反相高效液相色谱法检测虾青素_陈晋明

反相高效液相色谱法检测虾青素*陈晋明1,2　王世平1　陈　敏1(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京　100083;　2.山西农业大学食品科学与工程学院,太谷　030801) 摘要　建立了一种快速检测虾青素的高效液相色谱法。

色谱柱为D ik m a D i amonsil T M-C18(250mm×4.6mm .i d.,5μm),柱温为25℃,甲醇为流动相,检测波长为478n m。

虾青素的质量浓度在1～10μg/mL内与色谱峰面积线性关系良好,相关系数为0.9997,该方法测定结果的相对标准偏差为0.38%(n=6),回收率为99.7%。

关键词　虾青素　高效液相色谱　雨生红球藻　侧金盏花 虾青素(A staxan t h i n,3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素),又名虾黄质、龙虾壳色素,是海洋生物体内主要的类胡萝卜素之一[1～2]。

近年来大量的研究表明,虾青素具有许多重要的生物学功能,可作为维生素A原,其抗氧化性强于β-胡萝卜素和维生素E,虾青素能清除体内由紫外线照射产生的自由基、抑制多不饱和脂肪酸的氧化、调节免疫功能、改善视力、加速色素形成以及抗肿瘤等[3]。

同时,虾青素具有特殊的鲜艳粉红色,可用于食品、化妆品的着色以及作为水产养殖的饲料添加剂。

目前,虾青素的生产已形成一定规模,其销售额达数亿美元,市场前景十分广阔[4]。

因此对虾青素的分析检测引起了人们的重视,国内外已有文献报道虾青素的分析检测方法[5～7],但这些方法多数分析时间较长或分析过程较复杂。

笔者采用反相高效液相色谱法对雨生红球藻粉及侧金盏花粉中的虾青素进行了快速的定性、定量分析,分析灵敏度高,结果可靠,为虾青素的综合利用提供了科学依据。

1　实验部分1.1　主要仪器与试剂 高效液相色谱仪:LC-10ATVP型,日本岛津公司; 紫外-可见分光光度检测器:SPD-10AVP型,日本岛津公司; 双光束紫外可见光光度计:TU-1901型,北京普析通用仪器有限公司; 水浴恒温振荡器:PHZ-82型,常州国华电器公司; 高速冷冻离心机:TGL-16G-A,上海安亭科学仪器厂; 虾青素标准品:美国Sig m a公司; 甲醇:色谱纯; 甲醇、二氯甲烷:分析纯; 雨生红球藻粉样品:市售; 侧金盏花:某农科院; 虾青素标准储备液:0.1m g/m L。

准确称取10.0m g虾青素标准品,用甲醇-二氯甲烷(体积比为3∶1)溶剂定容于100m L的棕色容量瓶中,制得储备液,充氮密封、冷藏备用; 实验用水为二次蒸馏水。

1.2　样品制备 用二次蒸馏水将雨生红球藻粉样品水洗3次后冷冻干燥,称取5g已除去水分的藻粉于具塞三角瓶中,加入甲醇-二氯甲烷(体积比为3∶1)的混合溶剂50mL,同时加10颗玻璃珠,最后将三角瓶外罩褐色塑料薄膜,放入40℃的水浴恒温振荡器中振荡30m in,提取液在低温下离心20m in,将上清液转移至另一三角瓶中。

重复以上的提取步骤2～3次,直至藻粉中的色素基本提取完全,藻粉沉淀呈土灰色。

收集所有的上清液,混合,低温冷藏待测。

将侧金盏花花朵阴干粉碎,然后提取色素。

提取方法同雨生红球藻粉。

1.3　色谱条件 色谱柱:D ikm a D ia m onsil T M-C18,250mm×4.6 mm.i d.,5μm;柱温:25℃;流动相:甲醇,流速为1 mL/m in;检测波长:478n m;进样量:20μL。

2　结果与讨论2.1　虾青素标准溶液的吸收光谱 取适量虾青素标准储备液,用甲醇-二氯甲烷(体积比为3∶1)的混合溶剂稀释成浓度为1μg/m L 的标准溶液,在TU-1901双光束紫外可见光光度计中进行光谱扫描,得到吸收光谱图见图1。

由图1可知,虾青素在478n m处有最大吸收。

因此检测波 *国家科技攻关计划项目(2001BA804A21) 收稿日期:2005-12-3027陈晋明,等:反相高效液相色谱法检测虾青素长选择478n m。

图1　虾青素标准溶液的吸收光谱图2.2　虾青素标准样品的稳定性 虾青素属于类胡萝卜素,易受温度、氧化及光照影响而发生降解,本实验对虾青素标准样品的稳定性进行了研究。

取两份虾青素标准溶液,一份暴露于自然条件下,另一份充氮密封并避光保存在-18℃的冰箱中。

暴露于自然条件下的样品每隔1h 测一次,而冰箱保存的样品每隔1d 测一次。

试验结果表明,虾青素样品在自然条件下,2h 后样品中的溶质含量开始有明显的减少,而在冰箱保存条件下3d 后开始出现减少现象。

所以对虾青素检测分析时,样品和标准样品的最佳保存时间为3d ,并且低温、避光保存,同时还要防止氧化。

2.3　标准工作曲线 取虾青素标准储备液,配制成浓度为1、2、4、6、8、10μg /m L 的系列标准使用液,按1.3中的色谱条件分别进样3次,以虾青素的质量浓度X (μg /m L )为横坐标,相应的峰面积Y 为纵坐标进行线性回归,由色谱工作站处理数据得到的回归方程为:Y =436990X +106079,r =0.9997。

2.4　精密度试验 取虾青素标准储备液,逐级稀释为0.05m g /m L 的标准使用液。

按1.3中的色谱条件进样20μL ,重复进样6次,测出色谱峰的面积,计算求得虾青素色谱峰面积的相对标准偏差为0.38%,结果列于表1。

表1　精密度试验结果序号峰面积平均值RSD /%123456235766812375743023654687236490572348760923657748236305350.382.5　回收试验 取含虾青素的藻粉提取液3份,按照1.3的色谱条件进行检测,然后分别加入已知量的虾青素标准样品进行回收试验,测定结果及回收率计算结果见表2,由表2可知平均回收率为99.7%。

表2　回收试验结果(n =3)本底值/μg m L -1加入量/μg mL -1测得量/μg mL -1回收率/%平均回收率/%RSD /%2.352.054.3999.50.332.355.107.47100.499.70.372.359.2011.4899.20.432.6　样品分析2.6.1　样品色谱图 用该方法对雨生红球藻粉和侧金盏花进行分析,虾青素标准样品、雨生红球藻粉和侧金盏花的色谱图分别见图2、图3、图4,由图3、图4可知,本方法可以对雨生红球藻粉及侧金盏花粉中的各种色素进行分离。

图2　虾青素标准样品的色谱图图3　雨生红球藻粉提取液色谱图图4　金盏花粉提取液色谱图2.6.2　测定结果 根据雨生红球藻粉与侧金盏花提取液中虾青素的色谱峰,由回归方程求得虾青素含量列于表3。

表3　样品中虾青素的含量μg /m L 样品测定值平均值雨生红球藻粉0.399　0.401　0.387　0.412　0.3970.399侧金盏花粉1.011　1.015　1.008　1.021　1.0131.0143　结论 以单一溶剂甲醇为流动相,采用高效液相色谱法分离分析食品中的天然色谱虾青素,灵敏度、精密度较高,测定结果可靠,可作为天然色素虾青素的工业化生产过程中的快速检验方法。

参考文献1　Yokoya m a A ,M ikiW.C o m position and p res um ed b iosyn t hetic pat h -w ay of carot enoi ds i n t h e astaxanthin -produ ci ng b acteri um agrobacte -28化学分析计量2006年,第15卷,第2期 ri um au ran ti acum.FE M S M i crob i o lLett,1995,128:1392　郑裕国,王远山,薛亚平.抗氧化剂的生产及应用.北京:化学工业出版社,2004.3　M i k iW.B iol ogi cal f unctions and acti vities of an i m al caroten i ods.Pu re App lCh e m,1991,63(1):1414　应国庆,王晓艳,沈寅初.高效液相色谱法分析检测虾青素.食品与发酵工业,2001,27(11):435　Yu an Jianping,Ch en Feng.Ch ro m at ographic separation of tran s-astaxan t h i n fro m the extract s of hae m at ococcus p l uvialis.J Ag ric Food C he m,1998,46(8):33716　谢虹,张慧碧,何国平,等.高效液相色谱法测定虾青素的含量.粮食与饲料工业,2003(1):467　陈勇,李德发,陆文清,等.测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量的高效液相色谱法.分析测试学报,2003,22(4):28DETER M INATI O N OF A STAXANTH I N BY REVERSED-PHASE H I GHPERF OR MANCE LIQU I D CHROMATOGRAP HYChen Ji n m i ng1,2,W ang Sh i ping1,Chen M in1(1.C oll ege of Food Science and N utritional Engi neering,Ch ina Agricu lt u ralUn i versity,Beiji ng　100083,Ch ina;2.C oll ege of Food S cience and Engineeri ng,Shanxi Agricu lt u ralUn i versity,Taigu　030801,C hina) AB STRACT　A m ethod fo r deter m i ning ast axanthi n by usi ng reversed-phase high pe rfor m ance liquid chrom atography wa s deve l-oped.The ch ro m a t og raphy conditions w ere:D i k m a D i amonsil T M-C18co l u m n(250mm×4.6mm.i d.,5μm)at25℃,me t hano l as m ob ile phase w it h t he fl ow rate o f1mL/m i n,and detecti on w ave leng t h a t478n m.The concentrati on o f astaxan t hin w as linea r w ith chrom atograph peak a rea i n t he range of1-10μg/m L(r=0.9997).The RSD was0.38%(n=6),and t he re covery w as99.7%. The m e t hod w as proven to be si mp l e,accura te,and re liable in deter m i ning a staxant h i n in hae m atococcus pluv ialis and adonis amu ren-sis.K EY W ORDS　astaxanthin,H PLC,haema tococcus pluv ialis,adonis a m urensis《中华人民共和国进口计量器具型式审查目录》8月1日起实施 1月19日,从国家质检总局获悉,《中华人民共和国进口计量器具型式审查目录》(以下简称新目录)已于1月13日公布,自8月1日起实施。