【CN110016462A】从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法【专利】

脾脏提取DNA与人类白细胞抗原配型实验方法★李海滨;郭海鸽;蔡文娥;覃音红;孙煦勇【摘要】BACKGROUND: Whether human leukocyte antigen matching results are accurate or not may directly affect the pairing choice between the donors and recipients. Moreover, the quality of the matching samples may influence the pros and cons of the results. OBJECTIVE: To establish an experimental technology platform for DNA extraction from the spleen in human leukocyte antigen matching. METHODS: Lymphocytes were isolated and DNA was extracted from the spleen for the human leukocyte antigen matching, compared with DNA extracted from the whole blood which was normal peripheral blood or hematolytic sample. RESULTS AND CONCLUSION: Intact electrophoretogram of DNA extracted from the spleen and normal peripheral blood was obtained after amplification and electrophoresis, and the electrophoretogram of DNA extracted from spleen was clearer than that extracted from the normal peripheral blood. However, the intact electrophoretogram of DNA extracted from hematolytic sample was not obtained. An experimental technology platform for DNA extraction from the spleen in human leukocyte antigen matching has been successful y established.% 背景：人类白细胞抗原配型结果报告准确与否，直接影响供受者之间的配对选择，而配型样本的好坏则影响结果的优劣。

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。

２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。

室温水平离心2000转/分钟，30分钟。

３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。

吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。

４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。

方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。

加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。

红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。

1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。

2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。

3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。

75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。

（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。

（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。

（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。

小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1. 熟悉细胞分离的基本原理2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。

丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。

通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。

2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。

人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。

三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0.2%台盼蓝染液8.显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。

2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。

（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。

用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。

弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。

然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。

(放置冰上)4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。

临床检验免疫主管 (14)临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术第一节免疫细胞的分离第二节淋巴细胞标志及亚群分类第三节其他的免疫细胞第四节免疫细胞表面标志的检测及应用第一节免疫细胞的分离一.外周血单个核细胞的分离将2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液与1份34%泛影葡胺生理盐水溶液混合，其比重为1.077±0.002，可作为常规的淋巴细胞分离液，即Ficoll分离液。

主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层.单个核细胞层.粒细胞层和红细胞层。

二.淋巴细胞的分离纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca2＋存在时，能主动黏附在玻璃.塑料.尼龙毛.棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。

1.黏附贴壁法2.吸附柱过滤法3.磁铁吸引法4.Percoll分离液法三.T细胞和B细胞的分离1.E花环沉降法2.尼龙毛柱分离法四.T细胞亚群的分离1.亲和板结合分离法2.磁性微球分离法3.荧光激活细胞分离仪分离法五.分离细胞的保存1.短期保存技术将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks.Tc-199.RPMI1640或其他培养液稀释重悬。

短期保存可置于4℃保存。

2.长期保存技术液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。

六.分离细胞的活力测定活力测定最简便常用的为台盼蓝染色法。

这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。

七.不同细胞分离方法的综合评价早期的免疫细胞分离技术主要是根据不同免疫细胞的物理属性（如比重不同）和生物学属性（如黏附力不同）进行分离，用目前的标准看，其分离的灵敏度或分辨率都不高。

小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1。

熟悉细胞分离的基本原理2。

掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3。

掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞,胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。

丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。

通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。

2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官.人的脾脏位于左季肋区的后外侧部,呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。

三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0。

2%台盼蓝染液8。

显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死-—用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉,使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。

2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤,剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织.（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。

用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中;2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。

弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。

然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀,加PBS缓冲液至2ml,吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。

(放置冰上）4.取100uL至EP管中,进行计数和活力测定（建议5倍稀释)5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。

红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。

1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。

2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。

3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。

75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。

（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。

（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。

（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。

第一章测试1.免疫防御功能过低或缺如，可发生肿瘤。

A:错B:对答案:A2.免疫监视是随时发现和清除体内出现的“非己” 成分，如由基因突变而发生的肿瘤细胞。

A:错B:对答案:B3.固有免疫是适应性免疫的先决条件和启动因素。

A:错B:对答案:B4.适应性免疫应答可分为哪几个阶段？A:识别阶段B:活化增值阶段C:产物生成阶段D:诱导阶段E:效应阶段答案:ABE5.与固有免疫相比，适应性免疫有哪几个主要特点？A:特异性B:放大性C:耐受性D:记忆性E:敏感性答案:ACD6.用牛痘苗预防天花是下列哪个科学家发现的？A:MacFarlane BurnetB:Robert KochC:Edward JennerD:PasteurE:George Snell答案:C7.固有免疫的特点包括（）A:快速B:早期C:需抗原激发D:先天性E:记忆性答案:ABD8.克隆选择学说是下列哪个科学家提出的？A:MacFarlane BurnetB:PasteurC:George SnellD:Edward JennerE:Robert Koch答案:A9.适应性免疫的特点包括（）A:快速B:记忆性C:先天性D:后期E:需接触抗原答案:BDE10.下列哪位科学家在1901年获得第一届诺贝尔生理学或医学奖？A:George SnellB:Robert KochC:Mark DavisD:von BehringE:Pasteur答案:D第二章测试1.骨髓是体液免疫应答发生的场所。

A:对B:错答案:A2.T细胞约占淋巴结内淋巴细胞总数的60%。

A:错B:对答案:A3.脾脏主要对淋巴液起过滤作用。

A:对B:错答案:B4.M细胞主要分布于肠道派氏集合淋巴结内。

A:错B:对答案:B5.淋巴结的功能有（）A:产生免疫耐受B:免疫调节作用C:参与淋巴细胞再循环D:免疫应答的场所E:B细胞定居的场所答案:CDE6.脾脏的功能有（）A:参与淋巴细胞再循环B:过滤作用C:T细胞定居的场所D:免疫调节作用E:合成生物活性物质答案:ABCDE7.上皮内淋巴细胞（IEL）主要是()A:NKTB:αβT细胞C:Th1D:DCE:γδT细胞答案:E8.淋巴结内与淋巴细胞再循环有关的结构是（）A:浅皮质区B:髓质区C:生发中心D:淋巴小结E:HEV答案:E9.脾脏白髓的组成（）A:浅皮质区B:脾小结C:边缘区D:HEVE:动脉周围淋巴鞘答案:BCE10.M细胞的特点（）A:不能分泌消化酶和黏液B:细胞核位于基底部C:其顶部胞质较厚D:特化的抗原吞噬细胞E:无微绒毛答案:ABE第四章测试1.木瓜蛋白酶水解Ig后可获得1个F（ab’）2片段和一些小片段pFc’。

免疫细胞的分离及其表面标志检测技术题库1、[单选,A2型题,A1/A2型题]从单个核细胞中去除单核细胞最便捷的方法是（）A.E花环沉淀法B.尼龙棉吸附法C.亲和板结合法D.黏附贴壁法E.免疫磁珠2、[单选,A2型题,A1/A2型题]能长期保存分离细胞的方法是（）A.含10%～20%灭活小牛血清的HanksB.液氮深低温（-196℃）保存C.Tc-199D.RPMI1640E.4℃保存3、[单选,A2型题,A1/A2型题]哪一种分化抗原又称作绵羊红细胞受体（）A.CD2B.CD3CD4D.CD8E.CD284、[单选,A2型题,A1/A2型题]细胞毒T细胞的标志性抗原为（）A.CD3+、CD4+、CD8+B.CD3+、CD4+、CD8-CD3+、CD4+、CD25+D.CD3-、CD4-、CD8+E.CD3+、CD4-、CD8+5、[单选,A2型题,A1/A2型题]单核巨噬细胞的典型的表面标志是（）A.CD2B.CD3CD14D.CD16E.CD286、[单选,A2型题,A1/A2型题]免疫细胞表面标志的检测方法包括（）A.抗体致敏细胞花环法B.免疫细胞化学法C.免疫荧光法D.流式细胞分析法E.以上均是7、[单选,A2型题,A1/A2型题]淋巴细胞活力的表示常用（）A.活细胞占总细胞的百分比B.活细胞浓度C.淋巴细胞浓度D.活细胞与总细胞的比值E.白细胞浓度8、[单选,A2型题,A1/A2型题]经台盼兰染色后，活细胞呈（）A.蓝色B.不着色C.紫色D.红色E.绿色9、[单选,A2型题,A1/A2型题]利用CD3McAb致敏红细胞做玫瑰花环试验，主要用来检测（）A.T细胞B细胞C.单核细胞D.树突细胞E.中性粒细胞10、[单选,A2型题,A1/A2型题]能长期保存分离细胞的方法是（）A.含10%～20%灭活小牛血清的HanksB.液氮深低温（-196℃）保存C.Tc-199D.RPMI1640E.4℃保存11、[单选,A2型题,A1/A2型题]哪一种分化抗原又称作绵羊红细胞受体（）A.CD2B.CD3CD4D.CD8E.CD2812、[单选,A2型题,A1/A2型题]细胞毒T细胞的标志性抗原为（）A.CD3+、CD4+、CD8+B.CD3+、CD4+、CD8-CD3+、CD4+、CD25+D.CD3-、CD4-、CD8+E.CD3+、CD4-、CD8+[单选,A2型题,A1/A2型题]单核巨噬细胞的典型的表面标志是（）A.CD2B.CD3CD14D.CD16E.CD28１４、［单选］规划说明书是对规划文本的（）Ａ、具体解释Ｂ、操作指南Ｃ、编制依据Ｄ、规划实施要求/doc/61189678.html,/ 优游 ub815：[单选,A2型题,A1/A2型题]免疫细胞表面标志的检测方法包括（）A.抗体致敏细胞花环法B.免疫细胞化学法C.免疫荧光法D.流式细胞分析法E.以上均是16、[单选,A2型题,A1/A2型题]淋巴细胞活力的表示常用（）A.活细胞占总细胞的百分比B.活细胞浓度C.淋巴细胞浓度D.活细胞与总细胞的比值E.白细胞浓度17、[单选,A2型题,A1/A2型题]经台盼兰染色后，活细胞呈（）A.蓝色C.紫色D.红色E.绿色。

2021医疗招聘考试检验学资料：淋巴细胞的分离
淋巴细胞属于非常重要的一种免疫细胞，当然除此之外，单核细胞也在整个免疫作用的发挥中扮演着不可或缺的角色。

我们把二者合称之为：单个核细胞。

那我们若想要获得单一的淋巴细胞，如何把二者进行纯化呢?
这里我们用到以下三种方法，分别是粘附贴壁法、吸附柱过滤法、磁铁吸引法。

接下来我们针对这三种方法进行讲解看看具体是如何操作的。

在讲解之前，先提示大家一下，这三种方法都利用了单核细胞“死皮赖脸”的特点，那具体是如何赖皮，请看以下讲述——
一、粘附贴壁法
我们将单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，37℃温箱静置1h 左右，这时候你会发现，“死皮赖脸”的单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎为纯淋巴细胞，随后用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。

那么此时就达到一个分离的效果。

但注意因为B细胞也有贴壁现象，分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。

二、吸附柱过滤法
同样将单个核细胞注入柱层中，单核发挥其“死皮赖脸”的优势，赖在柱层上不肯下来，我们进行柱层洗脱，那么能洗脱下来的就是淋巴细胞。

三、磁铁吸引法
前面一直说单核细胞“死皮赖脸”，到这一方法还多了一个特点——“贪吃”。

利用单核细胞具有吞噬的特性，我们在单个核细胞悬液中加入羰基铁颗粒，那么单核细胞就会“吃掉”这些铁颗粒，我们在管底放一磁铁，那么能被吸至管底的就是吞噬了铁颗粒的单核细胞，显然上层就是淋巴细胞。

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞之勘阻及广创作
１小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉流露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。

无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。

２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。

选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。

个人用1500转/分钟，20分钟。

３离心后取出试管，可以看到分歧的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。

吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。

４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。

一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的未几，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗而且用力挤压，这样得到的就是B细胞。

得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培养或做它用。

但是淋巴细胞
分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。