T淋巴细胞提取
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cart细胞疗法原理
cart细胞疗法原理一、引言随着医学技术的不断发展，越来越多的治疗手段被开发出来，其中包括细胞疗法。
细胞疗法是一种新型的治疗方法，它通过注入人体内特定类型的细胞来治疗疾病。
在细胞疗法中，CAR-T细胞疗法是最为广泛应用的一种方法。
本文将详细介绍CAR-T细胞疗法的原理。
二、CAR-T细胞概述CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T cell）是一种通过基因工程技术制造出来的T淋巴细胞。
它们被设计成能够识别并攻击特定类型的癌细胞或其他有害物质。
CAR-T细胞通常由患者自身血液中提取出来，并经过处理后再重新注入到患者体内。
三、CAR-T细胞制备1. 提取T淋巴细胞首先，医生会从患者血液中提取出T淋巴细胞，并将其分离出来。
这些T淋巴细胞将被用于制备CAR-T 细胞。
2. 转染基因接下来，医生会将一个特定的基因转染到这些T淋巴细胞中。
这个基因是一种叫做CAR（Chimeric Antigen Receptor）的蛋白质。
CAR 由两部分组成：一部分是能够识别癌细胞表面的抗原，另一部分则是T 淋巴细胞激活所需的信号传导分子。
3. 增殖CAR-T细胞转染后，这些T淋巴细胞将被放入一个培养皿中，并在特定条件下进行培养和增殖。
在这个过程中，CAR-T 细胞会不断地繁殖，并形成足够数量的细胞供治疗使用。
四、CAR-T细胞治疗原理1. CAR-T 细胞识别癌细胞CAR-T 细胞被设计成能够识别并攻击特定类型的癌细胞。
当它们进入人体后，会寻找并锁定目标癌细胞表面上的抗原。
2. 激活T淋巴细胞一旦 CAR-T 细胞与目标癌细胞结合，它们就会释放出信号传导分子，并激活周围的T淋巴细胞。
这些T淋巴细胞会接收到信号，并开始分泌一系列的生长因子和细胞因子，以加强攻击力度。
3. 攻击癌细胞CAR-T 细胞和周围的T淋巴细胞会组成一个攻击队伍，共同攻击目标癌细胞。
它们会释放出一系列的毒素和酶，以摧毁目标癌细胞。
T淋巴细胞转化试验步骤及注意事项
淋巴增殖实验:第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀;(2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀;⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次;(4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min;(5)悬于1mL DMEM 中;(6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的ConA,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d;(7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。
取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。
第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。
2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50µl含20µg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。
提取淋巴细胞实验报告
一、实验目的本实验旨在学习淋巴细胞提取的方法，掌握淋巴细胞的分离、纯化和计数技术，为后续的淋巴细胞功能研究奠定基础。
二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的一种重要细胞，主要存在于血液和淋巴组织中。
本实验采用Ficoll分离液法，根据不同细胞密度的差异，将淋巴细胞从其他细胞中分离出来。
三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠2. 仪器：离心机、移液器、加样器、离心管、无菌操作台、眼科剪、眼科镊、显微镜、计数板3. 试剂：Ficoll分离液、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、淋巴细胞分离液、75%酒精、无菌生理盐水、10%甲醛固定液四、实验方法1. 小鼠免疫器官分离（1）将小鼠麻醉后，固定在手术台上；（2）用眼科剪剪开小鼠的腹部皮肤，暴露出腹腔；（3）用眼科镊取出小鼠的脾脏，放入装有PBS的无菌皿中；（4）用眼科剪将脾脏剪成小块，放入装有PBS的无菌皿中；（5）用无菌生理盐水冲洗脾脏，去除杂质；（6）将脾脏组织转移至新的无菌皿中，加入淋巴细胞分离液；（7）用移液器将淋巴细胞分离液和脾脏组织充分混合；（8）将混合液转移到离心管中，以1000rpm离心10分钟；（9）弃去上清液，保留沉淀物。
2. 淋巴细胞分离（1）将沉淀物加入适量的淋巴细胞分离液，轻轻混合；（2）将混合液转移到新的离心管中，以1000rpm离心10分钟；（3）弃去上清液，保留沉淀物。
3. 淋巴细胞计数（1）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（2）将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察；（3）按照计数板上的网格进行细胞计数。
4. 淋巴细胞纯度鉴定（1）将计数后的淋巴细胞加入适量的10%甲醛固定液，固定10分钟；（2）用PBS洗涤固定后的淋巴细胞，去除甲醛；（3）将淋巴细胞加入适量的细胞染色剂，染色30分钟；（4）用PBS洗涤染色后的淋巴细胞，去除染色剂；（5）将淋巴细胞转移到离心管中，以1000rpm离心5分钟；（6）弃去上清液，保留沉淀物；（7）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（8）用移液器将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察淋巴细胞形态，判断淋巴细胞纯度。
【VIP专享】提取淋巴细胞流程
一、采集血样，室温保存。
使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。
一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为2-5ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。
在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在装有2ml血样的真空管中加入2mlPBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀。
然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。
（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。
1500rpm,15min,20摄氏度。
说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。
实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。
适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。
最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。
3、PBS溶液是一种平衡盐溶液，还可以用Hank’s液或生理盐水代替PBS溶液，但最常用的还是PBS溶液。
哮喘大鼠模型的制作和T淋巴细胞的分离
哮喘大鼠模型的制作和T淋巴细胞的分离哮喘是一种慢性的呼吸道疾病，主要由过度反应的免疫反应导致的气道炎症和过敏反应引起。
为了研究哮喘的发病机制和寻找新的治疗方法，研究人员常常使用哮喘大鼠模型来模拟人类哮喘病情。
同时，分离T淋巴细胞可以提供一个研究哮喘发病机制和免疫反应的重要工具。
本文将介绍哮喘大鼠模型的制作方法和T淋巴细胞的分离过程。
一、哮喘大鼠模型的制作方法1.实验动物准备：选择健康的雄性SD大鼠作为实验动物，饲养在无菌条件下，并确保动物的健康和皮毛状态良好。
2.响应原的制备：选择常见的过敏原，如变应原等，将其溶解或悬浮于生理盐水或PBS中，制备一定浓度的哮喘触发原溶液。
3.鼻腔感染：将哮喘触发原溶液滴入实验动物鼻腔中，让动物通过吸入途径感染。
确保溶液均匀分布在鼻腔中，并避免动物脱水。
4.增强免疫反应：在感染后的24小时内，给予适量的抗原刺激，如喷雾或呼入，以增强动物的免疫反应。
可重复该过程多次，以加强哮喘模型的效果。
5.行为观察和炎症评估：观察动物的呼吸状况和活动状态，记录呼吸困难、喘息等症状的出现和严重程度。
使用肺组织病理学评估炎症程度和气道重塑情况。
6.免疫细胞的分离：根据需要，可以在动物呼吸紊乱和炎症发生的早期进行免疫细胞的分离。
使用标准的细胞分离方法，如差速离心法、自动化分离法等。
二、T淋巴细胞的分离过程1.组织收集：选择哮喘大鼠模型中的气道组织，如支气管和肺组织，取出后立即存放在细胞分离培养基中。
2.组织切割和酶消化：将组织切成小块，进行酶消化。
将组织块放入含有胰蛋白酶、DNA酶和适当浓度的胶原酶的消化液中，进行孵育。
3.细胞过筛和洗涤：将消化液过筛，得到细胞悬液。
使用PBS或培养基对细胞进行洗涤，以去除残留的消化液和杂质。
4.抗体标记和分选：选择合适的抗体，比如CD4抗体，标记细胞表面的T淋巴细胞。
使用流式细胞仪或磁珠分选等技术，对T淋巴细胞进行富集和纯化。
5.细胞培养和后续实验：将分离得到的T淋巴细胞进行培养和后续实验，如增殖实验、分泌物检测等，以探究其功能和参与免疫反应的机制。
人外周血t淋巴细胞提取
人外周血t淋巴细胞提取
人外周血T淋巴细胞提取是指从人体外周血样本中分离并纯
化T淋巴细胞的过程。
T淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，具有调节免疫应答和击杀感染性病原体等功能。
通过对外周血中
T细胞的提取，可以进一步研究其功能和特性，并在免疫治疗、细胞治疗等领域应用。
人外周血T淋巴细胞提取的具体步骤包括：
1. 采集外周血样本：使用采血针或血管穿刺等方法从患者或捐赠者的外周血中取得样本。
2. 血液分离：采用离心等方法将血液分离为红细胞、白细胞和血浆等不同组分。
3. 白细胞富集：采用离心梯度离心或负选择等技术将白细胞富集到一定程度。
4. CD3阳性细胞筛选：使用单克隆抗体等与CD3表面分子结合，利用磁珠或荧光标记等方法对T细胞进行筛选，获得
CD3阳性的T细胞群体。
5. 细胞纯化：通过进一步的磁珠或荧光标记等技术，对T细
胞进行纯化，去除其他污染细胞，得到较纯的T细胞群体。
在人外周血T淋巴细胞提取的过程中，需要严格的操作和消
毒措施以确保样本的无菌和安全性。
此外，细胞提取后的T
细胞可以进一步用于细胞培养、分化、鉴定等实验操作，用于研究和治疗目的。
t细胞分离方法和分离原理
t细胞分离方法和分离原理（最新版4篇）目录（篇1）1.T 细胞的概述2.T 细胞分离的常用方法3.T 细胞分离的原理4.T 细胞分离的应用5.总结正文（篇1）T 细胞是免疫系统中的一种重要细胞类型，它在免疫应答中扮演着关键的角色。
T 细胞的分离和纯化对于研究免疫系统和疾病的免疫机制具有重要意义。
一、T 细胞的概述T 细胞，即 T 淋巴细胞，是一种重要的免疫细胞，主要参与细胞免疫应答。
根据功能和表型的不同，T 细胞可分为多种亚型，如 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、CD4+ CD25+调节性 T 细胞等。
二、T 细胞分离的常用方法目前，常用的 T 细胞分离方法主要有以下几种：1.贴壁粘附法：利用 T 细胞与特定抗原结合的能力，使 T 细胞粘附在固相载体上，从而与其他细胞分离。
2.磁珠法：通过连接有磁珠的特异性单抗与 T 细胞表面抗原结合，在外加磁场中，利用磁珠与细胞间的相互作用力，实现 T 细胞的分离。
3.流式细胞术：利用 T 细胞表面特异性抗原与荧光标记的抗体结合，通过流式细胞仪对细胞进行分选。
4.尼龙毛柱分离法：利用尼龙毛对 T 细胞的吸附能力，与其他细胞进行分离。
三、T 细胞分离的原理T 细胞分离的原理主要基于其表面抗原与特定抗体或物质的特异性结合。
通过这种结合，可以利用外力（如磁场、离心力等）使 T 细胞与其他细胞分离。
目录（篇2）1.T 细胞的概述2.T 细胞分离的必要性3.T 细胞分离的方法a.免疫磁珠法b.尼龙毛柱分离法c.贴壁粘附法d.Percoll 分层液法4.T 细胞分离的原理a.免疫磁珠法的原理b.尼龙毛柱分离法的原理c.贴壁粘附法的原理d.Percoll 分层液法的原理5.T 细胞分离的应用6.总结正文（篇2）T 细胞是免疫系统中的一种重要细胞类型，它在免疫应答中起着关键作用。
T 细胞的分离和纯化对于研究免疫系统和疾病机制具有重要意义。
本文将介绍 T 细胞分离的方法和分离原理。
T淋巴细胞分离技术
T淋巴细胞分离技术(免疫细胞的分离、纯化和鉴定)免疫细胞的分离、纯化技术各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。
免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。
粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。
有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为：巨噬细胞或单核细胞＞树突状细胞=抗体产生细胞＞B淋巴细胞＞T淋巴细胞=红细胞。
粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。
葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。
E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。
尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。
一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分离是免疫学研究中的一项基本技术。
目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分离PBMC纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。
ficoll-hypaque 混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1.077；分离小鼠单个核细胞时比重为1.080；分离大鼠单个核细胞时比重为1.084～1.087；分离马单个核细胞时比重为1.090。
淋巴细胞 分离方法
淋巴细胞分离方法淋巴细胞是免疫系统中的一类重要细胞，它们在保护机体免受病原体和其他外部侵袭物的侵害中起着重要作用。
为了研究和理解淋巴细胞的功能和特性，需要从体内样本中分离出淋巴细胞。
本文将介绍几种分离淋巴细胞的常用方法。
1. 密度梯度离心法密度梯度离心法是最常用的分离淋巴细胞的方法之一。
该方法基于淋巴细胞与其他细胞（如红细胞和中性粒细胞）在离心过程中在不同密度梯度下沉降速度的不同。
一种常用的密度梯度离心介质是Ficoll-Hypaque，它是一种高渗透压溶液。
将全血或其他样本与Ficoll-Hypaque混合后离心，淋巴细胞会沉积在密度梯度下层，其他细胞则沉积在上层或底层。
通过取得下层液体，可分离得到富含淋巴细胞的悬浮液。
2. 黏附法黏附法是一种常用的非离心方法。
它基于淋巴细胞与塑料或玻璃表面的亲和性差异。
将样本与普通培养皿等容器接触，淋巴细胞会黏附在容器表面，而其他细胞则较少或不黏附。
在培养过程中，淋巴细胞会逐渐扩增，并可以通过洗涤等步骤分离得到。
3. 磁珠法磁珠法是一种利用磁性特性分离淋巴细胞的方法。
通过将淋巴细胞表面标记上磁珠特异抗体，使其与抗体携带的磁珠结合，然后通过磁场使磁珠和与其结合的淋巴细胞沉降在一侧，从而分离出淋巴细胞。
这种方法可以非常精确地分离出特定类型的淋巴细胞。
4. 细胞排序法细胞排序法是一种高级的分离淋巴细胞的方法，它基于流式细胞术或荧光激光共聚焦显微镜等技术。
这种方法通过在淋巴细胞表面标记上荧光染料或抗体，然后使用器械和设备进行精确的细胞分选。
这种方法可以快速准确地分离出不同类型的淋巴细胞，并可以进一步进行功能和表型分析。
尽管以上方法在分离淋巴细胞中非常有效，但每种方法都有其局限性。
例如，密度梯度离心法在操作过程中可能会对淋巴细胞产生一定的损伤；黏附法可能对特定类型的淋巴细胞选择性较差；磁珠法和细胞排序法则需要较为复杂的设备和技术。
因此，在具体选择方法时需要综合考虑研究的目的、操作难度和资源条件等因素。
实验五TB淋巴细胞的分离实验
２．从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞。 从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞。
①取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀释。加于3毫升 淋巴细胞分层液液面之上（沿管壁轻轻加入，勿使两液相混）。 ②2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到另一试管中加5倍体积 的Hanks液洗1—2次，（1500转/分离心10分钟）弃上清即成。
将形成E—花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分 离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含B淋巴细胞群。沉 淀于管底的E—花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3毫 升处理3分钟，低渗裂解E—花环周围的RRBC，立即加 3.5%氯化钠溶液1毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即 得富含T淋巴细胞群。
五、实验报告
写出T、B淋巴细胞分离的详细过程。 分析说明该实验过程中需注意的事项。
三、实验材料
新鲜豚鼠血 兔红细胞（RRBC） 溴花二氨基异硫氢化物（AET） 淋巴细胞分层液 其它Hanks液，含小牛血清的199培养液，无菌生 理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。
四、实验步骤
１．AET—RRBC制备 制备
溶液的制备：称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水 ① AET溶液的制备 溶液的制备 中，使成为0.143M溶液，用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜 配制，不宜久存。 处理RRBC：取洗涤好压积的RRBC，按一份压积AET— ②AET处理 处理 RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分 钟，每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口（1—2 厘米）1800转/分离心5分钟。连续洗涤3—5次，每洗一次，必须充分 摇匀，以减少AET—RRBC粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现 象，则用含小牛血清的199培养基再洗一次，最后配成10%AET— RRBC悬液，置4℃保存，不得超过5天。 的配制：将预先配制并保存于4℃冰箱的10% ③1%AET—RRBC的配制 的配制 浓度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。
外周血t淋巴细胞纯化方法的研究
外周血t淋巴细胞纯化方法的研究外周血t淋巴细胞（PBMC）纯化作为血液研究的重要组成部分，被用于研究免疫相关的分子生物学，病毒感染，免疫序列分析，免疫化学检测等。
可以说，纯化PBMC是研究血液疾病的基础。
传统除血分技术根据重力相互作用和血浆的物理化学性质进行纯化取得的PBMC的细胞活性较低，影响了细胞后续实验的准确性，因此，拥有比传统除血分技术性能更高的外周血PBMC的纯化方法的研究十分有必要。
在开展外周血T淋巴细胞纯化方法研究时，分离技术是至关重要的，现有常用的细胞分离技术有毛细管分离（Ficoll－Hypaque分离法）、圆柱离心法（Lymphoblast悬浮液离心法）、丙烯酰胺离心法（Plasmopara纯化法）、超滤法、密度离心法（Ficoll－Hypaque密度离心法）、不活化的蒸馏水离心法、磁性分离法（钛纯净法）、细胞中内染色质沉淀（centrifugation）等。
由于磁性分离法不会受到细胞外环境中杂质的干扰，因此从中可获得较高纯度的PBMC,在近几年已得到广泛应用。
而在磁性分离研究中，有不同颗粒表型，表面包被物质有重要影响，以及采用什么样的原体和磁液体系也具有重要意义。
一些研究表明，新型磁性微球，如空心磁性纳米球，平环铁氧体，空心MnFe2O4纳米管，由于其独特的孔结构，能够大大提高细胞上偶合特异性分子（经典白细胞抗原CD45）的结合能力，因此，可以有效实现外周血PBMC的细胞纯化。
此外，还有一些相关的技术，例如基于冷冻熔融的血液细胞凝固法，具有提高PBMC 的活性能力的优势，可以有效抗衰老和抑制启动子的活性，从而实现外周血T淋巴细胞的最佳纯化。
最后，在研究外周血PBMC纯化方法时，对免疫反应的定量分析至关重要，采用适当的免疫检测方法进行分析，可以更好地理解细胞纯化后的细胞活力，有助于更好地开展相关研究。
综上所述，外周血T淋巴细胞纯化方法的研究一直是当今科学家们关注的重点，磁性分离技术具有较高的细胞活力，新型磁性分离微球可以有效提高细胞上偶合特异性分子的结合能力，基于冷冻熔融的血液细胞凝固法也可以提高细胞响应能力。
免疫T淋巴细胞检测——帮助了解你的免疫力
免疫T淋巴细胞检测——帮助了解你的免疫力免疫力是人体抵御疾病的重要依靠，而T淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分。
T淋巴细胞检测是一种现代化的检测方法，可以帮助人们了解自己的免疫状态，有助于保持免疫系统的健康。
本文将向大家介绍免疫T淋巴细胞检测的相关知识，帮助大家正确认识自己的免疫力。
T淋巴细胞是什么？T淋巴细胞是一种白细胞，是免疫系统中的核心细胞之一，主要负责识别和攻击病原体、癌细胞等异物。
T淋巴细胞在人体免疫系统中起着重要作用。
它们通过产生特异性抗体、杀伤病原体和调节免疫反应等方式来保护身体免受疾病侵害。
T淋巴细胞的种类和数量各不相同，包括CD4+ T淋巴细胞、CD8+ T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞等。
它们各自承担着不同的免疫功能。
例如，CD4+ T淋巴细胞主要负责指挥和调节免疫反应，激活其他免疫细胞，如B淋巴细胞和巨噬细胞等；CD8+ T淋巴细胞则是通过直接杀死病原体和癌细胞来保护身体免受侵害，T淋巴细胞数量过低可能意味着免疫系统出现了问题，进而导致身体容易感染疾病。
T淋巴细胞检测的作用是什么？1. 了解免疫系统的状况：T淋巴细胞检测可以帮助确定免疫系统的状况，包括T淋巴细胞的数量和比例。
通过了解自己的T淋巴细胞状态，可以判断免疫系统是否正常工作，是否存在免疫功能异常或免疫系统亢进的情况。
2. 预防和诊断疾病：T淋巴细胞检测可以帮助医生预防和诊断一些疾病。
例如，艾滋病、白血病等。
某些疾病会导致T淋巴细胞数量异常，通过检测T淋巴细胞的数量和比例，可以及早发现这些疾病的存在。
3. 判断免疫功能：T淋巴细胞检测可以帮助判断免疫功能的强弱。
免疫功能强的人，T淋巴细胞数量和比例通常在正常范围内。
而免疫功能较弱的人，会存在T淋巴细胞数量不足或功能异常的情况，容易导致感染和疾病的发生。
如何进行T淋巴细胞检测？1. 流式细胞术：流式细胞术是一种通过样本细胞的荧光染色，使不同的T淋巴细胞呈现不同的颜色，然后采用流式细胞仪器进行检测的方法。
T淋巴细胞提取
前再覆盖上大约200μL的1640培养基。
5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。
如何从小鼠的脾脏中提取T淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操作步骤
枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响
〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P<0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。
如何从小鼠的脾脏中提取T淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操作步骤
枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响
〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P<0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
分离纯化t淋巴细胞的方法
分离纯化t淋巴细胞的方法分离纯化T淋巴细胞的方法引言：T淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞类型，对于维持机体免疫功能和抵抗感染起着关键作用。
因此，研究T淋巴细胞对于深入理解免疫机制和疾病治疗具有重要意义。
本文将介绍几种常用的方法来分离纯化T淋巴细胞，包括密度梯度离心法、磁珠分选法和细胞表面标记法。
一、密度梯度离心法密度梯度离心法是一种常用的分离细胞的方法，通过调节不同浓度的密度梯度溶液，将细胞按照密度的大小进行分层。
具体步骤如下：1. 收集外周血或淋巴组织，用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的血红细胞。
2. 将细胞悬浮液缓慢地加入密度梯度离心管中，通常使用Ficoll或Percoll溶液作为密度梯度溶液。
3. 将离心管放入离心机中，以适当的离心速度和时间离心。
4. 离心结束后，可以观察到细胞在不同密度层的分布情况。
T淋巴细胞通常位于中上层。
5. 使用移液器将目标细胞层吸取，转移至新的离心管中。
6. 用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的密度梯度溶液。
二、磁珠分选法磁珠分选法是一种基于细胞表面标记分离目标细胞的方法，通过特异性抗体与磁珠结合，实现对目标细胞的分离。
具体步骤如下：1. 收集外周血或淋巴组织，用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的血红细胞。
2. 将细胞悬浮液与与目标细胞特异性标记的磁珠混合，使其充分结合。
3. 将混合物放入磁场中，利用磁力将磁珠与目标细胞一起沉降至管壁，非目标细胞则保持在上清液中。
4. 将上清液转移至新的离心管中，去除非目标细胞。
5. 用PBS缓冲液洗涤磁珠-目标细胞复合物，去除残留的上清液。
6. 使用磁场将磁珠-目标细胞复合物从离心管壁上解离，得到纯化的T淋巴细胞。
三、细胞表面标记法细胞表面标记法是一种利用细胞表面特异性标记物分离目标细胞的方法，通过特异性抗体与细胞表面标记物结合，实现对目标细胞的分离。
具体步骤如下：1. 收集外周血或淋巴组织，用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的血红细胞。
人外周血B、T淋巴细胞的分离方法介绍
人外周血B、T淋巴细胞的分离方法介绍
1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2.取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。
水平离心2000rpm×20分钟。
3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。
中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
此外，还含有血小板。
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。
计数200个淋巴细胞。
计算出活细胞百分率。
分离纯化t淋巴细胞的方法
分离纯化t淋巴细胞的方法分离纯化T淋巴细胞的方法T淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，对于机体的免疫防御起着关键作用。
因此，对于T淋巴细胞的分离纯化技术也备受关注。
本文将介绍几种常用的T淋巴细胞分离纯化方法。
一、梯度离心法梯度离心法是将含有T淋巴细胞的血样加入到密度梯度液中，并进行高速离心分层，从而实现对T淋巴细胞的分离纯化。
常用密度梯度液包括Ficoll-Paque和Percoll等。
具体操作步骤如下：1. 准备含有T淋巴细胞的血样，并加入到密度梯度液中。
2. 进行高速离心分层，使得不同密度的免疫细胞沉积在不同位置。
3. 采集上清液中的T淋巴细胞并进行后续处理。
该方法优点是操作简单、可扩展性强，但缺点是需要大量血样，并且可能会影响到部分免疫细胞的活性。
二、磁珠分离法磁珠分离法是利用表面标记有特定抗体的磁珠，结合T淋巴细胞表面的特定抗原进行分离纯化。
该方法通常需要先对T淋巴细胞进行表面标记，例如利用CD3或CD4等抗体进行表面标记。
具体操作步骤如下：1. 对T淋巴细胞进行表面标记。
2. 加入含有特定抗体的磁珠，并进行充分混合。
3. 利用磁力将带有T淋巴细胞的磁珠集中到一侧，从而实现对T淋巴细胞的分离纯化。
该方法优点是对于其他免疫细胞不会产生影响，但缺点是需要进行表面标记，并且可能会影响到部分免疫细胞的活性。
三、流式细胞术流式细胞术是利用流式细胞仪对不同免疫细胞进行快速、高通量的检测和排序。
该方法通常需要先对T淋巴细胞进行表面标记，并通过流式仪对其进行检测和排序。
具体操作步骤如下：1. 对T淋巴细胞进行表面标记。
2. 加入含有特定抗体的荧光素，并进行充分混合。
3. 利用流式仪对不同荧光素标记的免疫细胞进行检测和排序，从而实现对T淋巴细胞的分离纯化。
该方法优点是快速、高通量，但缺点是需要昂贵的设备和专业技能，并且可能会影响到部分免疫细胞的活性。
总结以上三种方法都是常用的T淋巴细胞分离纯化技术，各有优缺点。
用于t淋巴细胞的体外培养方法
用于t淋巴细胞的体外培养方法
T淋巴细胞是一种重要的免疫细胞，它们在体内起着重要的免疫调节作用。
为了更好地研究T淋巴细胞的生物学特性和免疫功能，需要进行体外培养。
下面介绍几种常用的T淋巴细胞体外培养方法。
1. 传统的T淋巴细胞体外培养方法
传统的T淋巴细胞体外培养方法是将T淋巴细胞与培养基、血清和生长因子等物质混合，然后在培养皿中进行培养。
这种方法的优点是简单易行，适用于大规模培养，但缺点是培养时间长，细胞易受到污染和变异。
2. 磁珠分选法
磁珠分选法是一种高效的T淋巴细胞体外培养方法。
该方法利用磁珠的磁性将T淋巴细胞从混合细胞中分离出来，然后进行体外培养。
这种方法的优点是分离效率高，细胞存活率高，可以得到纯度较高的T 淋巴细胞，但缺点是设备和试剂成本较高。
3. 无血清培养法
无血清培养法是一种新型的T淋巴细胞体外培养方法。
该方法不使用血清，而是使用一种特殊的培养基和生长因子来进行培养。
这种方法的优点是细胞生长快，细胞存活率高，细胞功能稳定，但缺点是培养基和生长因子成本较高。
4. 生物反应器培养法
生物反应器培养法是一种高效的T淋巴细胞体外培养方法。
该方法利用生物反应器的特殊结构和流体力学特性，使T淋巴细胞在培养过程中得到更好的氧气和营养供应。
这种方法的优点是细胞生长快，细胞存活率高，细胞功能稳定，但缺点是设备成本较高。
总之，T淋巴细胞的体外培养方法有多种，每种方法都有其优缺点。
在选择合适的培养方法时，需要考虑到实验的具体要求和实验室的设备和经费条件。
t淋巴母临床实验
t淋巴母临床实验淋巴母细胞临床实验淋巴母细胞（lymphoid progenitor cells）是一类在造血系统中发挥重要作用的细胞。
它们具有多能干细胞的属性，可以分化为多种免疫细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。
淋巴母细胞在免疫功能的维护和调节中起到关键作用，对于免疫相关疾病的治疗具有广阔的应用潜力。
为了进一步研究淋巴母细胞的生物学特性及其在临床应用中的潜力，进行淋巴母细胞临床实验具有重要意义。
本文将介绍淋巴母细胞临床实验的一般流程和关键步骤，并探讨其在临床应用中的前景。
一、实验步骤（1）样本采集：从人体骨髓、外周血或胎盘血中采集样本，获取淋巴母细胞。
（2）细胞分离：通过离心、负选择或正选择等方法将淋巴母细胞从其他细胞中分离出来，保证实验的准确性。
（3）细胞培养：将分离得到的淋巴母细胞进行培养，提供适当的培养基和生长因子，促进细胞的增殖和分化。
（4）细胞鉴定：通过流式细胞术、免疫组化等方法，确定培养得到的细胞具有淋巴母细胞的特征。
（5）功能实验：进一步研究培养得到的淋巴母细胞的功能，如免疫反应、细胞信号传导等。
（6）评估效果：根据实验结果对淋巴母细胞的生物学特性进行评估，并探讨其在临床应用中的潜力。
二、临床应用前景淋巴母细胞临床应用前景广阔，主要体现在以下几个方面：（1）免疫治疗：淋巴母细胞可以分化为多种免疫细胞，如T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和抗感染的能力。
通过培养和扩增淋巴母细胞，可以为免疫缺陷病人提供治疗选择。
（2）器官移植：淋巴母细胞在器官移植中具有重要的免疫调节作用，能够预防和治疗移植后的免疫排斥反应。
将培养得到的淋巴母细胞应用于器官移植手术，有望提高移植成功率和术后生存率。
（3）疾病治疗：淋巴母细胞参与了多种免疫相关疾病的发生和发展过程，因此在这些疾病的治疗中具有潜在的应用价值。
例如，通过调节淋巴母细胞的功能和数量，可以有效治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病。
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③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些
④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
脾淋巴细胞的制备
将试验小鼠摘除眼球放血后，颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中5min；将小鼠固定于解剖板上，无菌打开腹部的皮肤，暴露腹膜，用眼科剪打开腹膜，小心取出脾脏；将脾脏置于已盛有10mL PBS的平皿中，轻轻洗涤并细心剥去周围结缔组织（此步可省略）；将脾脏移入200目铜网缝制的小袋中，用4号针头在脾脏表面扎几个针孔，然后用装在1mL注射器上的弯针头轻轻刮取脾脏，使脾细胞从针孔中溢出并透过铜网进入PBS中，再加入少许PBS，并用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；取脾淋巴细胞悬液1份，小心沿侧壁加入到2份的淋巴细胞分离液之液面上，以2000rpm离心10～20min；收集界面上的细胞（白色云雾层），放入8～9mL盛有Hank’s溶液的离心管中，混匀后，以1500～2000rpm离心5～10min；吸去上清液，沉淀经反复洗涤2次，即得所需的淋巴细胞；细胞计数，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度至2-5×10*6个/mL；铺板，将细胞悬液加到96孔细胞板中，100µL/孔。
ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
KEY WORDS Lycium barbarum polysaccharide; immunosuppression; Tlymphocyte subsets; tumorinfiltrating lymphocyte; dendritic cells
近年来的研究发现：肿瘤患者体内存在多种免疫逃逸机制，表现为CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值改变及肿瘤间质中的树突状细胞（dendritic cells, DCs）表型异常，这些都是导致恶性肿瘤细胞逃逸机体免疫监视从而造成肿瘤持续生长并发生转移的原因〔1,2〕。已有研究证实：枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）具有明显的免疫调节和免疫保护功能，可以增强机体的抗肿瘤作用〔3,4〕。但LBP抗肿瘤的作用机制究竟为何？是否与其影响免疫活性细胞的功能有关？如何从免疫逃逸的角度探讨LBP的抗肿瘤作用机制？有关这方面的研究却鲜见报道。本实验以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠为模型，研究LBP在全身给药情况下，对肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群及DCs的影响，从免疫逃逸的角度揭示LBP抗肿瘤作用的机制。
HE YanLi, YING Yi, XU YanLi, SU JunFang, LUO Hui, WANG HuiFeng
(Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 510405, China; Department of Hematology, Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China)
如何从小鼠的脾脏中提取T淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操
〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P<0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。
5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。
1材料与方法
1.1材料昆明种小鼠，清洁级，6～8周龄，体质量（18±2）g，雌雄各半，广州中医药大学动物中心提供，动物质量合格证号0002769；H22肝癌腹水型细胞株，中山大学医学院动物中心细胞库提供；LBP，由广州中医药大学药物化学研究所自宁夏枸杞子中提取，呈棕黄色粉末，纯度≥35%；Ⅳ型胶原酶和Ⅰ型DNase酶，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液，广州展晨生物科技有限公司产品；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的抗小鼠CD4、CD80（B71）单克隆抗体，藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的抗小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体，美国BioLegend公司产品；电子天平，日本岛津公司产品；FACS Vantage流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。
〔关键词〕枸杞多糖;免疫抑制;淋巴细胞亚群;肿瘤浸润淋巴细胞;树突状细胞
Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice
五、注意事项：
①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。
②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。
1.2实验动物及分组昆明种小鼠60只，随机分成4组：正常组、模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组，每组15只。其中后3个组，第1天右侧腋下接种2×106个H22肿瘤细胞。第3天起，前2个组小鼠予以生理盐水灌胃，0.5 ml/d；后2个组LBP给药剂量根据文献〔5〕结合预试验结果，分别给予LBP 0.625 g·kg1·d1及1.25 g·kg1·d1灌胃（均用生理盐水稀释成0.5 ml/d），连续灌胃14 d。
淋巴细胞提取
一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取
二实验对象：B／C小鼠
三实验器材：
1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基
④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
脾淋巴细胞的制备
将试验小鼠摘除眼球放血后，颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中5min；将小鼠固定于解剖板上，无菌打开腹部的皮肤，暴露腹膜，用眼科剪打开腹膜，小心取出脾脏；将脾脏置于已盛有10mL PBS的平皿中，轻轻洗涤并细心剥去周围结缔组织（此步可省略）；将脾脏移入200目铜网缝制的小袋中，用4号针头在脾脏表面扎几个针孔，然后用装在1mL注射器上的弯针头轻轻刮取脾脏，使脾细胞从针孔中溢出并透过铜网进入PBS中，再加入少许PBS，并用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；取脾淋巴细胞悬液1份，小心沿侧壁加入到2份的淋巴细胞分离液之液面上，以2000rpm离心10～20min；收集界面上的细胞（白色云雾层），放入8～9mL盛有Hank’s溶液的离心管中，混匀后，以1500～2000rpm离心5～10min；吸去上清液，沉淀经反复洗涤2次，即得所需的淋巴细胞；细胞计数，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度至2-5×10*6个/mL；铺板，将细胞悬液加到96孔细胞板中，100µL/孔。
ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
KEY WORDS Lycium barbarum polysaccharide; immunosuppression; Tlymphocyte subsets; tumorinfiltrating lymphocyte; dendritic cells
近年来的研究发现：肿瘤患者体内存在多种免疫逃逸机制，表现为CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值改变及肿瘤间质中的树突状细胞（dendritic cells, DCs）表型异常，这些都是导致恶性肿瘤细胞逃逸机体免疫监视从而造成肿瘤持续生长并发生转移的原因〔1,2〕。已有研究证实：枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）具有明显的免疫调节和免疫保护功能，可以增强机体的抗肿瘤作用〔3,4〕。但LBP抗肿瘤的作用机制究竟为何？是否与其影响免疫活性细胞的功能有关？如何从免疫逃逸的角度探讨LBP的抗肿瘤作用机制？有关这方面的研究却鲜见报道。本实验以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠为模型，研究LBP在全身给药情况下，对肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群及DCs的影响，从免疫逃逸的角度揭示LBP抗肿瘤作用的机制。
HE YanLi, YING Yi, XU YanLi, SU JunFang, LUO Hui, WANG HuiFeng
(Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 510405, China; Department of Hematology, Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China)
如何从小鼠的脾脏中提取T淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操
〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P<0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。
5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。
1材料与方法
1.1材料昆明种小鼠，清洁级，6～8周龄，体质量（18±2）g，雌雄各半，广州中医药大学动物中心提供，动物质量合格证号0002769；H22肝癌腹水型细胞株，中山大学医学院动物中心细胞库提供；LBP，由广州中医药大学药物化学研究所自宁夏枸杞子中提取，呈棕黄色粉末，纯度≥35%；Ⅳ型胶原酶和Ⅰ型DNase酶，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液，广州展晨生物科技有限公司产品；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的抗小鼠CD4、CD80（B71）单克隆抗体，藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的抗小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体，美国BioLegend公司产品；电子天平，日本岛津公司产品；FACS Vantage流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。
〔关键词〕枸杞多糖;免疫抑制;淋巴细胞亚群;肿瘤浸润淋巴细胞;树突状细胞
Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice
五、注意事项：
①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。
②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。
1.2实验动物及分组昆明种小鼠60只，随机分成4组：正常组、模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组，每组15只。其中后3个组，第1天右侧腋下接种2×106个H22肿瘤细胞。第3天起，前2个组小鼠予以生理盐水灌胃，0.5 ml/d；后2个组LBP给药剂量根据文献〔5〕结合预试验结果，分别给予LBP 0.625 g·kg1·d1及1.25 g·kg1·d1灌胃（均用生理盐水稀释成0.5 ml/d），连续灌胃14 d。
淋巴细胞提取
一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取
二实验对象：B／C小鼠
三实验器材：
1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基