细胞培养过程中，要保持适当的温度和湿度，以及细胞所需的培养基成分。

小鼠脾细胞的分离原理
小鼠脾细胞的分离原理基本上可分为以下几个步骤：
1. 选择性切除脾脏：将小鼠固定在手术台上，进行全麻手术，使用消毒的手术刀仔细切开腹部皮肤，暴露脾脏。

根据需要，将脾脏切除并置于冷盐水或试管中。

2. 细胞解聚：将脾脏置于含有细胞解聚酶（例如胰蛋白酶）的消化液中，用温和的消化条件进行消化。

消化时间和消化液浓度可根据需要进行调整。

3. 细胞过滤：将消化后的细胞悬液通过细胞过滤器进行过滤，以去除大块组织碎片和残留的不可消化物质。

过滤器的孔径大小可根据实验需求选择。

4. 细胞沉降：通过离心将细胞悬液离心沉淀，移除上清液并保留沉淀。

沉淀中的细胞主要是小鼠脾脏中的淋巴细胞和其他免疫细胞。

5. 细胞分离：使用细胞分离液（例如离心梯度离心液）对细胞沉降物进行离心梯度离心。

离心梯度离心液可使不同细胞类型在不同密度层次上分布。

根据需要，可使用手动或自动离心设备进行离心。

6. 细胞收集：从离心管中收集位于所需密度梯度上层的细胞组分，并将其洗涤与培养基中以去除离心梯度离心液的残余物质。

7. 细胞计数与培养：使用显微镜和细胞计数板来计数和评估分离的细胞的数目和纯度。

接下来，将细胞移植至培养皿或试管中进行后续细胞培养或实验。

小鼠脾脏分离方法
小鼠脾脏分离的方法大致分为以下几个步骤：
1. 准备实验器材和试剂：包括小鼠、手术器械（注射器、剪刀、镊子等）、培养介质等。

2. 麻醉小鼠：将小鼠固定在麻醉机的透明密闭室中，在室内添加气体麻醉剂（如异氟醚）使其麻醉，直到小鼠没有任何反应。

3. 消毒和剪毛：用75%酒精和消毒棉球彻底消毒小鼠的腹部。

将小鼠放在消毒台上，使用剪刀修剪腹部的毛发。

4. 制备手术器械：将手术器械放在消毒台上，使用消毒液进行消毒。

5. 手术操作：使用剪刀和镊子，小心地切开小鼠的腹腔。

找到脾脏，并用剪刀和镊子将其取出。

6. 分离脾脏细胞：将脾脏放入含有适宜培养液的离心管中。

用剪刀和镊子将脾脏分成小块。

7. 细胞过滤：将分块的脾脏组织用细胞过滤器过滤，以去除大块组织和残渣。

8. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数板，将过滤后的细胞进行计数。

9. 实验操作：根据实验的需要，将分离的脾脏细胞进行相应的实验操作，如培养、染色等。

10. 实验结束：在实验完成后，将剩余的细胞进行妥善保存或处理，清洗实验器材，并按规定进行废弃物处理。

CFSE的配制和实验步骤CFSE（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）是一种常用的细胞示踪剂，可以被活细胞摄取和代谢，通过随后的脱乙酰化，形成固定在细胞膜上的草酮衍生物。

该草酮衍生物在细胞内稳定存在，并且不会轻易漏出细胞膜。

CFSE可用于跟踪细胞的分裂、迁移和消亡，以及测定细胞数量和活力等。

下面是CFSE的配制和一些实验步骤的详细介绍：一、CFSE的配制1.准备0.5mM的CFSE库存溶液：向1.2mL的溶剂（注：溶剂可以是Me2SO、DMSO或甲醇等的熟水溶液）中加入600μL的DMSO，将混合液用适当的容器混合均匀。

2. 将CFSE库存溶液分装为小份存储，可以使用Eppendorf管或冻存管等容器，避免光照。

3.将储存的CFSE库存溶液在-20℃冰箱中保存，避免接触光和冻融过程。

二、细胞的CFSE示踪实验步骤1.细胞准备：a.选择需要进行示踪的细胞株或细胞系，并进行细胞的培养和扩增。

b.统计细胞数目并计算所需的细胞数量。

c.用适当的培养基将细胞以适当的浓度悬浮。

2.CFSE标记细胞：a.从-20℃冷冻保存的CFSE库存溶液中取出一小部分，迅速溶解至室温。

b.调制CFSE标记溶液：向细胞悬浊液中加入CFSE溶液，使CFSE最终浓度为1-10μM（视细胞需求而定）。

c.温和摇晃管子，使CFSE充分与细胞接触，保护细胞免受过度浸洗或搅动。

d.将细胞与CFSE标记溶液在37℃的培养箱中孵育15-60分钟，可根据细胞株的特性和最佳CFSE进入时间进行调整。

3.细胞洗涤：a.加入等体积的预冷PBS洗涤细胞，代替CFSE标记溶液。

b.将细胞沉淀下来（500×g，4℃，5分钟）。

c.倒去上清液，并添加等体积的预冷PBS洗涤细胞，重复此洗涤步骤2-3次，以去除多余的CFSE。

4.细胞培养和分析：a.加入适当的培养基，将细胞悬浮并移至培养皿或培养板中。