拟南芥悬浮细胞超低温保存试验_李建安

RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。

但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。

但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。

RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。

第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。

实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。

1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。

4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

5、融解RNA一般使用TE。

6、保存RNA应该尽量低温。

为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。

从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。

另外，长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。

重楼的组织培养1.外植体的选择与消毒1.1外植体的选择据李群等对重楼组织培养外植体有4个取材时期，即萌芽期、展叶期、花冠露白期和倒苗期，子房取自花冠露白期，叶片取自萌芽和展叶期，幼芽取自萌芽期、展叶期、倒苗期，试验结果表明，其中以展叶期旺盛生长的根茎作外植体，其愈伤组织的诱导频率最高，达16.6%，萌芽期取材次之，在花冠露白期和倒苗期，根茎则很难诱导产生愈伤组织。

根和叶片既不能诱导出愈伤，也不能诱导出小球茎，接种后很少启动，污染也较少，大约2个月后干枯死亡。

而根茎、子房、幼芽都能不同程度地诱导出愈伤组织，特别是幼芽，不但诱导出的愈伤组织块数最多，诱导频率最高，达68. 25%，且还能诱导出小球茎。

可见，不同的外植体的诱导频率差异很大。

在四川峨眉山海拔2000 m左右的环境下，重楼属植物的生长期一般为4月至5月中下旬，大约二个月左右的时间。

因此，取材时间应在4月至5月上旬这段时间。

但在这段时间取材培养，会发现外植体极易污染。

必须采取一些措施减轻或控制外植体的污染。

.1.2外植体的消毒接种前置于18 e 弱光下保存，一般滞留2-4d即接种培养。

取重楼的芽，自来水冲洗2-3h，去除表层的芽鞘，再用自来水冲洗干净后，蒸馏水冲洗3遍。

在无菌条件下，用75,酒精消毒30S，无菌水冲洗3-5次，0.1,升汞灭菌15min，无菌水冲洗5-8次。

将芽外部的芽鞘按层剥下，切成长宽分别为1cm 左右的小块，芽内部不能分层的部分按切外层芽鞘的大小切成小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，一般幼嫩的芽和叶片灭菌3-4min;根茎灭菌10min，子房和根灭菌6-8min。

灭菌以后的材料用无菌水清洗3-5次，最后接种于培养基(1)上，置于(20?2 )?培养温度，光照时间8h/d的条件下培养。

培养基:(1)MS+BA 1.0 +IAA 2.0 和 MS+BA 2.0 +IAA 1.0 培养基上，不但能诱导愈伤组织，还能诱导出小球茎。

百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系建立及遗传稳定性分析陈冠群;李晓丹;申晓辉【摘要】采用单因素随机区组试验及多因素、多水平正交试验方案建立了百子莲胚性愈伤组织(embryogenic callus,ECs)玻璃化法超低温保存体系.将由花梗诱导的胚性愈伤组织接种至预培养基(MS+0.5 mol/L蔗糖+1％琼脂)上,在4℃下预培养2d后,在室温下加入装载液(MS+0.4mol/L蔗糖+2 mol/L丙三醇+10 mmol/L KNO3)处理60 min;利用改良后的PVS 2玻璃化溶液(MS+0.4 mol/L蔗糖+30％丙三醇+15％乙二醇+15％ DMSO)在0℃下处理40 min,将含有ECs的冻存管投入液氮中冻存1h;在40℃水浴中快速解冻90 s;用洗涤液(MS+1.2 mol/L蔗糖+ 10 mmol/L KNO3)处理30 min,每10 min换1次新鲜的洗涤液;洗涤后,接种到胚性愈伤组织增殖培养基上恢复培养24 h后,相对成活率分别达56.9％(TTC法)和43.3％(Evans blue法).恢复培养55 d的百子莲胚性愈伤组织经过AFLP多态性检测后未发现基因组变异,证明该方法可用于百子莲种质资源的超低温保存.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2014(032)005【总页数】9页(P76-83,94)【关键词】百子莲;胚性愈伤组织;玻璃化法超低温保存;遗传稳定性;AFLP【作者】陈冠群;李晓丹;申晓辉【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海市崇明县新海镇农技中心,上海202150;上海交通大学农业与生物学院,上海200240【正文语种】中文【中图分类】S682.32百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis)又称蓝百合,为百子莲科(Agapanthaceae)百子莲属(Agapanthus)多年生草本花卉,原产于非洲南部的亚热带地区。

高中生物实验大全1.观察DNA、RNA在细胞中的分布2.检测生物组织中还原糖、脂肪和蛋白质3.用显微镜观察多种多样的细胞4.观察线粒体和叶绿体5.通过模拟实验探究膜的透性6.观察植物细胞的质壁分离及复原7.探究影响酶活性的因素8.叶绿体色素的提取和分离9.探究酵母菌的呼吸方式10.观察细胞的有丝分裂11.模拟探究细胞表面积与体积的关系12.观察细胞的减数分裂13.低温诱导染色体加倍14.调查常见人类遗传病15.探究植物生长调节剂和扦插枝条生根的作用16.模拟尿糖的检测17.探究培养液中酵母菌数量的动态变化18.土壤中动物类群丰富度的研究19.探究水族箱（或鱼缸）种群落的演替生物实验总结实验一观察DNA和RNA在细胞中的分布实验原理：DNA绿色，RNA红色分布：真核生物DNA主要分布在细胞核中，线粒体和叶绿体内也含有少量的DNA；RNA主要分布在细胞质中。

实验结果:细胞核呈绿色,细胞质呈红色.实验二物质鉴定还原糖+斐林试剂砖红色沉淀脂肪+苏丹III橘黄色脂肪+苏丹IV红色蛋白质+双缩脲试剂紫色反应1、还原糖的检测1）材料的选取：还原糖含量高，白色或近于白色，如苹果，梨，白萝卜。

2）试剂：斐林试剂（甲液：0.1g/mL的NaOH溶液，乙液：0.05g/mL的CuSO4溶液），现配现用。

3）步骤：取样液2mL于试管中→加入刚配的斐林试剂1mL（斐林试剂甲液和乙液等量混合均匀后再加入）→水浴加热2min左右→观察颜色变化（白色→浅蓝色→砖红色）★模拟尿糖的检测1、取样：正常人的尿液和糖尿病患者的尿液2、检测方法：斐林试剂（水浴加热）或班氏试剂或尿糖试纸3、结果：（用斐林试剂检测）试管内发生呈现砖红色沉淀的是糖尿病患者的尿液，未呈现砖红色沉淀的是正常人的尿液。

4、分析：由于糖尿病患者的尿液中含有还原糖，与斐林试剂发生反应产生砖红色沉淀，而正常人尿液中无还原糖，所以没有发生反应。

2、脂肪的检测1）材料的选取：含脂肪量越高的组织越好，如花生的子叶。

不同温度下东海原甲藻的细胞死亡*李璞昭 李宇豪 黄晓舟（通讯作者）泉州师范学院 海洋与食品学院 福建 泉州 362000 摘 要 东海原甲藻赤潮是我国最常见的赤潮，已经给我国海洋生态带来了严重后果，研究其赤潮消亡过程非常重要。

本文主要利用流式细胞技术来测定东海原甲藻在不同温度下（16、20、24℃）的细胞生长、死亡率及与死亡相关蛋白caspases-like的活性。

结果表明：20℃下东海原甲藻细胞总数和存活细胞数量最多，但死亡率和其他2个温度没有显著差异，且有caspases-like活性的细胞比例和16℃组也无明显差异。

可见，东海原甲藻caspases-like蛋白在低温条件下不全是执行PCD…的功能，可能有辅助东海原甲藻适应低温的功能。

关键词 赤潮；东海原甲藻；细胞程序性死亡；caspases-likeCell Death of Prorocentrum Donghaiense at Different TemperaturesLi Pu-zhao, Li Yu-hao, Huang Xiao-zhou(corresponding author)College of Oceanology and Food Science, Quanzhou Normal University, Quanzhou 362000, Fujian Province, ChinaAbstract The bloom of Prorocentrum donghaiense is the most common red tide in China, which has brought serious consequences to marine ecology, therefore, it is very important to study its algal bloom extinction process. In this paper, flow cytometry was mainly used to determine the cell growth, death rate and the caspases-like activity of P. donghaiense at different temperatures (16℃, 20℃, 24℃). The results showed that, the number of total cells and surviving cells of P. donghaiense were all highest at 20℃, but there was no significant difference in death rate compared to the other two temperatures. And there was no significant difference in the caspases-like activity at 20℃and 16℃. It concluded that the caspases-like protein of P. donghaiense did not all perform the functions of PCD under low temperature, and might have the function of assisting P. donghaiense to adapt to low temperature.Key words bloom; Prorocentrum donghaiense; programmed cell death; caspases-like引言赤潮是一种严重的全球性海洋灾害，不仅不同程度的破坏海洋生态系统，给海洋生物和人类的健康带来威胁，还会对水产养殖业带来危害，造成重大的经济损失。

拟南芥——植物界的“果蝇”毛健民　李俐俐(周口师范高等专科学校生物系河南周口466000) 自20世纪80年代中期开始,没有任何经济价值的植物拟南芥(A rabid op sis thaliana),被广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。

近年来,植物科学中许多有价值的发现几乎都是以拟南芥为实验材料取得的,拟南芥已成为1种典型的“模式”植物,被誉为植物界的“果蝇”。

拟南芥之所以受到如此重视是由其自身特点所决定的。

现就拟南芥的生物学特性、在植物科学研究中的应用及其基因组计划的进展情况作一简介。

1　拟南芥的生物学特性拟南芥属十字花科拟南芥属的1个种。

其植株小、成熟个体高约30c m左右,形态特征简单。

拟南芥的生长期很短,从播种到收获种子一般只需6周左右,而且产生的种子数量多,每株每代可产生数千粒种子。

拟南芥的这一生物学特性,使我们在以它作为实验材料进行遗传分析时,可以大大缩短时间。

相比之下,小麦、玉米等植物的生长期一般需几个月,使得遗传实验分析花费的时间较长。

拟南芥还是1种典型的自交繁殖植物,因此,人工诱变后可以在子二代中直接筛选变异株的纯合子。

同时,根据遗传分析需要,人工杂交也很容易完成。

在目前已知基因组大小的高等植物中,拟南芥的核基因组最小,其单倍体基因组只有80000kb左右。

由于基因组小,使得其基因库的构建、筛选等过程变得简单、快速,同时,还可节省大量人力、物力。

例如,对于含约20kb外源DNA片段的Κ2克隆基因库,只需16000个克隆就可以有99%的机率分离任何1个核基因。

相比之下,烟草需要370000个,小麦需要1000000个。

2　拟南芥在植物遗传学研究中的应用拟南芥单倍体有5条染色单体,组成了拟南芥的5个连锁群。

目前已有100多个单基因变异用遗传方法定位在这5个连锁群上。

由于这些变异位点的基因参与了很重要的植物生理生化及发育过程,因此,克隆这些基因,并研究这些基因的功能、这些变异的分子基础或遗传本质和它们控制植物发育的机理,对于阐明植物的生长发育和发育过程具有重大意义,如对拟南芥花器官特异性基因的研究。

细胞生物学实验教学指导书有丝分裂实验一、实验目的学习植物根尖压片方法的基本技术。

熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体的变化，并学会染色体简易永久片的制片技术。

二、实验原理有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，一般发生在植物根尖或茎尖的分生组织中。

在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。

各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的，并随科属种的不同而具有一定的特征。

洋葱体细胞中有8对共16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份，然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。

在细胞遗传学研究中，人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。

三、实验材料洋葱(Aillum cepa)根尖蚕豆(Vicia faba)根尖四、实验器具和药品试剂显微镜、培养箱、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、载玻片、盖玻片、烧杯、量筒、滴瓶、切片架、切片盒、凹面玻片、青霉素瓶、大培养皿、纱布、吸水纸、铅笔、吸管。

卡诺氏固定液(甲醇或95%乙醇3份，冰醋酸1份)、改良苯酚品红染色液(见附录:实验试剂的配制)、0.002M8-羟基喹啉水溶液、0.05—0.2%秋水仙素溶液、对二氯苯饱和水溶液、1N HCl、95%乙醇、正丁醇、加拿大树胶。

五、实验方法和步骤(一)材料准备选取蚕豆(或小麦、玉米等)种子放在烧杯中，放清水浸泡过夜，使种子吸水胀大后倒出，再用清水洗几次，用多层纱布包好种子，放进20,25?培养箱内培养。

当根尖长1,3cm 时，即可以进行预处理。

(二)预处理为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。

一般是在分裂高峰前处理1.5小时以上。

处理的方法如下: 1(秋水仙素水溶液常用浓度为0.05,0.2%，室温下处理2,4小时。

拟南芥 CWINV1启动子 GUS 表达载体构建及转基因植株的鉴定程姣;黄弈;任春梅【摘要】CWINV 是编码细胞壁蔗糖转化酶的基因。

为深入探讨 CWINV 基因的表达调控机理，构建了拟南芥 CW-INV1基因启动子的 GUS 融合表达载体并转入拟南芥，获得了转基因植株。

GUS 染色的结果进一步验证了重组表达载体的正确性和实用性。

%CWINV gene encoding the cell wall invertase.CWINV play an important role in plant growth and development, especially blooming,fruit setting,seed formation and other reproductive development period.But its function has not been e-lucidated in detail.In order to further exploring the mechanism of CWINV gene expression and regulation,the plant expres-sion vectors of CWINV1 gene promoter was constructed with GUS fused report genes,and then transformed into Arabidopsis, transgenic plants were obtained.GUS staining results further verifies the correctness and practicability of the recombinant expression vector.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2016(030)003【总页数】4页(P237-240)【关键词】拟南芥;CWINV1;载体构建;GUS 染色【作者】程姣;黄弈;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128; 作物基因工程湖南省重点实验室，长沙 410128【正文语种】中文【中图分类】Q78蔗糖转化酶是一种最常见的酶，存在于酵母、细菌和植物中，在植物中能够不可逆地催化蔗糖的水解反应，生成葡萄糖和果糖，因此，蔗糖转化酶在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用。

用MDBK 悬浮细胞培养BPIV-3的初步研究刘国英 张晨宇 张燕红 齐志涛 路荣 范秀丽 高艳华 方建国 郝鹏**/金宇保灵生物药品有限公司 010100基金项目：国家重点研发计划资助（2017YFD 0500903）作者简介：刘国英，兽医硕士，主要从事兽用疫苗研究与开发。

*通讯作者：郝鹏摘 要：为了提高BPIV-3灭活疫苗产能及稳定性，初步探究了在MDBK 悬浮细胞中的培养条件。

将种毒按不同接种比例在MDBK-S 悬浮细胞中，72h 后收获病毒液，测定TCID 50，探究最佳的病毒接种量；按2%的种毒接种在不同密度的悬浮细胞中，72h 收获病毒液，通过测定TCID 50，探究最佳的细胞密度；将2%的种毒接种在2.0×106cells/ml 的悬浮细胞中，于接毒后不同时间收获病毒液，测定TCID 50，探究最佳的收毒时间；在最佳培养条件的基础上，与贴壁毒TCID 50做对比。

结果表明，病毒接种比例为2%，MDBK 悬浮细胞密度为2.0×106cells/ml ，接毒后72h 收获，病毒TCID 50最高；悬浮细胞产毒能力比贴壁细胞高。

关键词：MDBK 悬浮细胞；牛副流感3型；悬浮培养牛副流感病毒3型（BPIV-3）是副粘病毒科的呼吸道病毒属成员[1]。

该病毒是多形的，被包膜，直径为150-300nm [2]，非分段的负链RNA 。

BPIV-3是世界范围内犊牛和成年牛病毒呼吸系统疾病相关的重要病原体之一，在运输中也称为热应激，导致牛发病和大量死亡。

BPIV-3常与其它病毒或细菌混合感染，引起以高热、咳嗽等症状的牛呼吸道疾病综合征（BRDC ），成为全球范围内影响牛健康的主要问题，给养牛业造成了极大的经济损失，给全世界的畜牧业带来了沉重负担。

最早于1959年，Reisinger 等在美国因运送牛，从发热牛体内分离出该病毒，最初被命名为粘液病毒SF-41[3]。

之后，前苏联、丹麦、法国、加拿大、日本、意大利、澳大利亚等国家也接连分离出该病毒。