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生物素-亲和素免疫放大技术哎呀，说起生物素-亲和素免疫放大技术，这玩意儿听起来挺高大上的，其实吧，它就像是我们生活中的超级胶水，只不过它粘的是分子，不是家具。
记得有一次，我在实验室里，跟这技术打了个照面。
那天，我正忙着准备实验，手里拿着那些小小的试管，里面装着各种颜色的液体。
你知道的，实验室里那些试管，总是让人眼花缭乱，一不小心就弄混了。
我得说，生物素和亲和素这对搭档，它们就像是实验室里的“最佳拍档”。
生物素，这家伙长得有点像维生素，但它的本事可大着呢。
亲和素呢，它是一种蛋白质，来自鸡蛋清，对生物素特别有感觉，一见到就粘上去，甩都甩不掉。
那天实验，我就是要用这对“最佳拍档”来放大信号。
你想想，有时候我们检测的东西太少了，肉眼根本看不出来，这时候就需要放大技术来帮忙。
就像是你用手机拍照，但是光线太暗，拍不清楚，你就得调高ISO，让照片亮一点，看得清楚一点。
我先把生物素标记在我想要检测的分子上，然后加入亲和素。
亲和素一碰到生物素，就像是找到了失散多年的兄弟，紧紧抱在一起。
这样，原本微小的信号就被放大了，我用仪器一测，嘿，清晰得很！但是，这个过程也不是一帆风顺的。
有时候，亲和素和生物素的反应不够强烈，或者有其他分子来捣乱，这时候就得调整条件，比如温度啊、pH值啊，就像是做菜，火候和调料都得刚刚好。
我记得那次实验，我调整了好久，才找到最佳条件。
那时候，我的心情就像是在等待一锅汤慢慢炖好，既期待又紧张。
终于，当我看到那些清晰的信号时，那种成就感，就像是中了彩票一样。
所以啊，生物素-亲和素免疫放大技术，虽然听起来复杂，但其实它就像是我们生活中的小工具，帮助我们更好地理解和探索这个世界。
它让我们能够看到那些微小的东西，就像是用显微镜观察蚂蚁搬家，既神奇又有趣。
总之，这项技术就像是实验室里的超级胶水，虽然不起眼，但没了它，很多实验都做不成。
下次你听到生物素-亲和素免疫放大技术，不妨想想我今天给你讲的这个故事，也许会让你对它有更深的理解。
生物素亲和素系统的特点生物素亲和素系统是一种重要的蛋白质相互作用系统，其特点是高度特异性、高亲和力和可逆性。
它在生物学研究和生物工程中有着广泛的应用。
生物素亲和素系统是由生物素和生物素结合蛋白（biotin-binding protein）相互作用而形成的。
生物素是一种小分子有机物，是一种维生素B7，也称为维生素H。
生物素结合蛋白是一种特异性结合生物素的蛋白质，它存在于许多生物中，包括细菌、真菌、植物和动物。
生物素亲和素系统的特点主要有以下几个方面。
1. 高度特异性：生物素亲和素系统的结合是高度特异的，即只有生物素与生物素结合蛋白之间的相互作用才能发生。
这种特异性是由于生物素与生物素结合蛋白之间的非共价相互作用，如氢键、疏水相互作用和离子相互作用等。
这种特异性使得生物素亲和素系统在生物学研究和生物工程中能够准确地识别和分离目标蛋白。
2. 高亲和力：生物素与生物素结合蛋白之间的结合具有很高的亲和力。
生物素与生物素结合蛋白之间的结合常数（Kd）通常在纳摩尔或皮摩尔级别，表明它们之间的结合是非常紧密的。
这种高亲和力使得生物素亲和素系统能够在生物样品中高效地捕获目标蛋白，并且能够通过洗脱等步骤将非特异性结合的蛋白去除，从而实现对目标蛋白的高纯度分离。
3. 可逆性：生物素与生物素结合蛋白之间的结合是可逆的。
这意味着在适当的条件下，生物素与生物素结合蛋白之间的结合可以被打破，从而使得目标蛋白得以释放。
这种可逆性使得生物素亲和素系统能够在目标蛋白的纯化和分析过程中进行多次结合和释放，提高了操作的灵活性和效率。
生物素亲和素系统的应用非常广泛，主要包括以下几个方面。
1. 蛋白质纯化：生物素亲和素系统可以通过生物素与目标蛋白的特异结合来实现对目标蛋白的高效纯化。
在蛋白质纯化过程中，通常将生物素结合到目标蛋白上，然后使用生物素亲和素树脂等介质将目标蛋白捕获，最后通过洗脱步骤将纯的目标蛋白分离出来。
2. 蛋白质相互作用研究：生物素亲和素系统可以用于研究蛋白质之间的相互作用。
生物素亲和素用于荧光免疫下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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ELISA方法的基本原理和操作步骤自己收藏的觉得很有用故上传到百度与大家一起分享！ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assayELISA）用于IgG定量测定的文章使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性又保留酶的活性在测定时把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例加入酶反应的底物后底物被酶催化变为有色产物产物的量与标本中受检物质的量直接相关故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析由于酶的催化频率很高故可极大地地放大反应效果从而使测定方法达到很高的敏感度方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原也可用于测定抗体在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体②酶标记的抗原或抗体③酶作用的底物根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件可设计出各种不同类型的检测方法（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合形成固相抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合彻底洗涤未结合的酶标抗体此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量根据同样原理将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）这种双位点一步不但简化了操作缩短了反应时间如应用高亲和力的单克隆抗体测定的敏感性和特异性也显著提高单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS在一步法测定中应注意钩状效应（hookeffect）类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象当标本中待测抗原浓度相当高时过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合而不再形成夹心复合物所得结果将低于实际含量钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体故称为间接法操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合形成固相抗原抗体复合物经洗涤后固相载体上只留下特异性抗体其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合在洗涤过程中被洗去（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合从而使该抗体间接地标记上酶洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量例如欲测人对某种疾病的抗体可用酶标羊抗人IgG抗体（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量本法只要更换不同的固相抗原可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体（四）竞争法竞争法可用于测定抗原也可用于测定抗体以测定抗原为例受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液使之与固相抗体反应如受检标本中无抗原则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合如受检标本中含有抗原则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会使酶标抗原与固相载体的结合量减少参考管中只加酶标抗原保温后酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量洗涤（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多故颜色最深参考管颜色深度与待测管颜色深度之差代表受检标本抗原的量待测管颜色越淡表示标本中抗原含量越多（五）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在后者会干扰IgM抗体的测定因此测定IgM抗本多用捕获法先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上在去除IgG后再测定特异性IgM操作步骤如下：（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上形成固相抗人IgM洗涤（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合洗涤（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合洗涤（5）加底物显色：如有颜色显示则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在是为阳性反应（六）应用亲和素和生物素的ELISA亲和素是一种糖蛋白可由蛋清中提取分子量60kD每个分子由4个亚基组成可以和4个生物素分子亲密结合现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）生物素（biotin）又称维生素H分子量244.31存在于蛋黄中用化学方法制成的衍生物生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimideBNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物亲和素与生物素的结合虽不属免疫反应但特异性强亲和力大两者一经结合就极为稳定由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置可以连接更多的生物素化的分子形成一种类似晶格的复合体因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来就可大提高ELISA的敏感度亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式可用于间接包被亦可用于终反应放大可以在固相上先预包被亲和素原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量而且使其结合点充分暴露另外在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代然后连接亲和素－酶结合物以放大反应信号ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性又保留酶的活性在测定时受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开再加入酶标记的抗原或抗体也通过反应而结合在固相载体上此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例加入酶反应的底物后底物被酶催化成为有色产物产物的量与标本中受检物质的量直接相关故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析由于酶的催化效率很高间接地放大了免疫反应的结果使测定方法达到很高的敏感度二、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原也可用于测定抗体在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体称为"酶联物"、"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件可设计出各种不同类型的检测方法用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质（2）加受检标本保温反应标本中的抗原与固相抗体结合形成固相抗原抗体复合物洗涤除去其他未结合物质（3）加酶标抗体保温反应固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合彻底洗涤未结合的酶标抗体此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关（4）加底物显色固相上的酶催化底物成为有色产物通过比色测知标本中抗原的量在临床检验中此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等只要获得针对受检抗原的异性抗体就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法如抗体的来源为抗血清包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物如应用单克隆抗体一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗分别用于包被固相载体和制备酶结合物这种双位点夹心法具有很高的特异性而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应作一步法检测在一步法测定中当标本中受检抗原的含量很高时过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合而不再形成"夹心复合物"类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同如按常法测读所得结果将低于实际的含量这种现象被称为钩状效应（hook effect）因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落钩状效应严重时反应甚至可不显色而出现假阴性结果因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时应注意可测范围的最高值用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇例如HBsAg的a决定簇也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物但在HBsAg的检测中应注意亚型问题HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性这也是用单抗作夹心法应注意的问题双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰RF是一种自身抗体多为IgM型能和多种动物IgG的Fc段结合用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF它可充当抗原成份同时与固相抗体和酶标抗体结合表现出假阳性反应采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂由于去除了Fc段从而可消除RF的干扰双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原因其不能形成两位点夹心（二）双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似用特异性抗原进行包被和制备酶结合物以检测相应的抗体与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体此法中受检标本不需稀释可直接用于测定因此其敏感度相对高于间接法乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法本法关键在于酶标抗原的制备应根据抗原结构的不同寻找合适的标记方法（三）间接法测抗体(我公司分装TORCH及传染病试剂盒大多采用本法)间接法是检测抗体常用的方法其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体故称为间接法（见图2-3）操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体联结形成固相抗原洗涤除去未结合的抗原及杂质（2）加稀释的受检血清保温反应血清中的特异抗体与固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物经洗涤后固相载体上只留下特异性抗体血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去（3）加酶标抗抗体可用酶标抗人Ig以检测总抗体但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合从而间接地标记上酶洗涤后固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关（4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法间接法成功的关键在于抗原的纯度虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果但应尽可能予以纯化以提高试验的特异性特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质例如以E.Coli为工程酶的重组抗原如其中含有E.Coli成份很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质例如来自人血浆或人体组织的抗原如不将其中的Ig去除试验中也发生假阳性反应另外如抗原中含有无关蛋白也会因竟争吸附而影响包被效果间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分IgG的吸附性很强非特异IgG可直接吸附到固相载体上有时也可吸附到包被抗原的表面因此在间接法中抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次以封闭（blocking）固相上的空余间隙另外在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200）以避免过高的阴性本底影响结果的判断（四）竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去或不易得到足够的纯化抗原时可用此法检测特异性抗体其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合标本中抗体量越多结合在固相上的酶标抗体愈少因此阳性反应呈色浅于阴性反应如抗原为高纯度的可直接包被固相如抗原中会有干扰物质直接包被不易成功可采用捕获包被法即先包被与固相抗原相应的抗体然后加入抗原形成固相抗原洗涤除去抗原中的杂质然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应竞争法测抗体有多种模式可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合抗HBc ELISA一般采用此法另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合洗涤后再加入酶标抗体与结合在固相上的抗原反应抗HBe的检测一般采用此法（五）竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点因此不能用双抗体夹心法进行测定可以采用竞争法模式其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合标本中抗原量含量愈多结合在固相上的酶标抗原愈少最后的显色也愈浅小分子激素、药物等ELISA测定多用此法（六）捕获包被法测抗体（经典方法）IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上因此如用抗人IgM作为二抗间接测定IgM抗体必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理以除去IgG的干扰在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法先用抗人IgM抗体包被固相以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）然后加入抗原此抗原仅与特异性IgM相结合继而加酶标记针对抗原的特异性抗体再与底物作用呈色即与标本中的IgM成正相关此法常用于病毒性感染的早期诊断甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式见图2-7.类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体导致假阳性反应因此中和IgG的间接法近来颇受青睐用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功（七）ABS-ELISA法ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语亲和素是一种糖蛋白分子量60000每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成生物素为小分子化合物分子量244.用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物标记方法颇为简便生物素与亲和素的结合具有很强的特异性其亲和力较抗原抗体反应大得多两者一经结合就极为稳定由于一个亲和素可与4个生物素分子结合因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）在LAB中固相生物素先与不标记的亲和素反应然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度在早期亲和素从蛋清中提取这种卵亲和素为碱性糖蛋白与聚苯乙烯载体的吸附性很强用于ELISA中可使本底增高从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点在ELISA应用中有替代前者的趋势由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂增加了操作步骤在临床检验中ABS-ELISA应用不多科研项目中检测微量的成分如细胞因子常采用本法ELISA试剂的临床质量评价点击次数：48 发表于：2008-08-04 13:25 转载请注明来自丁香园来源：丁香园ELISA试剂的评价（evaluation）分两个方面：一是试剂本身的质量评价符合一定要求后才能生产供应；一是在临床应用中效果的评价以肝炎ELISA诊断试剂为例首先必须通过中国药品生物制品检定以得到生产的许可检定内容除包装、标签、说明书等外对试剂的性能如特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项检定通过对一系列参比品的检测结果符合要求者才为合格ELISA试剂的临床质量评价是用该试剂对临床样本进行检测以观察其实际应用价值部临检中心对乙肝ELISA诊断试剂在这方面进行了工作通过质量评价促进了试剂质量的提高一、诊断试剂临床质量评价要点从临床应用角度考核检验试剂的可靠性是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的目前还很难找到100%可靠的试验任何试验都会出现假阳性或假阴性判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为考核标准临床应用的灵敏度用疾病患者试验阳性的百分率表示特异性以无病者试验阴性的百分率表示进行这种评价首先需要收集有关的病人血清然后用公认的检测该项标志物最可靠的试剂进行测定以确定其为阳性或阴性这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"（panel）被评价的试剂测定此血清所得结果与血清盘标明的结果的关系如下表：血清盘结果合计＋－受检试剂结果＋ a b a+b － c d c+d 合计a+c b+d A+b+c+d 表中a为真阳性b为假阳性c为假阴性d为真阴性被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算：灵敏度(%)=a/(a+c)×100%特异性(%)=b/(b+d)×100%符合率(%)=(a+d)/(a+b+c+d) ×100%一般认为灵敏度或特异性>90%为良好符合率是综合灵敏度和特异性的指标二、临床考核血清盘的制备要求1、采用人的原血清；2、血清盘应具有相应的稳定性；3、血清盘中样本不含防腐剂或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂；4、血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半；5、阳性样本中应有一定数量的强阳性和弱阳性样本；6、血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品以检验试剂的灵敏度7、血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质（RF因子）的样本以检验试剂的特异性三、临床考核血清盘的建议以抗-HBc-IgM为例部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本经美国abbott公司抗-HBc-IgM试剂反复检验筛选选出血清70份其中阳性29份阴性41份组成抗-HBc-IgM临床考核血清盘在70份样本中除7份为无病历的质控血清外抗-HBc-IgM阳性的22份样本中含临床诊断急性肝炎16例、慢性活动性肝炎5例、重症肝炎1例；抗-HBc-IgM阴性的40份样本中含临床诊断慢性迁延性肝炎24例、急性肝炎例（均为恢复期采的血样）、慢性活动性肝炎8例（其中5例为恢复血样）因此这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开具有临床诊断意义。
生物素-链亲和素
1 简介
生物素-链亲和素是一种用于分离和纯化特定蛋白质的技术。
生物素是一种维生素，链亲和素是一种人工合成的小分子化合物，它们可以相互结合形成生物素-链亲和素复合物。
这种复合物可以用于特异性地捕获具有生物素结合蛋白（如亲和标签）的蛋白质。
2 生物素
生物素是一种水溶性维生素，也称为维生素H。
它是许多酶类的辅助因子，参与多种代谢反应。
生物素可以通过食物摄入或肠道内微生物的合成获得。
生物素在生物体内的作用包括促进葡萄糖、脂肪和氨基酸的代谢，以及DNA复制和表达的调节。
3 链亲和素
链亲和素是一种人工合成的小分子化合物，它是由生物素和亲和基团（如imidazol）组成的。
链亲和素可以与生物素结合，形成生物素-链亲和素复合物。
链亲和素的亲和性可以通过改变亲和基团的结构来调节。
链亲和素可用于纯化和检测蛋白质，特别是那些具有生物素标签的蛋白质。
4 生物素-链亲和素的应用
生物素-链亲和素是一种常用的蛋白质纯化技术。
利用这种技术，可以通过将生物素-链亲和素复合物结合到具有生物素标签的蛋白质上，将目标蛋白质高效地分离和纯化出来。
此外，生物素-链亲和素还可用于检测和定量具有生物素标签的蛋白质。
5 结语
生物素-链亲和素技术是一种基于生物素标签的蛋白质纯化和检测方法。
通过利用生物素和链亲和素相互结合形成的复合物，可以高效地分离和纯化具有生物素标签的蛋白质。
这种技术广泛应用于生命科学研究和工业领域。
链霉亲和素磁珠连接生物素dna以链霉亲和素磁珠连接生物素DNA链霉亲和素磁珠（Streptavidin Magnetic Beads）是一种广泛应用于生物学研究中的实验工具。
它具有高亲和力和高特异性，可用于连接或纯化含有生物素结构的分子。
本文将介绍链霉亲和素磁珠的原理、应用以及相应的实验步骤。
链霉亲和素磁珠主要由核心磁性颗粒和表面覆盖有链霉亲和素的包被层组成。
链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，它具有高度特异性结合生物素的能力。
生物素是一种维生素B家族的成员，与链霉亲和素之间形成非常稳定的亲和力。
通过将链霉亲和素磁珠与含有生物素结构的分子连接，可以实现对这些分子的纯化、富集或检测。
链霉亲和素磁珠广泛应用于生物学研究中的多个领域。
其中一个重要的应用是DNA纯化和富集。
在研究中，科学家常常需要从复杂的混合物中纯化或富集特定的DNA片段。
通过在DNA片段上引入生物素标记，可以利用链霉亲和素磁珠将这些片段方便地富集到磁珠上，然后通过磁场将磁珠与其他杂质分离。
这种方法可以高效地富集目标DNA，并去除大量的杂质，从而提高后续实验的准确性和可靠性。
链霉亲和素磁珠连接生物素DNA的实验步骤如下：1. 准备实验材料：包括链霉亲和素磁珠、含有生物素标记的DNA 样品、缓冲液等。
2. 将链霉亲和素磁珠与DNA样品混合：将一定量的链霉亲和素磁珠加入含有生物素标记的DNA样品中，轻轻混匀，使磁珠与DNA 充分接触。
3. 孵育反应：将混合物在适当的温度和时间下孵育，使链霉亲和素与生物素结合。
4. 磁珠分离：将孵育后的混合物放入磁场中，利用磁性颗粒的特性将链霉亲和素磁珠与其他杂质分离。
通过去除上清液，可将富集了生物素DNA的磁珠洗涤和收集。
5. 洗涤和收集DNA：对于富集了生物素DNA的磁珠，可以进行一系列洗涤步骤以去除非特异性结合的杂质。
最后，使用适当的缓冲液溶解磁珠，并收集溶液中的DNA样品。
通过以上步骤，我们可以利用链霉亲和素磁珠连接生物素DNA，并高效地富集或纯化目标DNA。
sabc免疫组化法SABC免疫组织化学法（Streptavidin-Biotin Complex Immunohistochemistry）是一种常用的免疫组织化学技术，于1980年由Hsu等人首次提出，其基本原理是利用亲合素-生物素结合系统来增强免疫反应的信号和灵敏性。
该技术广泛应用于组织病理学和细胞生物学领域，用于检测和定位各种细胞和组织中的抗原或分子标记物，具有高灵敏度和高特异性的特点。
SABC免疫组织化学法的基本步骤如下：1. 样本固定：将待检测的细胞或组织固定在载玻片上。
常用的固定方法包括冰乙酸法、乙醇法和甲醛法等。
2. 抗原修复：由于组织样本在固定过程中可能导致抗原受损或掩盖，所以需要进行抗原修复。
抗原修复的方法有热处理、酶消化和酸碱处理等。
3. 阻断非特异性结合：添加合适的蛋白质阻断液，防止非特异性结合。
4. 一抗孵育：将第一抗体孵育在样本上，第一抗体可以是多种来源，如小鼠单克隆抗体、兔多克隆抗体等，与目标抗原结合。
5. 二抗孵育：将牛、羊或马等动物来源的生物素化的二抗孵育在样本上，二抗的特异性是由于其与人样本中免疫球蛋白的Fc区域结合而实现。
6. ABC复合物孵育：加入经过某种方式标记的ABC复合物，ABC复合物是指由Streptavidin（链霉亲和素A）和生物素化的过氧化物酶（HRP）构成的复合物，通过亲合素与生物素之间的高亲和力实现复合。
7. 标色显色：通过添加染色剂(如DAB)和过氧化氢等试剂，使得过氧化物酶催化反应产生沉积的有色产物。
8. 反应停止：用蒸馏水冲洗玻片，停止显色反应。
9. 后处理及封片：将玻片脱水，用透明剂固定标本，然后盖上封片剂，最后用显微镜观察和分析结果。
SABC免疫组织化学法的优点是具有高灵敏度和高特异性，对于目标抗原的检测和定位有较好的效果。
通过使用链霉亲和素A和生物素结合系统，可以增强免疫反应的信号，提高检测和定位的灵敏性。
此外，该方法简单易行，结果易于解释和分析，广泛应用于组织病理学和细胞生物学领域。
ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.0的碳酸盐包被缓冲液，将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
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链霉亲和素和生物素结合位点
链霉亲和素是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，具有四个与生物素（Biotin）亲和力极高的结合位点。
它是一种60-kDa的链霉菌avidinii细胞外蛋白，也是一种生物素结合蛋白，包含四个亚基，每个亚基都有一个生物素结合位点。
这种四聚体蛋白能与生物素形成非常稳定的复合物，因此，链霉亲和素在生物技术和医学研究中具有广泛的应用。
链霉亲和素与生物素的结合能力极强，这种结合具有高度的特异性和稳定性。
这种特性使得链霉亲和素在生物素标记技术中发挥了重要的作用。
例如，在免疫组织化学和免疫细胞化学中，链霉亲和素常被用作生物素化抗体的放大系统，通过链霉亲和素与生物素的结合，可以将生物素化的抗体与链霉亲和素连接在一起，从而增强信号的强度，提高检测的灵敏度。
此外，链霉亲和素还被广泛应用于蛋白质相互作用的研究。
通过将目标蛋白质与生物素标记，然后利用链霉亲和素与生物素的结合特性，可以方便地将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，从而实现对目标蛋白质的纯化和鉴定。
总的来说，链霉亲和素和生物素的结合位点为生物医学研究提供了强有力的工具。
这种结合具有高度的特异性和稳定性，使得链霉亲和素在生物素标记技术和蛋白质相互作用的研究中发挥了重要的作用。
随着科学技术的不断发展，链霉亲和素的应用领域还将不断扩大，为生物医学研究带来更多的可能性。
BAS-酶联免疫吸附试验BAS-酶联免疫吸附试验BAS-酶联免疫吸附试验(BAS-ELISA)是ELISA的一种改良技术，将BAS，即生物素-亲和素系统(biotin?avidin system)引入ELISA，大大提高了ELISA的灵敏度。
(一) 亲和素和生物素1. 亲和素(avidin) 给动物饲喂大量卵白蛋白后，可引起生物素缺乏症，此后证明，卵白蛋白中存在一种对生物素有异常亲和力的碱性蛋白，称之为抗生物素蛋白或卵白素，现今均称为亲和素。
因为亲和素存在于卵白蛋白中，故可从鸡蛋白清中提取亲和素，它是由四个相同的亚基组成的碱性糖蛋白，分子量6.6～6.8万，等电点为10.5，由于每个亚基都可以结合一个生物素分子，所以亲和素呈四价反应性，在血清学反应中，可以产生新的放大作用；现规定凡结合1μg生物素所需亲和素的量，即为亲和素的一个活性单位，1mg纯亲和素约含13～15个活性单位。
2. 生物素(biotin) 即维生素H，主要存在于卵黄、肾、肝等组织中，除可提取外，也能人工合成，另外在动植物体内也广泛存在，系结构简单的小分子物质，分子量244.31，它不能直接与亲和素结合，需活化后，产生生物素衍生物(即生物素酰羟基丁二酰亚胺，HS，为白色结晶，熔点200～202℃)才能与亲和素结合。
另外，它还能高比度地偶联抗体等反应物质和酶等标记材料，分别制成生物素化抗体和生物素化酶等，在免疫反应中起到一级稳定的放大作用。
因为亲和素对生物素有极强的特异性结合作用，且具有多价性，据此，可以建立生物素化抗体-亲和素-生物素化酶复合物?酶联免疫吸附试验检测体系，利用亲和素为中介，一端通过生物素化抗体联接检测抗原的免疫反应系统，另一端通过生物素化酶等连接标记显示系统，可产生多极放大作用，从而明显地提高了检测的特异性和敏感性。
(二) BAS-ELISA的技术类型该检测系统可分为以下两类：1. BAB法 (biotin-avidin-biotin) 即以游离的亲和素分别桥联生物素化抗体和生物素化酶的检测方法。
一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时,受检标本（测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上.此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。
二、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent)；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conjugate)；(3）酶反应的底物。
根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下:（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本，保温反应。
标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
（3) 加酶标抗体,保温反应。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.(4) 加底物显色。
固相上的酶催化底物成为有色产物。
通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
链霉亲和素（Streptavidin）磁珠是一种在生物技术和免疫学研究中广泛应用的固相载体。
其原理基于链霉亲和素与生物素（Biotin）之间极高特异性和亲和力的非共价相互作用。
这种结合是自然界中最紧密的非共价键之一，具有极低的解离常数（Kd≈10^-15 M），这意味着一旦生物素化分子遇到链霉亲和素，它们会迅速且牢固地结合。
工作原理：1.链霉亲和素与生物素结合：o链霉亲和素是一个四聚体蛋白质，每个亚基都有一个高度疏水的生物素结合位点。
因此，一个链霉亲和素分子理论上可以结合多达四个生物素分子，但由于空间构象限制，通常结合效率为3-4个生物素分子。
2.生物素标记物：o在实验中，研究人员首先将目标分子（如抗体、酶、核酸、肽或细胞表面抗原等）通过化学方法生物素化，即在这些分子上连接生物素标签。
3.磁珠耦合：o链霉亲和素被固定在磁性微珠上，形成链霉亲和素磁珠。
这些磁珠一般由二氧化硅、聚合物或其他材料制成，并具有磁响应性，可以通过外部磁场进行定向移动和分离。
4.结合与分离过程：o生物素化的靶分子溶液与链霉亲和素磁珠混合时，由于链霉亲和素对生物素的高亲和力，生物素化的分子会被快速捕获到磁珠表面，从而实现固液相转换。
o通过应用磁场，可以轻易地将结合了靶分子的磁珠从溶液中分离出来，而未结合的物质则可以通过离心或者倾倒废液去除。
5.应用举例：o在T细胞活化实验中，链霉亲和素磁珠可以用于结合生物素化的抗CD3抗体和其他共刺激分子（例如生物素化的抗CD28抗体），形成人工APC（Antigen Presenting Cell模拟物）。
当T细胞与这些磁珠上的抗体复合物接触时，能够提供激活所需的双信号，从而实现高效、可控的T细胞活化。
6.纯化与检测：o链霉亲和素磁珠也广泛应用于样品纯化，如生物素标记的cDNA、蛋白质以及其他生物分子的分离和纯化，以及在各种诊断和药物筛选平台中作为固相吸附剂。
综上所述，链霉亲和素磁珠利用了生物素-链霉亲和素系统的高度特异性结合性质，成为一种灵活且高效的生物技术工具，在多种科研和临床应用中发挥重要作用。
亲和素与生物素系统的基本原理
1979年，Guesdon及其同事首先将生物素—亲和素应用于免疫组化技术中，并成功地建立了标记亲和素
—生物素技术(LAB)和桥亲和素—生物素技术(BAB)。1981年，Hsu在LAB法和BAB法的基础上，先后建
立了生物素—亲和素间接法及ABC法。近年来，由于双重免疫组化标记技术的发展，除ABC-HRP试剂外，
还制成了ABC-AKP和ABC-GOD试剂，进而发展了ABC-AKP等技术。同时人们又对ABC法进行改进，
相继出现了快速ABC法、二步ABC法、PAP和ABC连用等技术。随着链霉亲和素(streptavidin)的应用又
出现了LSAB、S-P、SABC等方法。
1．标记亲和素—生物素法(1abeledavidinbiotin，LAB)
将亲和素与标记酶(HRP)结合，一个亲和素可结合多个HRP；将生物素与抗体(一抗或二抗)结合，一个
抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原(或通过一抗)先与生物素化的抗体结
合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。
2．桥接亲和素—生物素法(bridgedavidinbiotin，BAB)
先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素为“桥”物素连接，也可达到多层放大效果。将生物素
化抗体与酶标记生
3．亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplex，ABC)
此方法为前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶标生物素(或称生物素化酶)结合，形成亲和
素—生物素—过氧化物酶复合物(ABC复合物)。抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物(此
ABC复合物不能饱和，即亲和素上的4个结合位点最多允许3个位点与生物素化酶结合，留1～2个位点
与生物素化二抗结合)结合，最终形成巨大复合体。因该复合体网络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏
度。
