影响测定反相高效液相色谱流动相pH值的因素

反相高效液相色谱法测定苹果酸发酵液中的有机酸黄慧敏;张伟国【摘要】Reversed phase HPLC method was applied to determine organic acid in malic acid fermentation liquor in this paper. The chromatographic conditions are finally conformed to apply to all kinds of organic acid content deter-mination in the fermentation. The conditions are as follows：COSMOSIL 5C18 - PAQ column （4.6 mm I.D. × 250 mm） was used at 23℃. UV detection wavelength was 210 nm. Solution containing 1% acetonitrile and 20mmol/L KH2PO4 at pH 2.8 was used as mobile phase with flow rate of 0.5 mL/min. The seven organic acids in malic acid fermentation liquor were preferably separated under these conditions. The recovery ratio was 94.2% - 102.7% and the method had good accuracy and precision.%采用反相高效液相色谱法分析测定苹果酸发酵液中的有机酸，最终确定了适用于发酵液中各种有机酸含量测定的色谱条件，色谱柱：COSMOSIL5C18-PAQ（4．6mmI．D．×250mm）；紫外检测波长：210nm；流动相：1％乙腈-20mmol／L KH2PO4溶液（pH2．8）；流速：O．5mL／min；柱温：23℃。

液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）的分离度是衡量样品中化合物分离的能力，它取决于多个因素。

以下是液相色谱分离度影响的主要因素：
柱填料性质：柱填料的性质直接影响分离度。

包括柱填料的化学性质、表面性质、孔径大小和密度等。

不同的填料可以选择性地吸附和分离化合物，影响分离度。

流动相组成：流动相的成分对分离度有很大影响。

不同的溶剂、缓冲盐和酸碱条件，以及它们的浓度和比例选择都会对分离度产生影响。

流速：流速是溶液在色谱柱中通过的速度。

较低的流速有助于提高分离度，因为它提供更多的时间进行分离。

然而，过低的流速可能导致分析时间过长。

柱温：柱温影响分离度和分离速度。

温度的升高可以提高分离速度，但要注意温度对填料和样品的稳定性的影响。

pH值：样品的pH值可以影响化合物的离子状态，进而影响分离度。

pH值的调节可以改变离子交换色谱和亲水性相互作用等分离机制。

柱长度和内径：柱的长度和内径对分离度有一定影响。

柱长度的增加可以提高分离度，但同时也会延长分析时间。

较小的柱内径可能提高效率，但也需要考虑液相压力和样品负载量的限制。

注入量：样品的注入量过大会导致峰形变宽和峰分离不清晰，从而降低分离度。

注入量的选择应根据柱填料和样品的特性进行优化。

除了上述因素，还有其他因素如溶剂纯度、洗脱梯度程序和系统的稳定性等也会对液相色谱的分离度产生影响。

因此，在设计和优化液相色谱方法时，需要综合考虑这些因素以达到最佳的分离效果。

简述高效液相色谱法中流动相的要求高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）是一种用于分离和分析化学、生物和制药样品的色谱技术。

在高效液相色谱过程中，流动相的选择和性能对分析的准确性和分离效果有着重要的影响。

下面将详细介绍高效液相色谱法中流动相的要求。

1.基础流动相特性：流动相应具有一定的极性和溶解性能。

常用的流动相包括水和有机溶剂，如甲醇、乙醇和乙腈等。

流动相的选择应考虑到待分离组分的性质和分析目的，要保证样品能够溶解并很好的分离。

常用的流动相配比为水/有机溶剂（如乙腈）的比例，比如常见的70:30、50:50等。

2.pH值调节：根据待分离物和色谱柱的性质，适当调节流动相的pH值可以改变待分离物的电离状态，从而影响它们在色谱柱上的分配行为。

比如，对于具有酸性基团的分析物，可以通过酸或碱的加入来调节流动相的pH值，以影响它们与色谱固定相之间的相互作用。

3.离子强度调节：有些样品中可能存在电解质，其离子强度会对分离产生影响。

在这种情况下，可以通过添加相应的盐来调节流动相的离子强度，以改变分析物与色谱固定相的相互作用。

常用的盐有甲酸铵、硫酸铵、三氟乙酸等。

4.流速控制：流动相的流速也对色谱分离的效果有着重要的影响。

流速过快可能导致分离不充分，流速过慢则会增加分析时间。

流速的选择需根据待分离物的性质、色谱柱的尺寸和色谱仪的性能等因素综合考虑。

5.除气和过滤：流动相中的气泡和杂质会影响液相的流动性和检测信号的稳定性。

因此，在使用前应对流动相进行除气处理，以减小气泡对色谱分离的干扰。

同时，对流动相进行过滤处理，可以去除其中的固体颗粒和微生物等。

通常使用0.45μm的滤膜进行过滤。

6.流动相稳定性：流动相应具有良好的稳定性，以保证分析结果的准确性和重复性。

一般来说，流动相中的溶液成分要充分溶解，不发生相分离和析出现象。

所以，流动相的配制要求严格，要遵循相应的配方和混合方法，并在使用前进行充分的搅拌和均匀。

高效液相色谱流动相高效液相色谱的流动相(Mobile Phase)液相色谱流动相通常是各种低沸点溶剂和水溶液。

与气相色谱相比较，液相色谱流动相不仅可选择范围比较大，而且它是影响分离的一个非常重要的可调节因素。

在实际工作中，流动相的选择和优化是确定色谱分析的主要工作。

一、流动相溶剂的选择高效液相色谱中所选用的流动相溶剂必须能保证该色谱系统的分离过程可重复进行:溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求;溶剂应当不干扰检测器的工作;在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。

从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。

对液相色谱溶剂的要求: 1)溶剂要有一定的化学稳定性, 不与固定相和样品组分起反应。

2)溶剂应与检测器匹配，不影响检测器正常工作。

3)溶剂对样品要有足够的溶解能力，以提高检测灵敏度。

4) 溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。

5) 溶剂的沸点低，有利于制备色谱的样品回收。

液相色谱流动相溶剂的选择步骤选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等选择合适洗脱强度的溶剂:简单样品，2 ? k'? 5;复杂样品，0.5 ? k'? 20 改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的α值二、表征溶剂特性的重要参数 1)溶剂沸点、分子量、相对密度、介电常数、偶极距、折射指数、紫外吸收截止波长、与液相色谱分离密切相关的最重要的溶剂特性参数是溶剂强度参数?? ，溶解度参数?? ，极性参数P'和粘度η。

2) 溶剂洗脱强度溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力。

在吸附色谱中, "溶剂洗脱强度"与溶剂极性成正比;而在反相色谱中，溶剂极性越大, 洗脱能力越小。

在液相色谱常用混合溶剂作流动相。

混合溶剂的P'具有加和性: P'ab= ??aP'a，?? bP'b , ??为某一溶剂的体积分数。

关于高效液相色谱仪流动相的选择如何呢高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于生命科学、化学、医药、环境等多个领域。

其中，流动相的选择对于色谱分离性能和分析结果的准确性有着重要的影响。

一、流动相的组成流动相是指用于在高效液相色谱仪中运载样品溶液，推动样品通过固定相柱的溶剂体系。

一般情况下，流动相由溶剂和缓冲剂组成。

溶剂用于将样品带入色谱柱，而缓冲剂则用于调整流动相的pH值。

在选择流动相的溶剂时，主要要考虑以下因素：1.溶剂极性：色谱柱的固定相特性和待分析的样品特性决定了所需的溶剂极性。

一般来说，溶剂可以选择非极性溶剂、极性溶剂或者两者的混合物，以适应不同的分析要求。

2.溶剂选择：常用的溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等有机溶剂，以及水。

甲醇和乙腈是最常用的有机溶剂，由于它们的极性较低，因此溶解性广泛。

水是最常用的极性溶剂，可以提供更好的分离效果。

3.透过性：一些样品需要在其中一种溶剂中分离，因此选择适当的溶剂对于分析结果的准确性至关重要。

在选择缓冲剂时，需要考虑以下因素：1.pH值的调整：一些分析需要在特定的pH值下进行，需选择合适的缓冲剂，以维持所需的pH值。

2.缓冲能力：缓冲剂应具有良好的缓冲能力，以维持流动相的pH值的稳定性，避免pH值对分离效果的干扰。

3.溶解度：缓冲剂应具有较高的溶解度，以便在高浓度下使用，从而提供稳定的pH值。

二、常用的流动相系统1.等相流动相系统（Isocratic elution）：等相流动相系统是指流动相组成在整个分析过程中保持不变。

这种系统适用于分离度较差的样品，具有简单、稳定、易操作的特点。

2. 梯度流动相系统（Gradient elution）：梯度流动相系统是指在分析过程中，通过改变流动相组成来实现样品的分离。

这种系统适用于需要分离程度较高的样品，提供了更好的分离效果。

高效液相色谱常见故障及解决方案1.压力过高或过低-压力过高可能是由于柱堵塞或流动阻力增加所致。

解决方案包括更换柱、清洗柱或检查管路是否存在问题。

-压力过低可能是由于泵的磁力搅拌器不工作或进样器封堵所致。

解决方案包括检查泵的磁力搅拌器是否工作正常，清洗进样器。

2.峰形不对称-峰形不对称可能是由于进样量不均匀或柱温度过高所致。

解决方案包括确保进样量均匀和降低柱温度。

3.峰尾或前肩-峰尾可能是由于柱温度过高、流速过快或流动相pH值不合适所致。

解决方案包括降低柱温度、减慢流速或调整pH值。

-前肩可能是由于流动相中存在杂质或柱堵塞所致。

解决方案包括更换流动相或清洗柱。

4.杂峰或基线噪声-杂峰可能是由于样品纯度不高、固定相老化或试剂污染所致。

解决方案包括提高样品纯度、更换固定相或检查试剂是否污染。

-基线噪声可能是由于进样器密封不良、流动相气泡或电噪声所致。

解决方案包括检查进样器密封情况、减少流动相中的气泡或检查电子设备是否存在干扰。

5.柱寿命短-柱寿命短可能是由于样品预处理不彻底、柱收尾不当或流动相pH值不合适所致。

解决方案包括增加样品预处理步骤、正确收尾柱或选择合适的流动相pH值。

6.流量不稳定-流量不稳定可能是由于柱堵塞、进样器密封不良或流动相流速波动所致。

解决方案包括清洗柱、检查进样器密封情况或调整流动相流速稳定性。

7.进样量偏差-进样量偏差可能是由于进样器封堵、进样器针头磨损或进样器流速不稳定所致。

解决方案包括清洗进样器、更换进样器针头或调整进样器流速稳定性。

8.柱温度不稳定-柱温度不稳定可能是由于温控系统故障或环境温度变化所致。

解决方案包括检查温控系统是否工作正常或采取措施保持恒定环境温度。

这些是HPLC常见故障及其解决方案的例子。

在实际操作中，操作人员应该根据具体情况诊断和解决故障，并遵循相关的操作规程和安全操作指南。

高效液相色谱法（反相液相色谱）一、液相色谱法方法的分类和选择1、方法的分类：根据流动相和固定相极性的相对强弱，液相色谱法分为正相色谱法和反相色谱法。

两类色谱使用流动相极性顺序与物质的极性流出顺序恰好相反。

正相色谱法中通常固定相的极性较大，，如硅胶、氧化铝等，流动相极性小于固定相的极性。

实验时，流动相的选择从极性小到极性大递增，样品中极性弱的组分最先流出，随后是极性逐步增大的组分流出。

反相色谱中使用的固定相极性小，如C18键合的硅胶固定相，流动相的极性大于固定相的极性。

通常用水-甲醇作流动相时，样品中极性强的组分先流出，随后是极性较小的组分。

流动相的极性变化从最大的水开始，逐步增加甲醇的比例，流动相的极性逐步减弱。

在HPLC中应用最广泛的是反相分配色谱法（常称为反相色谱法）。

它是利用样品组分在流动相和固定相之间的溶解度之差进行分离。

在反相色谱柱中改变流动相组成、进行梯度淋洗和恢复柱子分配平衡容易实现，因此同一柱子可以长时间使用，柱效长久，重复性较好。

在反相色谱法中，极性大的组分先出峰，保留体积小，峰形扩散小，分离效率高，流动相价格便宜，毒性较小，容易得到。

正相色谱法大多利用吸附的原理进行分离，正相色谱法的柱子如使用强极性的流动相（如水、醇等溶剂）会使柱中吸附剂活性失去后很难恢复，特别是分离极性强的组分时，常常因为固定相的吸附作用使保留体积增大，引起峰的扩散和拖尾。

2、方法的选择：HPLC方法的选择主要取决于样品的组成、结构的类型、溶剂性能、相对分子质量范围等。

一般来讲相对分子质量大于2000的高分子化合物，主要采用凝胶色谱法进行分离。

相对分子质量小于2000的化合物可以利用它在水中和有机溶剂中的溶解度及溶解性质进行分离。

如极性大的水溶性化合物和在水中可解离的离子化合物，可用不同类型的色谱柱以离子色谱法进行分离；在水中溶解但不解离的化合物（如糖类）可用反相色谱法进行分离，以甲醇或乙睛-水作为流动相。

高效液相色谱法的原理及影响因素高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是一种在液相中进行分离和分析的高效分析技术。

它具有高分辨率、高灵敏度、良好的线性范围和广泛的适用性。

以下是关于HPLC的原理和影响因素的详细介绍。

一、高效液相色谱的原理：高效液相色谱的原理基于物质在液态流动相中的分配和吸附特性，通过调节流动相的组成和性质，控制样品成分在固定相中的分离。

高效液相色谱的基本组成包括进样器、流动相系统、柱和检测器。

1.进样器：样品通过进样器引入色谱柱中。

进样器可以分为自动进样器和手动进样器两种类型。

2.流动相系统：流动相系统由溶剂混合器、溶剂泵和压力传递系统组成。

溶剂混合器用于混合不同溶剂的比例，以制备合适的流动相。

溶剂泵用于将流动相以一定的流速送入色谱柱中，常用的泵有恒压泵和梯度泵等。

3.柱：色谱柱是高效液相色谱的核心部件。

分离是通过样品成分在柱中的相互作用和分配系数的差异实现的。

色谱柱常见的填充物包括C18、C8和氨基硅胶等，不同填充物对于不同的样品具有不同的分离效果。

4.检测器：搭配不同的检测器可以对样品成分进行定性和定量分析。

常见的检测器包括紫外可见光谱检测器（UV）、荧光检测器（FLD）、电化学检测器和质谱检测器等。

五、高效液相色谱的影响因素：高效液相色谱的分离和分析结果受多种因素的影响，包括以下几个方面：1.流动相组成：流动相的组成直接影响样品成分在固定相上的分配系数，进而影响分离效果。

流动相的成分要根据样品的性质和需要进行选择。

常用的流动相包括纯溶剂、溶剂混合物和缓冲液等。

2.流动相性质：流动相的性质包括溶液的pH值、离子强度、流速和温度等。

其中，溶液的pH值和离子强度的变化可以影响分析物的离子态，进而影响分离效果。

流速的选择要根据分析物的种类和浓度进行调整。

温度的增加可以提高分子的扩散速度，加快分离过程。

3.色谱柱：色谱柱的类型、填充物和尺寸等也对分离效果有重要影响。

如何选择液相色谱流动相PH和溶剂要求0000另外要注意以下3个方面:1.所选用流动相一定要能将峰检出--这个是基础条件，相信大家都知道。

2.流动相如为缓冲液，它的pH值应在它本身PKa的上下1个pH值内，如超出此范围，缓冲作用将大大减弱。

3.一般检测柱是C18，但使用C18柱时，流动相的pH值应在2~8之间，否则对柱子伤害较大。

根据以上要求，请选择适合自己实验的流动相。

c18反相柱对非极性的物质保留充分峰形对称，所以如果你的化合物是弱酸，记得好像流动相pHpKa-2时，弱酸就会基本以游离态存在，呈非极性，达很好保留出很好峰形!所以你的流动形相就的选择2~2.5当溶液PH值等于化合物的pKa时，化合物半解离。

在pKa±1.5的范围内，保留随PH值的变化而变化，超过此PH值范围，化合物完全解离或不解离，保留随PH值的变化很小。

了解化合物的pKa值，可在pKa±1.5的范围内调节流动相的PH值，以改变其保留，达到成分分离的目的。

或者，使流动相PH值超出这一范围，以保持保留的恒定，使建立的方法具有耐用性。

可参考《药物分析》化学工业出版社，盛龙生等P235~237谢谢楼上各位的热心解答，但你们讲的都不大一样，我该怎么确定呢?根据分析化学,当弱酸(弱碱)溶液中溶液中离子浓度是分子浓度的100倍时,可以认为是完全电离的,化合物完全以离子形式存在;当弱酸(弱碱)溶液中溶液中分子浓度是离子浓度的100倍时,可以认为是完全不电离的,化合物以分子形态存在.因此,为了防止HPLC中峰的拖尾,应当保证化合物全部以分子或离子形态存在,即溶液的pH值应与pKa有2个单位的差别(pH≥pKa±2).如果化合物的pKa是4.5,溶液的pH值至少应该是2.5或6.5.考虑到色谱柱的耐受性(pH=2~8;甚至是2.8~4.5)\保留时间\样品的复杂性要求,理论上你可以选择低pH值的流动相(pH2.5),也可以选择高pH值的流动相(pH6.5).至于最终选哪一个,做个对比就ok了.一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。

关于高效液相色谱仪流动相的选择如何呢高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种将混合物分离成单一组分的有效工具。

为了实现这种分离，高效液相色谱需要两种相：固定相和流动相。

其中，流动相是高效液相色谱仪中至关重要的组成部分之一，因为它决定着分离效果和分离时间。

因此，选择正确的流动相对于分离的精度和效率来说非常重要。

流动相简介流动相是指在柱床中连续流动的溶液。

在高效液相色谱中，流动相主要由溶剂和缓冲液组成。

溶剂是用于将样品分离的液体，在高效液相色谱仪中通常采用多种溶剂的混合物，称为流动相溶剂或者移动相溶剂。

缓冲液是在溶剂中加入的一种化学物质来调节流动相的pH值，缓冲液的作用是保持样品成分的稳定性和防止封堵柱床。

流动相的选择取决于样品的特性、分离要求和分析环境的条件。

因此，选择合适的流动相是高效液相色谱仪分离分析的关键因素之一。

流动相的分类根据溶剂的极性，流动相可分为两种类型：有机相和水相。

具体分类如下：有机相有机相通常由疏水性的有机溶剂组成，这些有机溶剂的极性比水低。

主要有以下三类：•极性较小的有机溶剂：含有醚、酮或者类似于苯、四氢呋喃等非极性有机溶剂的混合物。

•极性中等的有机溶剂：含有乙腈、甲醇、乙醇等极性有机溶剂的混合物。

•极性较大的有机溶剂：如乙二醇、N-甲基吡咯烷酮等。

水相水相是由水和缓冲液组成的混合物。

水是极性溶剂，本身具有良好的溶解性和稳定性。

缓冲液是在水中加入的一种化学物质来调节流动相的pH值。

流动相的选择原则在选择流动相时，需要考虑分析的目标和样品的特性。

下面列举几种常见的流动相选择原则：根据分析目标选择流动相首先，需要根据分析目标选择流动相。

如果需要分离极性物质，则应选择相对极性较强的水相，如果需要分离非极性物质，则应选择相对极性较弱的有机相。

如果需要同时分离多种溶质，则可以选择相组合。

根据样品的特性选择流动相如果样品是非极性的，则应选择相对极性较弱的有机相，例如乙酸乙酯-甲醇体系。

高效液相色谱法流动相的注意事项高效液相色谱法（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种广泛应用于化学、生物、医药等领域的分析技术。

在进行HPLC分析时，流动相的选择和使用是非常重要的。

下面将详细介绍关于HPLC流动相的注意事项。

1.流动相的选择：在选择流动相时，要考虑所分离的样品的性质，包括其溶解性、极性、酸碱性等。

一般情况下，流动相可以是纯溶剂或溶剂混合物，其中溶剂混合物可以根据需要进行优化。

常见的HPLC流动相溶剂包括水、有机溶剂（如甲醇、乙腈、二氯甲烷等）以及酸、碱溶液。

2.流动相的pH值调节：流动相的pH值对于样品的分离和检测具有重要影响。

在某些情况下，需要调节流动相的pH值以改变样品的离子状态或结构。

这可以通过加入缓冲剂来实现，一般情况下，可以根据样品的性质选择合适的缓冲剂。

3.流速的控制：流速的选择应根据需要平衡分离效果和分析时间。

流速过快可能导致峰形变宽、分离不理想，而流速过慢则会延长分析时间。

因此，需要根据样品的性质和分离要求合理选择流速，并在实验过程中进行优化。

4.流动相的净化和除气：使用之前，流动相需要经过净化处理以去除悬浮物和杂质。

此外，流动相中的气泡也会对分离效果产生干扰，因此需要除去气泡。

可以通过超声波处理、真空处理或使用气体瓶来除去气泡。

5.流动相的稳定性：流动相的稳定性对于HPLC分析至关重要。

在实验过程中，需要定期检查流动相的配制是否正确，是否出现沉淀、杂质等问题。

另外，一些样品可能会与流动相产生反应或降解，导致流动相的不稳定，需及时调整。

6.流动相的储存和保养：为了确保流动相的质量和稳定性，需要正确储存和保养。

一般情况下，流动相应避光保存，并在使用前用滤膜过滤以去除杂质。

当流动相已经使用一段时间后，可能会积聚杂质或可溶性样品残留，此时需要更换或清洗柱和系统以保持分析结果的准确性。

7.设备和仪器的选择和检查：在进行HPLC分析时，需要选择适当的设备和仪器，并定期检查和维护。

高效液相色谱法的常见问题及解决方法高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法，这些方法在使用的过程中往往会遇到诸如鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰、保留时间漂移、柱压过高等系列问题，如何解决这些问题呢?1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决?关于漂移问题：①温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定;②流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等;③柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡;关于快速变化问题①流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定;②泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出;③流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合;2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子;②存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子;③可能柱超载，减少进样量;3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法①样品量不足，解决办法为增加样品量;②样品未从柱子中流出。

可根据样品的化学性质改变流动相或柱子;③样品与检测器不匹配。

根据样品化学性质调整波长或改换检测器;④检测器衰减太多。

调整衰减即可;⑤检测器时间常数太大，解决办法为降低时间参数;⑥检测器池窗污染。

解决办法为清洗池窗;⑦检测池中有气泡。

解决办法为排气;⑧记录仪测压范围不当。

调整电压范围即可;⑨流动相流量不合适。

调整流速即可;⑩检测器与记录仪超出校正曲线。

解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理;②比例阀失效，更换比例阀即可;③泵密封垫损坏，更换密封垫即可;④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法;⑤系统检漏，找出漏点，密封即可;⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

高效液相色谱仪检测的影响因素及解决策略【摘要】上世纪六七十年代高压、高速、高效液相色谱仪的问世取代了传统液相色谱仪的应用，这一仪器具有流动相流速高、分离速度快且柱效高等优势，得到了广大科研工作者的青睐。

但液相色谱技术与相应的仪器设备在发展过程中愈发复杂，为了避免环境及人为等因素对色谱仪测量结果造成影响，本文分析了影响高效液相色谱仪测量时的几点因素，并提出了相应的解决策略。

【关键词】高效液相色谱仪；检测；影响因素因色谱仪测量过程中会对其造成干扰的影响因素繁多，无法实现统一归类，笔者以色谱仪的构造为切入点，根据各个系统可能受到的干扰因素进行分析并提出处理方式，主要有溶剂、温度、压力以及稳定性等方面。

下面对各部分可能对色谱仪测量结果造成影响的因素展开详细分析。

一、流动相储器和溶剂处理系统的影响因素与选择高效液相色谱仪通常配备有流动相溶剂储器，这一设备的主要作用是通过输液泵将其中的液体输送至色谱仪内部。

但是在使用过程中通常会存在部分微量气体残存于容器与缝中，这些气体通过色谱注释就会产生气泡并引发谱带展宽，最终对检测器的正常工作造成干扰。

因此储器的放置位置必须比泵体更高，从而保障二者之间存在输液静压差，使得微量气体能够顺利通过放气阀并排出。

与此同时，为了让容器能够更彻底地脱气，在使用过程中，还会对容器进行相应的预处理工作，一方面在搅拌的作用下真空或超声脱气，另一方式是通过氦气或氮气等惰性气体溶解于其中的空气带出[[1]]。

在此基础上，为了尽可能地规避杂质进入色谱仪，对泵体、进样阀造成损坏，或者出现色谱柱堵塞，还会将过滤器安装于储器的溶剂导管入口位置，以此来将容器中的灰尘及残渣颗粒等物质去除。

二、高压泵系统高压泵能够起到有效调节柱前压力的效果，以此来对流动向流速进行有效控制。

随着液相色谱柱的逐渐发展，填料粒径也越来越小，因此只有将柱前压调整越来越高，才能够使得流动性流速逐渐提升，实现对被检测物质的快速测量。

反相色谱流动相pH值怎么选大多数小分子药物是酸性或碱性化合物，它们常常带有各种官能团，如羟基、胺类、磺酸、吡啶、咪唑等。

对于这些可解离化合物在反相色谱中的保留与流动相的PH值有着密切的关系。

如何正确选择流动相pH在药物反相色谱分析方法开发中非常关键，可帮助分析人员减少试错时间和物质成本，从而提高工作效率。

缓冲溶液缓冲溶液指的是指由弱酸及盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的PH值相对稳定。

缓冲容量缓冲容量是指使单位体积缓冲溶液的PH改变1个单位时，所需加入的强酸、强碱的物质的量。

是衡量缓冲溶液缓冲能力大小的尺度。

单位mol/L pH或mmol/L pH。

pH氢离子浓度指数（hydrogen ion concentration）是指溶液中氢离子的总数和总物质的量的比。

pKa酸度系数以符号pKa来表示：当溶液中药物离子浓度和非离子浓度完全相等，即各占50%时，溶液的PH值称为该药的解离常数（pKa）。

一般来说，较大的Ka值（或较小的pKa值）代表专较强的酸，属这是由于在同一的浓度下，离解的能力较强。

利用酸度系数，可以容易的计算酸的浓度、共轭碱、质子及氢氧离子。

如一种酸是部分中和，Ka值是可以用来计算出缓冲溶液的pH值。

如何选择缓冲液pH值?在选择缓冲液pH值之前，应先了解被分析物的pKa，高于或低于pKa两个单位的值，有助于获得良好的峰形，溶液pH值高于或低于两个pKa单位，化合物99%以一种形式存在，才能获得好的尖锐的峰。

（一）考察离子化合物的pKa值在反相色谱分析中通常不要求化合物精确的pKa值，我们可以通过查阅文献或者根据化合物的结构按照下图中列出的主要酸碱官能团在水溶液的pKa值进行推测。

注意：按照上表中官能团进行估算时分子中相邻基团的不同会导致pKa出现1~2个单位的差异。

对于酸性化合物，当含有吸电子基团时会导致酸性增强，pKa值相应降低；对于碱性化合物，当含有吸电子基团时会导致碱性降低，pKa 值相应降低。

浅谈缓冲盐、离子对和有机改性剂对反相高效液相色谱保留的影响机理浅谈缓冲盐、离子对和有机改性剂对反相高效液相色谱保留的影响机理使用化学键合有机固定相的反相高效液相色谱已成为液相色谱中最重要的方法，在所有要进行分离分析的化合物中，有三分之二可用之来完成。

反相液相色谱最初是用来分离非极性和非离子型化合物的。

随着研究的不断深入，实践证明，将流动相的组分进行调节，往水溶性流动相中加入适当的缓冲液或有机改性剂，即控制流动相的二次化学平衡，能使大多数极性和离子性化合物在反相色谱中获得成功的分离；除对保留和选择性进行控制外，还可靠抑制干扰竞争平衡或副反应来改善峰形。

一、缓冲液的使用及离子抑制大量实验结果证实，对弱酸、弱碱这些在水溶性溶液中易发生离子化的样品进行分离时，最简便的方法就是用缓冲液来调节流动相的pH值,亦即对离子化过程进行抑制，所以此方法被称为“离子抑制”(lon Suppress)，且离子抑制最有效范围是在pH3—8。

由于ODS柱的化学不稳定性，在pH1.5—8范围之外，固定相会发生降解，所以对pKa小于2或大于7的化合物就不适宜用缓冲液来抑制离子化。

但近年来HPLC迅速发展，使用化学性质更为惰性的大孔聚合物（苯乙烯—二乙烯苯）固定相，使得流动相使用的PH范围达到1—13,因而离子选择性的优点也可用于强酸和强碱的分离。

关于离子抑制的机理还未确切了解，目前认为有两个主要原因，第一，认为流动相中的缓冲液与被分析样品相互反应，使得样品的离子平衡向“中性”形式移动，这就易于在反相柱上进行色谱分配。

当PH值低于某弱酸的PKa时，则其保留时间就长（抑制了离子化），反之，当pH值高于PKa时，洗脱就快；碱性样品正好相反。

PH值高于PKa，保留时间则长，PH值低于pKa，洗脱就快。

之所以样品的离子形式比中性形式洗脱较快是因为离子形式更易溶于水溶性流动相。

上述机理是离子化的控制。

第二种解释是缓冲调节剂使得表面残留硅醇基与样品的相互作用减到最小，这是因为缓冲调节剂能“复盖”这些硅醇基团，阻止其吸附样品分子和参与离子样品的保留。