MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选

遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。

二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。

植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。

2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。

突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。

拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。

由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。

3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。

除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。

4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。

T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。

野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。

所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。

因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。

在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。

T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。

在本实验中使用三引物法。

三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。

野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。

此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。

图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。

能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。

本实验使用CATB抽提DNA。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。

它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。

《珠美海棠Mz2NHX1基因转化拟南芥后代的鉴定与分析》一、引言随着分子生物学技术的快速发展，基因工程已经成为研究植物生长和发育机制的重要手段。

其中，植物基因转化技术能够为科学家们提供大量具有特定遗传性状的转基因植物，从而有助于揭示基因功能及其在植物生理过程中的作用。

珠美海棠作为一种重要的观赏植物，其花朵繁复艳丽，具有重要的园艺观赏价值。

而其Mz2NHX1基因在调控盐胁迫下的植物响应中可能发挥重要作用。

本研究将珠美海棠Mz2NHX1基因转化到拟南芥中，并对其后代进行鉴定和分析，以期进一步探究该基因在植物生理过程的作用。

二、材料与方法1. 材料本实验所用的材料包括：珠美海棠、拟南芥、Mz2NHX1基因载体、实验所需的分子生物学试剂和工具等。

2. 方法（1）基因转化：通过农杆菌介导法将珠美海棠Mz2NHX1基因转化到拟南芥中。

（2）筛选阳性植株：通过PCR技术对转化后的拟南芥进行筛选，获得阳性植株。

（3）鉴定与分析：对阳性植株进行表型观察、生理指标测定、基因表达分析等，以探究Mz2NHX1基因在拟南芥中的功能。

三、实验结果1. 阳性植株筛选结果通过PCR技术对转化后的拟南芥进行筛选，成功获得Mz2NHX1基因阳性的拟南芥植株。

2. 表型观察与生理指标测定对阳性植株进行表型观察和生理指标测定，发现Mz2NHX1基因的转入显著提高了拟南芥的耐盐性。

在盐胁迫条件下，转基因拟南芥的生长状况明显优于非转基因拟南芥。

3. 基因表达分析通过对阳性植株进行基因表达分析，发现Mz2NHX1基因在转基因拟南芥中的表达水平明显高于非转基因拟南芥。

这表明Mz2NHX1基因的转入确实能够影响其表达水平。

四、讨论本研究成功将珠美海棠Mz2NHX1基因转化到拟南芥中，并通过表型观察、生理指标测定和基因表达分析等方法，探究了该基因在植物生理过程中的作用。

实验结果表明，Mz2NHX1基因的转入显著提高了拟南芥的耐盐性，这表明该基因在植物应对盐胁迫的过程中发挥了重要作用。

拟南芥突变体的鉴定摘要在真核细胞的细胞核中，基因组DNA缠绕在组蛋白上，形成核小体的结构。

核心组蛋白的末端会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。

这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用。

组蛋白的甲基化发生在赖氨酸和精氨酸位点，这些位点的甲基化参与异染色质形成，X染色体失活和基因转录的激活与沉默等许多重要的生物学功能。

早先认为组蛋白上的甲基化是不可逆的。

然而近年来在哺乳动物和酵母中相继发现了许多组蛋白去甲基化酶。

其中最大的一个基因家族是包含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶家族。

在植物中还没有报道有组蛋白去甲基化酶。

我们通过基因组注释以及序列比对从拟南芥中鉴定出21个编码包含有JMJC结构域蛋白的基因。

并从SALK突变体库中筛选鉴定了相应的T-DNA插入突变体。

利用分子标记，我们筛选出了37个纯合T-DNA插入株系。

给我们以后分析这些基因在植物生长发育中所起的作用打下了坚实的基础。

关键词组蛋白密码, 甲基化，去甲基化，T-DNA插入突变体1 背景介绍1.1 “组蛋白密码”理论与表观遗传学在真核细胞的细胞核中，基因组DNA与组蛋白和非组蛋白相互结合，构成遗传信息的物质载体——染色质。

染色质由其基本单位核小体重复连接而成，每个核小体包含一个组蛋白八聚体（H2A/H2B-H3/H4-H3/H4-H2A/H2B）和围绕其上的两圈超螺旋DNA（146KB），核小体之间通过不同长度的超螺旋DNA和H1组蛋白前后相接。

组蛋白八聚体的成员作为核小体的基本组成元件，在所有真核生物中高度保守。

尽管核心组蛋白均具有一个三螺旋的结构严整的组蛋白折叠区，其两个末端却没有形成固定结构。

然而，这些末端却会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。

这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用（1，2）。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：我们用CTAB法提取拟南芥的T-DNA插入突变体的DNA，然后用三引物法进行PCR和琼脂糖凝胶电泳来判断其为突变纯合体还是突变杂合体。

通过这次实验，我们掌握了如何来判断纯和突变和杂合突变。

关键字：拟南芥 T-DNA插入突变突变体的鉴定前言：拟南芥拟南芥是十字花科的植物，它是植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物，其具有以下这些特点：①植株形态个体小，高度只有30cm左右；②生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；③种子多，每株可产生数千粒种子；④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；⑤遗传转化简单，转化效率高；⑥基因组小，只有5对染色体，125MB；⑦在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。

突变体突变体在植物基因分离及遗传学研究的最重要材料，通过自然突变或者人工诱变同源重组、基因沉默以及插入突变等方法都可以用来构建突变体，人工诱变是指利用物理因素（X射线，Y射线，紫外线，激光等）或化学诱变(如亚硝酸，硫酸二乙酯）来处理生物，使生物发生基因突变，这种方法可提高突变率，创造人类需要的变异类型。

目前，人工诱变拟南芥常用的方法有EMS诱变、T-DNA 插入突变、激活标签等。

T-DNA插入突变Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。

人们根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。

T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。

如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

T—DNA插入突变最大的用处是构建突变体库，在此基础上构建侧翼序列库；目前在拟南芥中已经建立了接近饱和的T—DNA插入突变体库，该突变体库包含超过225 000个独立的T—DNA插入株系，在预测的29 454个基因中有21 700个基因发生了插入突变[6]。