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悬浮细胞培养技术课件

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第三章 植物细胞的悬浮培养

第三章 植物细胞的悬浮培养

二. 操作程序


（一）选择合适的外植体 外植体的选择对以后愈伤组织的诱导很重要，选择合适的外 植体进而诱导出疏松易碎的愈伤组织对以后建立悬浮细胞系 可以起到事半功倍效果。 1. 双子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、下胚轴、 子叶、叶片、根等。 2. 单子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、幼穗、花 药等。 无论是双子叶植物还是单子叶植物、均以幼胚诱导愈伤组织 的为最佳。因为幼胚诱导的愈伤组织质量最好，分化能力强。 在某些情况下直接用幼胚、下胚轴、子叶等作外植体进行悬 浮培养，建立悬浮细胞系也可获得成功。
二. 操作程序
（八）悬浮细胞的活力和生长速度 悬浮细胞的活力和生长速度受到悬浮培养起始密度的 影响，如果培养时间过长（5～7天或更长）、细胞积 累量多时，培养基的成分和pH值均发生较大的改变， 往往造成细胞活力下降，细胞生长减慢。一般继代培 养（更换新鲜培养基）3天时的细胞活力最强，常常用 此时的细胞为材料进行原生质体游离和培养及诱变处 理等。
实例
白木香
二. 操作程序



（十）悬浮细胞的分散度、生长速度与植株再生能力之间的关 系 一般来讲，如果一个悬浮细胞系分散程度越高，生长速度越快， 在一定时间内，细胞分裂的代数也就越多，也就越易产生突变， 其分化能力也就越容易丧失，因此，悬浮细胞在继代培养过程 中，每隔一段时间（1～2个月）就应检查一下它的分化能力。 自诱导愈伤组织到建立一个良好的悬浮细胞系大约需要4～6个 月或更长的时间，因此尽量保持其分化能力极为重要。 保持其分化能力的方法有二个：超低温保存是一个极有效的方 法，经过超低温保存的悬浮细胞，不会影响其各种性质，同对 照组相同。 固体培养基上保持悬浮细胞的分化能力。

第八讲植物细胞悬浮培养技术

第八讲植物细胞悬浮培养技术

第八讲：植物细胞悬浮培养技术摘要悬浮培养技术是一种在液态培养基中培育植物细胞的方法。

这种技术可以用于研究植物细胞的生理、生化、遗传和分子生物学。

本文将介绍悬浮培养技术的原理、方法和应用，并讨论其优缺点。

原理悬浮培养技术是将植物细胞悬浮在液态培养基中，并提供足够的营养和适宜的环境条件，促进细胞生长和分裂。

悬浮培养技术可以通过两种方法进行：自然悬浮和机械悬浮。

自然悬浮是指通过培养基中的液体流动和植物细胞的重力作用来保持细胞悬浮状态。

机械悬浮是指通过磁力搅拌或气泡强制产生的涡流来保持悬浮状态。

方法悬浮培养技术的方法主要包括以下步骤：1.选取适当的植物细胞：悬浮培养技术可以应用于多种植物细胞，例如培养基的类型和成分、植物物种、生长条件等，都会影响细胞的生长和分裂。

2.培养基制备：准备含有足够营养物质和适合生长的植物细胞的培养基。

3.细胞分离：使用细胞壁水解酶、酸碱处理或机械方法去除细胞壁，分离单个细胞。

4.细胞培养：将分离的细胞置于液态培养基中，将培养瓶放置拟南芥上，以恒定光照、温度、湿度和通风条件下日夜持续观察培养。

5.细胞传代：留置旺孔1cm左右的细胞，废弃周边细胞，再次培养。

应用悬浮培养技术可以应用于以下方面：1.生物医学研究：通过悬浮培养技术培养人类细胞，可用于药物筛选、治疗性细胞移植和组织工程学等研究。

2.分子生物学研究：由于悬浮培养技术能够大量培养植物细胞，因此可以用于高通量分析、基因克隆和表达、蛋白质组学和代谢组学研究等。

3.植物细胞与组织培养：悬浮培养技术可以用于植物组织和细胞的体外培养，利用悬浮培养技术可以大量制备植物生长激素和次生代谢产物。

优缺点悬浮培养技术有以下优点：1.可以大规模培养细胞。

2.可以简化分离和培养过程，使得实验成本低廉。

3.可以控制培养环境，减少外界干扰。

悬浮培养技术也存在以下缺点：1.悬浮培养技术对培养条件和营养要求非常苛刻，因此需要经验丰富的实验人员进行操作。

2.悬浮培养技术可能会产生细胞堆积的问题，从而影响细胞生长和分裂。

细胞悬浮培养

细胞悬浮培养

物理方法 化学方法
cell suspension culture 物理方法
体积选择法 通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行 分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中，从 而可能保持相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。这种方 法的优点是操作简单，分选细胞维持了自然生长状态，因而不 会有其它处理所带来的对细胞活力的影响 。 低温处理法 冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程 度。收集细胞，在4摄氏度温度下处理数天，添加 新鲜培养液。
cell suspension culture
细胞初始培养
根据培养基在容器中的运动方式来区分，有4中振荡 培养方法： 旋转培养：培养瓶呈360º的缓慢旋转移动，使细胞培 旋转培养 养物保持均匀分布和保证空气供应。 往返振荡培养：机器带动培养瓶在一直线方向往返振 往返振荡培养 荡。 旋转振荡培养：机器带动培养瓶在平行面上作旋转振 旋转振荡培养 动。 搅动培养：利用搅拌棒不断转动，使培养基被搅动。 搅动培养
cell suspension culture 化学方法
饥饿法
饥饿也是调整细胞同步化的方法之一。在一个培养体系中， 如果细胞生长的基本成分丧失，而导致细胞因饥饿而分裂受 阻，从而停留在某一分裂时期。当在培养基中加入所缺乏的 成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分 裂又可以重新恢复。饥饿导致的细胞分裂受阻，常常使细胞 不能合成DNA，即不能进入S期；或细胞分裂不能进行，即不 能进入M期。
连续培养是通过控制加入定量的营养物质使细胞 连续培养 生长率和细胞密度保持不变的一种培养方式，主要 用于研究和生产次生代谢物质 。 连续培养主要用 于大规模细胞培 养，通过添加新 鲜培养液和排放 已利用的培养液 来平衡营养水平， 使培养细胞长期 处于静止期状态。

悬浮细胞培养

悬浮细胞培养

1、分批培养/成批培养 （Batch culture）
① 特点 • • 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目不断发 生变化，呈S增长。
8
继代
9
② 继代的方法
• 用注射器或移管吸取一定量的含单细
胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到
含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进
行培养。
10
③最佳继代时期：
第五章 悬浮细胞培养
1
主要内容
一．起始悬浮细胞的制备 二．悬浮细胞培养的基本形式 三．悬浮细胞培养中细胞生长量的计算 四．悬浮培养细胞活力的测定
2
悬浮细胞培养
Suspension cell culture
意义
1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
③ FDA法
24
①相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、 核存在表明有活力
②伊凡蓝法
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不 能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
③FDA法（荧光素双醋酸酯法）
25
FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以 自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极 性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧 光。
1. 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭 容器中，最后一次收获的培养方式。 2. 连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的 流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营 养状态保持稳定。 --流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的 培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物 (菌体和代谢产物) 7

植物细胞悬浮培养技术课件

植物细胞悬浮培养技术课件

连续培养意义：
1.植物细胞代谢调节的研究
2.某种生长限制因子对细胞生长的影响
3.次生产物的大量生产
紫杉醇是获得美国FDA(1992)认证的优良抗 肿瘤药物。红豆杉树皮中紫杉醇的含量为万分 之二，其在国际市场上售价为20万美元/kg
3 由悬浮细胞再生植株的途径
• 由悬浮细胞直接形成体细胞胚 • 先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形
（2）加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基： 曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。
（3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细 胞一直保持指数生长期。
（4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长， 则会引起细胞的大量死亡和解体。
操作注意事项：
对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径 要小，只能通过单细胞或小细胞团（2～4细 胞），使用吸管或注射器。
液体培养基 摇床振荡
悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
2.2、悬浮培养的基本形式
分批培养 连续培养
2.2.1.1 分批培养的特点
• 培养基体积固定 • 当培养基中的营养物质耗尽时，细胞的分
裂和生长也停止 • 必须适当搅拌，促进氧气的溶解，和废气
的排放。
疏散的植物的遇上组织？
• 4.写好实验报告。
注意：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触
点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成 功。
例 分离篱天剑叶肉细胞的机械方法
叶片消毒
75％酒精， 7％次氯酸钠
10ml培养基 1.5克1cm2叶片
匀浆
植板
过滤
离心
低速，去碎屑， 游离细胞沉降
1.1.3 机械法和酶解法比较
机械法

第二章(4)植物悬浮细胞培养

第二章(4)植物悬浮细胞培养

第二章(4)植物悬浮细胞培养技术1 单细胞的分离1.1由完整的植物器官分离单细胞1.1.1 机械法只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。

1.1.2酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞。

1.1.3 机械法和酶解法比较机械法：①细胞不受到酶的伤害；②不用质壁分离；③细胞产量低；④细胞易破。

酶解法：①细胞受到酶的伤害；②要质壁分离；③细胞产量高；④细胞不易破。

1.2由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞1.2.1 诱导产生愈伤组织1.2.2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；1.2.3 Subculture(将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物)。

2 Suspension culture2.1 概念是指一种在受到不断摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统。

2.2 特点2.2.1细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2.2.2能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。

必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。

2.3 起始悬浮液的制备2.4 悬浮培养的基本形式2.4.1分批培养（Batch culture）2.4.1.1 含义将细胞分散在一定容积的培养基中进行培养。

在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。

它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。

2.4.1.2 特点①培养基体积固定；②当培养基中的营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长也停止；③必须适当搅拌。

2.4.1.3继代的方法和最佳时期继代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。

在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。

细胞的生长呈S形曲线。

悬浮细胞培养技术课件

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悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术.进一步掌握细胞培养的操作技术.实验原理：培养细胞生长一定时间后,需别离再培养,否那么细胞因生存空间不够,细胞密度过大,致营养缺乏而引起细胞发老、停止生长甚至死匚.为了维持细胞的存活和生长,必须进行再培养,即将原培养瓶内细胞别离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养.实验用品：〔一〕仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱〔4C、-20 C、-70 C〕、倒置相差显微镜、培养箱；〔二〕玻璃器皿吸管〔弯头、直头〕、培养瓶、废液缸、〔三〕塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架〔四〕其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪〔五〕试剂1640培养液、PBS操作步骤：1 .准备：翻开培养液,PBS取出离心管,拧开管盖,管盖倒放.从吸管筒中依次取出吸管,装上吸头,插入离心管备用.2 .从培养箱内取出细胞,放在显微镜下观察其生长状态、密度.3 .首先观察培养板孔中培养液量.用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液, 转入离心管中.再另取一只吸管吸取PBS放入培养板孔中,轻轻吹打孔壁,吸出转入离心管.4,离心,设置离心机1000转/分,4-5分钟.5,取出离心管,轻轻吸出上清,倒入废液缸.吸取培养液约7ML放入离心管, 轻轻吹打细胞,使之均匀悬浮.6,吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中,备计数用.7.其余的细胞分别放入六个孔中,每孔约1ML8,吸取培养液参加板孔中至1/3孔容量.9.镜下观察细胞是否分布均匀,放入培养箱培养.二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期-指数增生期-停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩,胞体呈圆球形,然后细胞贴附于载体外表,称贴壁,悬浮期结束,细胞贴壁速度与细胞种类,培养基成分,载体的理化性质等密切相关.一般情况下,原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24小时或更多,而传代细胞系贴壁速度快,通常10-30分钟即可贴壁.细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期,原代培养细胞潜伏期长,约24-96小时或更长,连续细胞系和月中瘤细胞潜伏期短,仅需6-24小时.(2)指数增生期(logarithmic growth phase)这是细胞增殖最旺盛的阶段,分裂相细胞增多.指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志.通常以细胞分裂相指数( Mitotic index, MI)表示,即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%,原代细胞分裂指数较低,而连续细胞和月中瘤细胞分裂相指数可高达3%-5%.指数增生期的细胞活力最好时期,是进行各种实验最正确时期, 也是冻存细胞的最好时机.在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续3-5天后,随着细胞数量不断增多、生长空间减少,最后细胞相互接触集合成片.正常细胞相互接触后能抑制细胞运动,这种现象称接触抑制现象(contact inhibition).而恶性月中瘤细胞无接触抑制现象,能继续移动和增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(piled up).细胞接触集合成片后,虽然发生接触抑制,但只要营养充分,细胞仍能进行增殖分裂,因此细胞数仍然在增多. 但是,当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养枯竭和代谢产物的影响,导致细胞分裂停止,这种现象称密度抑制现象(Density Inhibition ).(3)停滞期(Stagnate phase)细胞数量到达饱和密度后,如不及时进行传代,细胞就会停止增殖,进入停止期. 此时细胞数持平,故也称平台期(Plateau phase ).停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动.如不进行别离传代,细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH下降等因素中毒,出现形态改变,贴壁细胞会脱落,严重的会发生死亡,因此,应及时传代.实验目的：1 .能独立的进行细胞技术,会绘制生长曲线,了解细胞生长的发育特性.2 .学习在科研中如何应用生长曲线实验原理：生长曲线的测定(计数法)是测定细胞绝对生长数的常用方法,也是判定细胞活力的重要指标,为培养细胞生物学特性的根本参数之一. 一般细胞传代之后,经过长短不同的潜伏期,即进入大量分裂的指数生长期.在细胞到达饱和密度后, 停止生长,进入平顶期,然后退化衰亡.为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化, 需连续对细胞进行计数,通常计数7天.为精确起见,一般每次计数三瓶细胞并取平均值. 典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期,成平台状的平顶期及退化衰亡四个局部.以存活细胞数对培养时间做图,即生长曲线.生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响.一般在对数期的1/3-1/2处加药.细胞技术的时间和次数依实验目的而定.另外,测定生长曲线的常用方法还有MTTWo计数板原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时, 通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目.操作步骤：1 .将计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板,放在镜下观察.2 .制备细胞悬液：细胞从培养板孔转移到离心管, 离心1000转4-5分钟,弃去上清,参加PBS至一定体积(1MD.3 .将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间,静置3min,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中.4 .计算板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的.然后按公式计算：细胞数加1二四大格细胞总数/4 X 104说明：公式中除以4,由于计数了4个大格的细胞数.公式中乘以104由于计数板中每一个大格的体积为：1.0mm (长)x 1.0mm (宽)x 0.1mm (高)=0.1mm3而1ml=1000mm3(注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团, 应按单个细胞计算,假设细胞团10%Z上,说明分散不好,需重新稀释制备细胞悬液)台盼兰染色操作步骤：1、制备细胞悬液,放入EP管中.2、以1: 1的比例参加0.4%台盼兰染7取,染色2 — 3分钟.3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片.4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计算细胞活力.冻存与复苏一、哺乳动物细胞冷冻保存实验目的：(1)保存种子细胞,以便随时取用.这是保存细胞的最主要目的(2)减少细胞被微生物污染的危险性.(3)减少细胞之间交叉污染的危险性.(4)减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变.(5)防止有限细胞系出现衰老或恶性转化.实验原理：细胞冻存及复苏的根本原那么是慢冻快融,实验证实这样可以最大限度的保存细胞活力.目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚碉作保护剂,这两种物质能提升细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤.复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,防止由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤.实验用品：〔一〕仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱〔4C、-20 C、-70 C〕、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱.〔二〕玻璃器皿吸管〔弯头、直头〕、培养瓶、玻璃瓶〔250ml、100ml〕、废液缸；〔三〕塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管〔10ml〕、15ml离心管、冻存管〔1〜2ml〕〔四〕其他物品微量加样枪、红血球计数板、记号笔、移液枪.〔五〕试剂1640培养液、DMSO〔分析纯〕K562细胞,慢性粒细胞白血病细胞系中的一种.操作步骤：1 .准备：翻开培养液,PBS取出离心管,拧开管盖,管盖倒放.从吸管筒中依次取出吸管,装上吸头,插入离心管备用.2 .配制冻存液：吸取9ML培养液放入离心管,用移液枪吸取1MLDMSO?液,逐滴缓慢参加离心管中.最好把离心管插在冰中.3 .从培养箱内取出细胞,放在显微镜下观察其生长状态、密度.4 .吸出1个孔中的细胞连同培养液,转入离心管中.再另取一只吸管吸取PBS放入培养板孔中,轻轻吹打孔壁,吸出转入离心管.5 .离心,设置离心机1000转4-5分钟.取出离心管,轻轻吸出上清,倒入废液缸.轻轻吸出余下的培养液,注意勿吸出细胞沉淀.6 .吸取1ML配制好的冻存液参加离心管,与细胞混匀后,转入冻存管.7 .标注：标明细胞种类、冻存日期,冻存人.8 .在4 c冰箱中放置30分钟；然后转入-20 C ,放置30分钟；然后再转入-80 C 放置16- 18小时(或过夜)；最后放入液氮中长期保存.有条件的地方, 可用冻存盒. 考前须知：(1)冻存过程需缓慢(2)冻存细胞必须处在对数生长期,活力大于90% ,无微生物污染.(3)细胞浓度限制在：1 X 107 — 5 X 107/ml.(4)使用适宜的细胞冷冻保护剂,以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏.目前,最常用的冷冻保护剂是DMSOf甲基亚碉),使用终浓度为5—10%.但是, 有些细胞系不能用DMSO为冷冻保护剂,如人白血病细胞系HL-60.由于,DMSC^ 诱导HL-60细胞分化.在这种情况下,可选用其它冷冻保护剂,如甘油(glycele ), 羟乙基淀粉等.(5) DMSO释时会释放大量热量.因此,DMSO^能直接加到细胞液中,必须事先配制.细胞复苏操作步骤：(一)准备工作1、37c水浴2、准备一个内装5-10 ml细胞完全培养液离心管.(二)复苏1、带手套,用银子将细胞冷冻管从液氮中取出,迅速放入37c水浴中,手持冻存管不断摇动.观察完全解冻后移入超净台.冷冻管在水浴中解冻时,液面不可超过冻存管盖面,否那么,易发生污染.2、翻开冻存管,迅速将细胞悬液吸到离心管中,轻轻混匀.3、1000rpm离心5 min ,弃去上清液.4、沉淀中参加适当培养基,37c常规培养,第二天观察生长情况.考前须知：1 .解冻操作过程动作要轻.由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱,不仅解冻速度要快,而且动作要轻.2 .解冻时务必注意平安,预防冷冻管爆裂.,要带手套,用银子将细胞冷冻管从液氮中取出,切不可直接用手,以免冻伤.。

[课件]贴壁细胞和悬浮细胞PPT

[课件]贴壁细胞和悬浮细胞PPT

的处理，普通的细胞就可以贴附生长。
思考：玻璃的培养瓶有哪些缺点？
• 随着有机化学工业的发展，人们合成了聚苯乙烯（Polystyrene），简称PS。
此后每次看到别人说PS……，我都会想到聚苯乙烯，o(╯□╰)o。
• PS： PS透光性能好，具有较好的强度和易塑性，并且没有毒性。
因此有一天一个学生物的孩子突发奇想，这聚苯乙烯做成培养瓶岂不刚好？
贴壁细胞在体外培养为什么要贴壁？
重力作用
自然属性 贴 壁 过 程细胞下沉 至瓶底源自分泌细胞外基质 和粘附分子
主要原因
贴壁
细胞外基质和粘附分子
• 英文名： extracellular matrix& cell adhesion molecules, ECM&CAM • 定义：细胞粘附分子是众多介导细胞间
化学帝：你有机化学是体育老师教的吧。。。。
聚苯乙烯
• 聚苯乙烯结构表明了它是疏水的，即不具有亲水性，所
以未经过特殊处理的聚苯乙烯培养瓶不能使贴壁细胞正
常贴壁。
• 生物控表示很伤心，化学帝很淡定的笑了笑：哥可以改
造它。于是就有了今天广泛使用的聚苯乙烯培养瓶。
• TC处理（ Tissue Culture Treated ）： TC处理表示该
贴壁细胞和悬浮细胞
悬浮细胞
• 英文名：Suspension Cell
• 定义：细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，这类细胞称
为悬浮细胞。
• 悬浮培养的细胞一般为淋巴细胞等血液系统来源的
细胞，这种细胞体积小，它们天生就生活在悬液 （血液中）。由于缺乏粘附分子的表达，在培养基 中便自然呈现悬浮状态，细胞大体呈球形或椭球形。
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悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。

进一步掌握细胞培养的操作技术。

实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。

为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。

实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。

从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。

2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。

3.首先观察培养板孔中培养液量。

用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。

再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。

4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。

5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。

吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。

6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。

7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。

8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。

9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。

二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。

一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。

细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。

(2) 指数增生期(logarithmic growth phase)这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。

指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。

通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。

一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。

指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。

在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。

正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contactinhibition)。

而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。

细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。

但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。

（3）停滞期(Stagnate phase)细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。

此时细胞数持平，故也称平台期（Plateau phase）。

停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。

如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡，因此，应及时传代。

实验目的：1.能独立的进行细胞技术，会绘制生长曲线，了解细胞生长的发育特性。

2. 学习在科研中如何应用生长曲线实验原理：生长曲线的测定（计数法）是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，为培养细胞生物学特性的基本参数之一。

一般细胞传代之后，经过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。

在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。

为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数，通常计数7天。

为精确起见，一般每次计数三瓶细胞并取平均值。

典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，成平台状的平顶期及退化衰亡四个部分。

以存活细胞数对培养时间做图，即生长曲线。

生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。

一般在对数期的1/3-1/2处加药。

细胞技术的时间和次数依实验目的而定。

另外，测定生长曲线的常用方法还有MTT法。

计数板原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

操作步骤：1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板，放在镜下观察。

2. 制备细胞悬液：细胞从培养板孔转移到离心管，离心1000转4-5分钟，弃去上清，加入PBS至一定体积（1ML）。

3. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。

然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3 而 1ml=1000mm3（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新稀释制备细胞悬液）台盼兰染色操作步骤：1、制备细胞悬液，放入EP管中。

2、以1：1的比例加入0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计算细胞活力。

冻存与复苏一、哺乳动物细胞冷冻保存实验目的：（1）保存种子细胞，以便随时取用。

这是保存细胞的最主要目的。

（2）减少细胞被微生物污染的危险性。

（3）减少细胞之间交叉污染的危险性。

（4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。

（5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。

实验原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸；（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）（四）其他物品微量加样枪、红血球计数板、记号笔、移液枪。

（五）试剂1640培养液、DMSO（分析纯）K562细胞，慢性粒细胞白血病细胞系中的一种。

操作步骤：1. 准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。

从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。

2. 配制冻存液：吸取9ML培养液放入离心管，用移液枪吸取1ML DMSO溶液，逐滴缓慢加入离心管中。

最好把离心管插在冰中。

2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。

3.吸出1个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。

再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。

4.离心，设置离心机1000转4-5分钟。

取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。

轻轻吸出余下的培养液，注意勿吸出细胞沉淀。

5.吸取1ML配制好的冻存液加入离心管，与细胞混匀后，转入冻存管。

6.标注：标明细胞种类、冻存日期，冻存人。

7.在4℃冰箱中放置 30 分钟；然后转入-20℃，放置30 分钟；然后再转入-80℃放置16－18 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。

有条件的地方，可用冻存盒。

注意事项：（1）冻存过程需缓慢（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。

（3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。

（4）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。

目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5－10％。

但是，有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。

因为，DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。

在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。

（5）DMSO 稀释时会释放大量热量。

因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。

细胞复苏操作步骤：（一）准备工作1、37℃水浴2、准备一个内装5-10 ml 细胞完全培养液离心管。

（二）复苏1、带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，手持冻存管不断摇动。

观察完全解冻后移入超净台。

冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。

2、打开冻存管，迅速将细胞悬液吸到离心管中，轻轻混匀。

3、1000rpm离心5 min，弃去上清液。

4、沉淀中加入适当培养基，37℃常规培养，第二天观察生长情况。

注意事项：1.解冻操作过程动作要轻。

由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。

2.解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。

，要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，切不可直接用手，以免冻伤。