T淋巴细胞提取
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1.4肿瘤间质淋巴细胞的分离肿瘤组织称重后，挑选瘤体质量≥2 g者置于含青霉素和链霉素各500 U/ml、甲硝唑5 μg/ml的RPMI1640培养液中浸泡30 min后，将瘤体剪成1 mm3大小，置于含0.05%Ⅳ型胶原酶、0.003%Ⅰ型DNase酶及10%小牛血清的RPMI1640培养液中，4℃磁力搅拌过夜消化，200目消毒铜网过滤洗涤后，1 500 r/min离心15 min，分离获得肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL），用DHanks液洗涤2次，台盼蓝染色检测细胞活力，调整细胞浓度至1×106/ml。
五、注意事项：
①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。
②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。
淋巴细胞提取
一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取
二实验对象：B／C小鼠
三实验器材：
1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基
2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台
〔关键词〕枸杞多糖;免疫抑制;淋巴细胞亚群;肿瘤浸润淋巴细胞;树突状细胞
Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice
HE YanLi, YING Yi, XU YanLi, SU JunFang, LUO Hui, WANG HuiFeng
(Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 510405, China; Department of Hematology, Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China)
③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些
④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
脾淋巴细胞的Βιβλιοθήκη Baidu备
将试验小鼠摘除眼球放血后，颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中5min；将小鼠固定于解剖板上，无菌打开腹部的皮肤，暴露腹膜，用眼科剪打开腹膜，小心取出脾脏；将脾脏置于已盛有10mL PBS的平皿中，轻轻洗涤并细心剥去周围结缔组织（此步可省略）；将脾脏移入200目铜网缝制的小袋中，用4号针头在脾脏表面扎几个针孔，然后用装在1mL注射器上的弯针头轻轻刮取脾脏，使脾细胞从针孔中溢出并透过铜网进入PBS中，再加入少许PBS，并用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；取脾淋巴细胞悬液1份，小心沿侧壁加入到2份的淋巴细胞分离液之液面上，以2000rpm离心10～20min；收集界面上的细胞（白色云雾层），放入8～9mL盛有Hank’s溶液的离心管中，混匀后，以1500～2000rpm离心5～10min；吸去上清液，沉淀经反复洗涤2次，即得所需的淋巴细胞；细胞计数，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度至2-5×10*6个/mL；铺板，将细胞悬液加到96孔细胞板中，100µL/孔。
1.2实验动物及分组昆明种小鼠60只，随机分成4组：正常组、模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组，每组15只。其中后3个组，第1天右侧腋下接种2×106个H22肿瘤细胞。第3天起，前2个组小鼠予以生理盐水灌胃，0.5 ml/d；后2个组LBP给药剂量根据文献〔5〕结合预试验结果，分别给予LBP 0.625 g·kg1·d1及1.25 g·kg1·d1灌胃（均用生理盐水稀释成0.5 ml/d），连续灌胃14 d。
1.3LBP体内抑瘤率的测定每日观察并记录小鼠生长情况及肿瘤大小，第15天小鼠眼球放血后予以脱颈处死，解剖并观察肿瘤大小及重量，计算肿瘤生长抑制率：局部肿瘤的生长抑制率=（模型组平均瘤重－LBP组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。所有动物均摘取胸腺称重，计算胸腺指数（胸腺指数＝小鼠胸腺质量/体质量）。
1材料与方法
1.1材料昆明种小鼠，清洁级，6～8周龄，体质量（18±2）g，雌雄各半，广州中医药大学动物中心提供，动物质量合格证号0002769；H22肝癌腹水型细胞株，中山大学医学院动物中心细胞库提供；LBP，由广州中医药大学药物化学研究所自宁夏枸杞子中提取，呈棕黄色粉末，纯度≥35%；Ⅳ型胶原酶和Ⅰ型DNase酶，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液，广州展晨生物科技有限公司产品；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的抗小鼠CD4、CD80（B71）单克隆抗体，藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的抗小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体，美国BioLegend公司产品；电子天平，日本岛津公司产品；FACS Vantage流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。
如何从小鼠的脾脏中提取T淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操作步骤
枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响
〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P<0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
KEY WORDS Lycium barbarum polysaccharide; immunosuppression; Tlymphocyte subsets; tumorinfiltrating lymphocyte; dendritic cells
近年来的研究发现：肿瘤患者体内存在多种免疫逃逸机制，表现为CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值改变及肿瘤间质中的树突状细胞（dendritic cells, DCs）表型异常，这些都是导致恶性肿瘤细胞逃逸机体免疫监视从而造成肿瘤持续生长并发生转移的原因〔1,2〕。已有研究证实：枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）具有明显的免疫调节和免疫保护功能，可以增强机体的抗肿瘤作用〔3,4〕。但LBP抗肿瘤的作用机制究竟为何？是否与其影响免疫活性细胞的功能有关？如何从免疫逃逸的角度探讨LBP的抗肿瘤作用机制？有关这方面的研究却鲜见报道。本实验以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠为模型，研究LBP在全身给药情况下，对肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群及DCs的影响，从免疫逃逸的角度揭示LBP抗肿瘤作用的机制。
四实验步骤：
1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。
2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。
3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）
ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。
5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。
五、注意事项：
①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。
②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。
淋巴细胞提取
一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取
二实验对象：B／C小鼠
三实验器材：
1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基
2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台
〔关键词〕枸杞多糖;免疫抑制;淋巴细胞亚群;肿瘤浸润淋巴细胞;树突状细胞
Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice
HE YanLi, YING Yi, XU YanLi, SU JunFang, LUO Hui, WANG HuiFeng
(Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 510405, China; Department of Hematology, Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China)
③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些
④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
脾淋巴细胞的Βιβλιοθήκη Baidu备
将试验小鼠摘除眼球放血后，颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中5min；将小鼠固定于解剖板上，无菌打开腹部的皮肤，暴露腹膜，用眼科剪打开腹膜，小心取出脾脏；将脾脏置于已盛有10mL PBS的平皿中，轻轻洗涤并细心剥去周围结缔组织（此步可省略）；将脾脏移入200目铜网缝制的小袋中，用4号针头在脾脏表面扎几个针孔，然后用装在1mL注射器上的弯针头轻轻刮取脾脏，使脾细胞从针孔中溢出并透过铜网进入PBS中，再加入少许PBS，并用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；取脾淋巴细胞悬液1份，小心沿侧壁加入到2份的淋巴细胞分离液之液面上，以2000rpm离心10～20min；收集界面上的细胞（白色云雾层），放入8～9mL盛有Hank’s溶液的离心管中，混匀后，以1500～2000rpm离心5～10min；吸去上清液，沉淀经反复洗涤2次，即得所需的淋巴细胞；细胞计数，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度至2-5×10*6个/mL；铺板，将细胞悬液加到96孔细胞板中，100µL/孔。
1.2实验动物及分组昆明种小鼠60只，随机分成4组：正常组、模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组，每组15只。其中后3个组，第1天右侧腋下接种2×106个H22肿瘤细胞。第3天起，前2个组小鼠予以生理盐水灌胃，0.5 ml/d；后2个组LBP给药剂量根据文献〔5〕结合预试验结果，分别给予LBP 0.625 g·kg1·d1及1.25 g·kg1·d1灌胃（均用生理盐水稀释成0.5 ml/d），连续灌胃14 d。
1.3LBP体内抑瘤率的测定每日观察并记录小鼠生长情况及肿瘤大小，第15天小鼠眼球放血后予以脱颈处死，解剖并观察肿瘤大小及重量，计算肿瘤生长抑制率：局部肿瘤的生长抑制率=（模型组平均瘤重－LBP组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。所有动物均摘取胸腺称重，计算胸腺指数（胸腺指数＝小鼠胸腺质量/体质量）。
1材料与方法
1.1材料昆明种小鼠，清洁级，6～8周龄，体质量（18±2）g，雌雄各半，广州中医药大学动物中心提供，动物质量合格证号0002769；H22肝癌腹水型细胞株，中山大学医学院动物中心细胞库提供；LBP，由广州中医药大学药物化学研究所自宁夏枸杞子中提取，呈棕黄色粉末，纯度≥35%；Ⅳ型胶原酶和Ⅰ型DNase酶，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液，广州展晨生物科技有限公司产品；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的抗小鼠CD4、CD80（B71）单克隆抗体，藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的抗小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体，美国BioLegend公司产品；电子天平，日本岛津公司产品；FACS Vantage流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。
如何从小鼠的脾脏中提取T淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操作步骤
枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响
〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P<0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
KEY WORDS Lycium barbarum polysaccharide; immunosuppression; Tlymphocyte subsets; tumorinfiltrating lymphocyte; dendritic cells
近年来的研究发现：肿瘤患者体内存在多种免疫逃逸机制，表现为CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值改变及肿瘤间质中的树突状细胞（dendritic cells, DCs）表型异常，这些都是导致恶性肿瘤细胞逃逸机体免疫监视从而造成肿瘤持续生长并发生转移的原因〔1,2〕。已有研究证实：枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）具有明显的免疫调节和免疫保护功能，可以增强机体的抗肿瘤作用〔3,4〕。但LBP抗肿瘤的作用机制究竟为何？是否与其影响免疫活性细胞的功能有关？如何从免疫逃逸的角度探讨LBP的抗肿瘤作用机制？有关这方面的研究却鲜见报道。本实验以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠为模型，研究LBP在全身给药情况下，对肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群及DCs的影响，从免疫逃逸的角度揭示LBP抗肿瘤作用的机制。
四实验步骤：
1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。
2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。
3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）
ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。
5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。