临床免疫学检验技术 ppt课件

性抗原。
抗体结构特点及功能
抗体结构特点
抗体分子是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链 结构。
抗体分子的基本结构可分为可变区和恒定区两部分。
抗体结构特点及功能
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结合特异性抗原
抗体分子的可变区具有特 异性，能与相应抗原表位 发生特异性结合。
激活补体
抗体分子与相应抗原结合 后，可激活补体系统，引 起一系列生物学效应。
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细胞因子的产生与作用
活化的T细胞可分泌多种细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死
因子（TNF）等，参与免疫应答的调节。
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细胞毒作用
通过表达FasL等分子，诱导靶细胞凋亡，发挥细胞毒作用。
B细胞介导体液免疫应答
B细胞的活化与增殖
抗原与B细胞受体（BCR）结合，启动B细胞的活化与增殖过程。
抗体的产生与作用
活化的B细胞可分化为浆细胞，分泌特异性抗体，与相应抗原结合 ，发挥中和、调理吞噬等作用。
免疫记忆的形成
部分B细胞可分化为记忆B细胞，长期存活于体内，当再次遇到相 同抗原时，可迅速增殖并分化为浆细胞，产生大量抗体。
适应性免疫应答调节机制
免疫耐受
通过克隆清除、克隆失能 等机制，避免对自身抗原 的免疫应答。
细胞因子与疾病的关系
细胞因子的异常表达与多种疾病的发生和发展密 切相关，如感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤 等。
补体系统参与固有免疫应答
补体的激活
补体系统可通过经典途径、旁路 途径和MBL途径被激活，产生具
有生物学活性的补体片段。
补体的作用
补体片段具有调理吞噬、溶解细 胞、介导炎症反应和参与组织修 复等作用，是固有免疫应答的重

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内容
第一节 分析前质量控制 第二节 分析中质量控制 第三节 分析前质量控制
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概述
质量保证 是临床实验室为证明提供给患者临床诊 疗或临床实验研究数据的有效性而采取的一系列措 施，涵盖了实验室内进行检测前后的所有活动。
临床免疫学检验既有手工操作、定性或半定量的试
验，也有以各种新技术、新方法为基础的自动化仪
一、检验项目的申请 检验申请是检验流程的重要环节，其信息规范性
与完整性对后续检验流程十分重要。申请有纸质 和电子形式或两者同时使用等方式。
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（一）申请单格式和填写
按照国家相关规定，检验申请单基本信息应至少包 括：受检者唯一性标识，如姓名、性别、年龄、科 别、病房、门诊号／住院号等；临床诊断或疑似诊 断；标本类型；检验项目；送检日期（年、月、日） 及标本采集时间与标本接受时间；申请者唯一标识 （医师签字）；收费／记账以及检验号等。检验申 请单的填写内容要规范、完整，以保证为后续检验 流程提供必需的信息。
三、标本的采集、传送与保存
（一）标本的采集
对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要 注意收集时间及体位对测定结果产生的影响。如可 的松在早晨4:00～6:00之间，会有一峰值出现；生 长激素、促黄体激素 (LH)和促卵泡激素(FSH)均以 阵发性方式释放；当从卧位变为站立位时，血清中 肾素活性将出现明显增高；治疗药物的监测，应根 据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。
5．靶值或预期结果已定。
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应选用制造商提供了溯源性的产品
为保证临床免疫检测结果的可比性，针对已建立国际标准 的检测项目，应要求所选用检测系统的制造商提供溯源性 文件，即证明通过该检测系统的检测结果，通过校准品可 逐级溯源到国际参考物质(international reference material)。通常国际参考物质为一级标准品，国家标准 品则为二级标准，可溯源至一级标准，二级标准可用来维 持校准。三级标准品则通过与二级标准的比对而来，为通 常使用的商品校准品。

易接近性是指抗原表面这些特殊的化学基 团与淋巴细胞表面相应受体相互接触的难 易程度。
易接近性常与这些化学基团在抗原分子中 分布的部位有关。
三、机体因素
遗传、年龄、生理状态、个体差异等因素
抗原进入机体的方式和途径也有关。
四、抗原进入机体的方式
抗原进入机体的数量、途径、两次免疫间的 时间间隔、次数以及免疫佐剂类型等都影 响机体对抗原的应答。
决定簇； ②多存在于抗原分子的内部。 ③一般不能引起免疫应答，称为隐蔽性表
位。 3.抗原结合价 能和相应抗体结合的功能性表位的数目。 半抗原为单价，天然抗原为多价。
二、T细胞表位与B细胞表位
实验： BSA 免疫动物 抗BSA抗体 针对BSA的效 应淋巴细胞
天然BSA 结合抗BSA的抗体 刺激T细胞增殖
三、异嗜性抗原（Forssman 抗原）
概念：是一类与种属特异性无关，存在于不同 种系生物间的共同抗原。
如：溶血性链球菌的多糖抗原或蛋白质抗原与 人的心肌、心瓣膜或肾小球基底膜之间；
大肠杆菌O14型的脂多糖与人的结肠粘膜之间； 肺炎支原体与链球菌MG株之间等。
四、同种异型抗原
红细胞抗原（ABO血型系统、RH血型系统）、 白细胞抗原、免疫球蛋白的抗原性
（3）无MHC限制性
（4）诱导的T细胞应答是通过分泌大量 细胞因子而参与某些病理生理过程的发 生与发展。
4.生物学意义 （1）毒性作用与诱导炎症反应 （2）自身免疫病 （3）免疫抑制
八、丝裂原（有丝分裂原）
第二节 免疫学发展简史
根据所用的技术和方法，免疫学的发展历史可分 为三个时期：
一、免疫学的经验时期
1.用人痘苗接种预防天花。
2.接种牛痘苗预防天花。
Jenner

人体
（ 特异性治疗和紧急预ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ用）
动物免疫血清对人体具有两重性。 ①提供了特异性抗体，中和细菌的外毒素，防治疾病。 ②是异种蛋白质，可引起超敏反应。
三、异嗜性抗原（Forssman 抗原）
概念：是一类与种属特异性无关，存在于不同种系生物间 的共同抗原。
如：溶血性链球菌的多糖抗原或蛋白质抗原与人的心肌、 心瓣膜或肾小球基底膜之间；
易接近性是指抗原表面这些特殊的化学基团与淋巴 细胞表面相应受体相互接触的难易程度。
易接近性常与这些化学基团在抗原分子中分布的部 位有关。
三、机体因素 遗传、年龄、生理状态、个体差异等因素 抗原进入机体的方式和途径也有关。 四、抗原进入机体的方式
抗原进入机体的数量、途径、两次免疫间的时间间隔、 次数以及免疫佐剂类型等都影响机体对抗原的应答。
可分为肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原。
七、超抗原（superantigen，SAg）
1.概念
一类可直接结合抗原受体，只需极低浓度即可激活2%～ 20%T细胞或B细胞克隆，并诱导强烈免疫应答的物质。 即超抗原。
2.种类 （1）根据激活的细胞分 ①T细胞超抗原 ②B细胞超抗原 （2）根据化学成分分 ①细菌性超抗原 革兰阳性菌产生的外毒素 ②病毒性超抗原 分内源性和外源性
八、丝裂原（有丝分裂原）
可致细胞发生有丝分裂，进而增殖得名。
3.作用特点 （1）无需抗原加工与提呈，可直接与MHCⅡ类分
子结合。
（2）形成TCRVβ-超抗原- MHCⅡ类分子复合物。 （3）无MHC限制性 （4）诱导的T细胞应答是通过分泌大量细胞因子
而参与某些病理生理过程的发生与发展。
4.生物学意义 （1）毒性作用与诱导炎症反应 （2）自身免疫病 （3）免疫抑制

3、花菁染料 (Cyanine Dyes ，Cy2，Cy3，Cy5） 荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定
性较强，荧光量子产率较高，对pH 等环境不敏感。常 用于多重染色。
Cy2比FITC 更稳定，荧光强度更大，光稳定性和抗 淬灭性更好。
Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更 弱。
指荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱 甚至消退的现象。 原因： (1)紫外光照射长； (2)苯胺、酚、ＫＩ、铁、汞、镍等。 有利：猝灭剂消除不需要的荧光,如硝基苯
处理有荧光的镜油。 保存：避光、避免与其它化学物质接触
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 ? 铕(Eu 3+)（应用最广）、 铽(Tb 3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 ? 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) ? 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
（对羟基苯乙酸）的底物。 ? 应用：酶免疫荧光分析
②阻挡滤片（barrier filter ）：吸收滤片或抑制滤片 位置：物镜和目镜之间 作用：使荧光通过(410～650nm) 阻断荧光以外的其它光。保护眼睛。
OG( 橙黄色)：
GG( 淡绿色)：
③隔热滤片 位置：灯室聚光器前 作用：阻拦红外线
3）镜头: 需消色差、无荧光
4）光路: 透射式：适于观察对光可通透的标本 落射式：适于观察透明度不好及各种活性组织
第八章 荧光免疫技术
Fluoroimmunoassay, FIA
荧光免疫技术

（1）鉴定病原菌：诊断疾病 （2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌 （3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定 （4）检测药物半抗原： 确认运动员是否服用兴奋剂
（二） 抗原或抗体的检测方法
凝集反应 沉淀反应 补体参与的抗原抗体反应 免疫标记技术
颗粒性抗原（红细胞、细菌、 乳胶颗粒等 ）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。
副作用：明显 ，主要是骨髓抑制、肝肾毒性等
其抑制作用是非特异性的，长期应用可导致：继 发性免疫缺陷 、 严重感染、 肿瘤
抗体为基础的免疫治疗
一、免疫血清
抗毒素血清、胎盘（丙种）球蛋白、抗菌免疫血清、抗病毒免疫血清、抗 淋巴细胞丙种球蛋白等
二、单克隆抗体（mAb）：用于靶向治疗等。 三、基因工程抗体：降低抗体的免疫原性
化学制剂 1、烷化剂：环磷酰胺 2、抗代谢药：激素：糖皮质激素 真菌代谢产物 1、 环孢素A：对T，尤其是TH有较好的选择性抑制作用 2、FK-506：其作用强于环孢素A10-100倍，且与环孢素A
有明显的协同作用。 中药及其有效成分 雷公藤多甙
适应症：免疫功能过高引起机体损害的患者
1、抗移植排斥 2、超敏反应性疾病：激素 3、自身免疫病：激素、雷公藤多甙 4、感染性炎症：激素
3、细胞因子检测
可用于鉴定分离的淋巴细胞亚群，监测某些疾病状态的细胞免疫功 能。IL-2、IL-2R、rIFN 、TNF等检测。 ①免疫学方法：ELISA、RIA等。 ②细胞生物学方法
③分子生物学方法，如聚合酶链反应（PCR）法等
4、体内免疫细胞功能测定：皮肤试验
（1）迟发型超敏反应：旧结核菌素试验（ OT试验 ） 皮试（+）——有一定的细胞免疫能力 皮试（—）——细胞免疫功能缺损

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二.血清M蛋白(monoclonal immunoglobulins)测 定
测定方法：蛋白电泳法、免疫比浊法和免疫 电泳法
参考值：阴性
意义：检测到 M蛋白，提示单克隆免疫球蛋 白增殖性疾病。见于多发性骨髓瘤、巨球 蛋白血症、重链病、轻链病和半分子病等
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三.血清补体检测
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一.体液免疫功能 检测
• 检测血清免疫球蛋白及其类别（尤 其是IgG、IgA和IgM ）和水平，可为诊 断免疫缺陷性疾病和免疫增殖性疾病 提供重要参数。
• 检测针对疫苗或感染因子的特异性抗 体及其水平，可较直接反映机体特异 性体液免疫功能状态。
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1．免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig)
3.补体 C 1q
方法：单向免疫扩散法 (0.197-0.04 g/L )
意义：1、增加见于骨髓炎、类风湿性关节炎、痛 风、过敏性紫癜等；2、降低见于SLE和混合性结 缔组织病等。
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4.BF
方法：单向免疫扩散法 (0.1-0.4g/L)
意义：增高见于某些自身免疫病、肾病综合征、慢 性肾炎、恶性肿瘤； 2、减低见于肝病、急性肾 小球肾炎、自身免疫性溶血性贫血。
• 基本概念
补体(complement)：是一组具有酶原活性的糖蛋白，由传 统途径的 9种成分C 1 - C 9 、旁路途径的3种成分及其 衍生物组成，参与灭活病原体的免疫反应，也参与破坏自 身组织和自身细胞而造成的免疫损伤。
1.补体 CH 50
方法：试管法
参考值：50000-100000u/l
意义：反映补体传统途径活化的活性程度。 1、CH 50

细胞因子的产生与作用
活化的T细胞可分泌多种细胞因子， 如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因 子（TNF）等，参与免疫应答的调节 。
B细胞介导体液免疫应答
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B细胞的活化与增殖
B细胞通过其表面的B细胞受体（BCR）识别并结合抗原，进而被活化并
开始增殖。
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抗体的产生与作用
活化的B细胞可分化为浆细胞，浆细胞合成并分泌抗体，抗体可结合并
自身免疫病治疗策略
免疫抑制治疗
通过使用免疫抑制剂，如糖皮质激素、环磷酰胺 等药物，抑制免疫系统的异常应答，从而减轻炎 症和组织损伤。
生物治疗
生物治疗是一种新兴的治疗方法，通过利用生物 技术生产的单克隆抗体、细胞因子等生物制剂， 精准地干预免疫系统的异常应答，为自身免疫病 的治疗提供了新的手段。
免疫调节治疗
免疫记忆
通过记忆T细胞、记忆B细胞的长期 存活及快速应答能力，实现对相同 病原体的长期免疫保护。
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免疫耐受与自身免疫病
免疫耐受形成原因及机制
原因
免疫耐受是指免疫系统对抗原的特异性无应答或低应答状态 ，其形成原因包括抗原性质、抗原剂量、免疫细胞发育阶段 等。
机制
免疫耐受的形成涉及多个机制，包括克隆清除、克隆无能、 免疫忽视等。这些机制共同作用，确保免疫系统在正常情况 下不对自身抗原产生免疫应答。
清除病原体及其产物。
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免疫记忆的形成
部分活化的B细胞可分化为记忆B细胞，长期存活于体内，当再次遇到
相同抗原时，可迅速增殖并分化为浆细胞，产生高效、持久的免疫应答
。
适应性免疫应答调节机制
免疫耐受
通过克隆清除、克隆失能、克隆 忽视等机制，避免对自身抗原的

加入抗血清
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
•基本原理：电泳技术+沉淀反应 •优点：加快沉淀反应的速度；
提高灵敏度。 •应用： 主要用于细微成分的分析。
•电泳原理：带电质点在电场中向带有异相电荷的 电极移动。
•在常规血清蛋白电泳，一般选择可使所有蛋白质 分子均带负电荷的碱性缓冲液。
•电场中的作用力（碱性条件下） 电泳力：蛋白质由阴极向阳极移动。 电渗力：水分子向阴极移动。 若电泳力>电渗力, 向阳极移动(大多数Ag) 电渗力>电泳力, 向阴极移动（Ａb）。
• 对待检蛋白质样品定量测定的条件： 1、具有单价特异性抗血清 2、已知含量标准品（绘制标准曲线用） 3、待检含量>1.25ug/ml。（敏感度稍低）
• 单扩试验的应用范围： 常用于IgＧ、IgＡ、IgM、C3、C4等测定， 简易的抗原定量技术。
• 双环现象
抗原性相同、扩 散率不同的两个 组分：α重链病 人血清中的α重 链与正常IgA
抗体相遇，在界面处形 •临床意义：
成清晰的乳白色沉淀环。 鉴定血迹、

特异性免疫。
2. 组成 （1）屏障结构 皮肤和粘膜屏障，血脑屏障，胎盘屏障 （2）吞噬细胞 吞噬、分解生物大分子，杀灭病原体。 （3）正常组织和体液中的杀菌物质 抗体、补体、溶菌酶等
（二）适应性免疫（获得性免疫）
1. 特征 （1）个体出生后，由于接触抗原而获得。 （2）针对性强（特异性强），也称特异
第一章 免疫学概论
免疫学是一门古老又年轻的学科。
免疫学（Immunology）:
是研究机体免疫系统识别和清除有害生物 及其成分的应答过程及机制的科学；
是研究免疫系统对自身抗原耐受，防止自 身免疫病发生的科学；
是研究免疫功能异常与相应疾病发病机制 及其防治措施的科学。
第一节 免疫的基本概念
1. 人工主动免疫和被动免疫的研究
减毒疫苗（鸡霍乱杆菌、炭疽杆菌、狂
犬病毒）
Pasteur
抗毒素血清（白喉杆菌外毒素、破伤风 杆菌外毒素）
2. 免疫应答机制的研究
细胞学说：吞噬细胞发挥吞噬作用
体液学说：体液中产生了针对各种病原 微生物的相应抗体，并发现在试管中这 些抗体能与相应的病原微生物发生凝集、 沉淀等现象。
抗原籍表位结合
相应淋巴细胞 表面受体
相应抗体
表位是免疫细胞识别的标志及免疫反应 具有特异性的物质基础。
2.种类 分两类 (1)构象表位（决定簇）
①序列上不相连的多肽或多糖，由空间 构象形成的；
②一般位于抗原分子的表面。
③易被相应的淋巴细胞识别，启动免疫 应答，称为功能性表位。
子物质。如药物、多糖、类脂等。
载体 赋予半抗原具有免疫原性的蛋白质分子，
即为载体。 半抗原 结合 某些蛋白质 抗原（完全抗原）