新生大鼠背根神经节神经元的分离、培养及鉴定

河北医科大学硕士学位论文胚胎大鼠背根神经节体外培养的实验研究姓名：王丽琴申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：王维平;李春岩2003.3.1中文摘要胚胎大鼠背根神经节体外培养的实验研究摘要目的：目前神经组织培养技术是神经科学一项很有价值研究手段和方法。

背根神经节（ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔｇａｎｇｌｉｏｎｓＤＲＧｓ）是周围神经系统（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｎｅｒｖｅｓｙｓｔｅｍ，ＰＮＳ）的感觉神经元，ＤＲＧｓ的体外培养模型已广泛用于轴突的导向及再生、突触发育和可塑性、中枢神经系统和周围神经系统的髓鞘形成，神经营养因子作用及受体分布、神经细胞衰老机制、基因治疗、组织工程等神经科学的研究，成为遗传性、获得性神经病的一个新的研究途径。

格林一巴利综合征（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－ＢａｒｒｅｓｙｎｄｒｏｍｅＧＢＳ）是包括许多临床亚型的周围神经系统疾病。

目前认为是体液免疫和细胞免疫共同介导的神经系统自身免疫性疾病，但病因及发病机制并不十分明确。

本实验建立ＤＲＧｓ体外培养模型为进一步研究格林．巴利综合征提供一个崭新的研究工具。

本课题建立了体外胚胎大鼠背根神经节的分离培养及纯化体系，在光镜水平从细胞形态学角度观察了培养神经元细胞的生物学特性。

方法：（１）采取神经组织单层原代分离培养的方法建立ＤＲＧｓ的混合培养体系：无菌取孕１５天（Ｅ１５）Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠胚胎的ＤＲＧｓ，用胰蛋白酶消化２０分钟，再用机械吹打法将ＤＲＧｓ制成单细胞悬液，以１０６细胞密度种植在预先包被细胞基质成分多聚赖氨酸（ｐｏｌｙ．Ｌ．１ｙｓｉｎ，ＰＬＬ）和层粘蛋白（Ｌａｍｉｎｉｎ，ＬＮ）的培养板中，加入含胶质细胞源性神经营养因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌＩｉＩｌｅＩ中文摘要ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ＧＤＮＦ）的ＮＢｌ培养基，于Ｃ０２培养箱中培养。

（２）＿币ｔＪ用差速贴壁法建立ＤＲＧｓ的分离纯化体系：将胰蛋白酶消化后的单细胞悬液首先种植在未包被基质的３５ｍｍ的培养皿中，于Ｃ０２培养箱中孵育５０分钟，收集未贴壁的细胞悬液以１０６细胞密度种植在预先包被ＰＬＬ和ＬＮ的培养板中，在ＮＢｌ培养基中培养。

高纯度大鼠胚胎背根神经节神经元的培养与鉴定韩创业;赵春节;刘锦愉;杨劲松【摘要】目的:建立一种取材容易、存活时间长、纯度高的原代大鼠胚胎背根神经节神经元(DRGn)的培养模型.方法:在解剖显微镜下取得胎鼠背根神经节(DRG),通过胰蛋白酶消化,使用Neurobasal (NB)培养基联合抗有丝分裂药物纯化等方法获得DRGn.采用神经丝蛋白免疫细胞化学染色法和hoechst染核鉴定并测定DRGn的纯度.结果:原代培养的DRGn在含有神经生长因子(NGF)的NB培养基中生长良好,存活时间可达45 d,纯度可达到95％以上.结论:该培养模型简单易行,培养稳定,可获得大量高纯度和存活时间长的DRGn.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2014(031)003【总页数】4页(P358-361)【关键词】背根神经节神经元;原代培养;大鼠胚胎【作者】韩创业;赵春节;刘锦愉;杨劲松【作者单位】广西医科大学第一附属医院脊柱骨病科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院脊柱骨病科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院脊柱骨病科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院脊柱骨病科南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R-33体外培养可使相互独立的神经元和神经胶质细胞在与体内环境相似的条件下生长。

随着相对纯化的细胞再次共培养，可进一步研究神经元的生长、神经元——神经胶质细胞的相互作用，特别是髓鞘形成等。

在体内，背根神经节神经元（DRGn）的轴突主要从中枢神经系统（CNS）和外周神经系统（PNS）伸展出来，在中枢（少突胶质细胞）和外周（雪旺细胞）神经胶质细胞的诱导下逐渐形成髓鞘。

与此同时，体外培养的DRGn在加入神经生长因子（NGF）后将会有较长的生命周期。

因此，共同培养纯化的DRGn和成髓鞘细胞（如雪旺氏细胞或少突胶质细胞）是一种较为理想的用于研究髓鞘形成的方法，但神经细胞分化成熟后不再具备分裂能力，其体外培养对培养体系要求较高，培养具有较大的困难。

新生大鼠背根神经节神经元的分离、培养及鉴定摘要】目的：建立一种简单、稳定、高效的新生大鼠背根神经节神经元原代培养方法。

方法：摘取新生24h SD大鼠背根神经节，采用0.25%胰酶和0.1%Ⅳ型胶原酶消化，制成单细胞悬液，接种于Neurobasal/B27无血清培养液中。

将培养3d 的DRGn于倒置相差显微镜下进行形态学观察，扫描电镜行细胞形态学检测，应用β-tubulinⅢ进行免疫细胞化学染色，鉴定细胞纯度。

结果：体外培养的背根神经节神经元生长状态良好，纯度可达到(92±6)%。

结论：本实验方法简单、稳定、高效，可以获得高纯度的背根神经节神经元。

【关键词】背根神经节；动物实验；细胞培养；纯化【中图分类号】R74 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）21-0034-03The dissection, purification and culture of dorsal root ganglion neurons from new born ratsZhang Yuyao1, Liang Chen1, HU Xueyu(corresponding author)21 Fourth Military Medical Un iversity, Xi’an, Shanxi, 710032, China2 Department of orthopaedics, Xijing hospital,Fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China【Abstract】Objective To establish an simple, efficient, reliable method for the purification culture system of dorsal root ganglion neurons derived from new born rats. Methods Dorsal root ganglions harvested from new born SD rats were digested with the mixture of trypsin and collegonease Ⅳ, then turned into single cell suspension and plated in neuralbasal media. The purified rate was evaluated according to cell count and β-tubulinⅢ immunocytochemistry stain. Results Cultured dorsal root ganglion cells could survive healthily. The purification rate of neurons was（92±6）%. Conclusion The method, which is used for culture and purification of DRGn, is a simple, efficient and reliable way. Using it could obtain highly purify neurons.【Key words】Dorsal root ganglion; Animal experimentation;CellCulture;Purification背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）主要由感觉神经元组成，参与脊髓反射与感觉功能的调节，DRG因其细胞种类、生物学特性单一，越来越受到人们的重视。

大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察
大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察
目的:探讨大鼠脊髓背根神经节(DRG)内是否存在神经前体细胞.方法:取成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片,进行Brdu,Nestin,P75免疫荧光组织化学检测,分别取成年和胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行Nestin免疫组织化学和Brdu,P75,NF,GFAP免疫荧光组织化学鉴定.结果:在成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片上均见有Brdu/Nestin和Nestin/P75免疫荧光双标细胞.细胞培养观察到取自DRG的细胞有分裂增殖,呈Nestin免疫组织化学阳性反应和Brdu,P75免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清后出现分化,分化细胞呈NF和GFAP免疫荧光组织化学阳性反应.结论:大鼠DRG内存在有分裂增殖的神经前体细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.
作者：宋嵬曾水林朱建宝王磊李升阎荣李凤飞SONG Wei ZENG Shui-Lin ZHU Jian-Bao WANG Lei LI Sheng YAN Rong LI Feng-Fei 作者单位：东南大学神经生物学研究所,江苏,南京,210009 刊名：第四军医大学学报ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF THE FOURTH MILITARY MEDICAL UNIVERSITY 年，卷(期)：2006 27(18) 分类号：Q24 关键词：大鼠神经前体细胞神经节,脊细胞培养技术免疫荧光组织化学。

《大鼠神经干细胞大鼠神经干细胞的分离培养和鉴定》
摘要：建立神经干细胞分离、培养、鉴定技术，采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定神经干细胞，用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力，通过鉴定确为神经干细胞
摘要：目的建立神经干细胞分离、培养、鉴定技术。

观察神经干细胞生长、增殖特点。

方法
利用无血清培养，从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离神经干细胞，进行体外扩增培养、传代观察。

采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定神经干细胞。

结果从胚胎大鼠海马、纹状体
等区分离的细胞具有增殖能力，可进行传代培养，获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞，显微镜下观察到典型的干细胞特征。

结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和
增殖能力，通过鉴定确为神经干细胞。

关键词：神经干细胞；细胞培养；胚胎大鼠；荧
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.。

大鼠脊髓神经元的分离、培养与鉴定王斌;郭伟韬;黄云【摘要】Objective To establish a highly effective and stable method for isolating and cultivating spinal cord neurons, and to provide seed cells for studying the pathophysiolog, abnormal functions and treatment of spinal cord inju-ry. Methods Spinal cord tissues of neonatal rats were dissected and cell suspensions were made by papain dissociation. The cell suspensions were cultured in 12 well cell culture cluster with serum-free culture medium after differential adher-ence, then the morphological development of neurons was observed by invert microscope. The neurons can be identified by immunocytochemistry with pr HI Tubulin. Results The spinal cord neurons had great growth state, appropriate densi-ty and high purity, which reached up to about 83%. Conclusion The spinal cord neurons of neonatal rats cultured by pa-pain dissociation, differential adherence and serum-free culture qualify the needs for in vitro experiments.%目的通过对新生大鼠脊髓神经元分离、培养过程中细节的探讨,建立一种高效、稳定的大鼠脊髓神经元培养方法,为研究脊髓损伤相关的病理生理及其治疗提供种子细胞.方法取新生SD大鼠的脊髓组织,通过木瓜酶消化制成单细胞悬液,经差速贴壁后种于12孔细胞培养板内,用无血清培养基培养,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫细胞化学对神经元β-ⅢTubulin行特异性荧光素染色,结合DAPI核染色鉴定神经细胞及其含量.结果该方法培养的脊髓神经元生长状态良好、密度适中,纯度较高,约83％.结论采用木瓜酶消化、差速贴壁及无血清培养的新生大鼠脊髓神经元符合体外实验的要求,为进一步进行相关实验提供目的细胞.【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2012(023)006【总页数】2页(P21-22)【关键词】脊髓;神经元;细胞培养;分离;无血清培养基【作者】王斌;郭伟韬;黄云【作者单位】广东医学院附属医院骨外科,广东湛江524001;广东医学院附属医院骨外科,广东湛江524001;广东医学院附属医院骨外科,广东湛江524001【正文语种】中文【中图分类】R-332脊髓损伤的病理基础是脊髓神经元的死亡及其突触结构和功能的丧失。

大鼠背根神经节神经元的分离方法及电生理特征探讨王腾;黄从新;王高华【期刊名称】《科技导报》【年(卷),期】2009(0)16【摘要】在获取大鼠背根神经节神经元后,全细胞膜片钳技术记录动作电位和钠电流,探讨大鼠背根神经节细胞的分离方法和细胞形态以及电生理特征。

结果显示,本实验能得到完整圆形或椭圆长条形的大鼠背根神经节体。

正常的单个背根神经节神经元呈圆形或椭圆形,大小不等,胞膜清晰,折光性好,隐约可见细胞核。

在背根神经节细胞上记录的动作电位呈正立锐角三角形,静息电位小,动作电位时程短。

背根神经节神经元的钠通道最大电流密度为(-62.04±4.45)pA/pF,几乎能被河豚毒素(TTX)完全抑制。

本实验分离方法简单易行,背根神经节神经元容易获得和辨认,电生理特征明确,适用于神经系统疾病的电生理特征研究和治疗药物观察。

【总页数】4页(P32-35)【关键词】膜片钳技术;背根神经节神经元;大鼠;电生理特征【作者】王腾;黄从新;王高华【作者单位】武汉大学人民医院心内科;武汉大学心血管病研究所;武汉大学人民医院精神卫生中心【正文语种】中文【中图分类】R329.27【相关文献】1.大鼠背根神经节同一分离神经元膜受体电生理学及细胞神经递质免疫组织化学检测方法 [J], 司军强2.膜片钳技术在慢性痛大鼠背根神经节神经元电生理学特性改变中的应用 [J], 蔡捷;方东;李松;邢国刚3.神经病理性痛大鼠背根神经节细胞电生理学特征的改变 [J], 邓伦斌;姚磊;王贺春;曹晓杰;万有;韩济生4.内脏高敏感大鼠结肠特异背根神经节神经元TRPV1表达和电生理特征变化 [J], 袁莉莉;余跃;蒋楠;陈凤琴;王巧民;王烈成5.神经病理性痛大鼠背根神经节神经元电生理学的改变 [J], 冉然;王清秀;王群;彭成为;李国华;刘忠武;姚尚龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察大鼠脊髓背根神经节（DRG）是感觉神经元的主要来源，内部存在着神经前体细胞。

这些细胞不仅具有分化为神经元的能力，还有一定的自我更新和再生能力。

因此，细胞生物学家们对大鼠DRG内神经前体细胞的观察十分关注，并期待能够通过对其进行深入研究，不仅了解神经类肿瘤和神经退行性疾病的发生机制，而且希望能够利用这些细胞为神经系统疾病的治疗提供新思路。

首先，大鼠DRG内神经前体细胞的来源和成分十分复杂。

这些神经前体细胞既有神经干细胞，也有神经前体细胞，细胞形态各异，可以分为大小、形状以及染色性质不同的细胞类型。

在活体的观测中，DRG内神经前体细胞常常呈现出“鱼鳞状排列”的现象，形成了独特的细胞结构。

这种观察所得数据，为研究神经退行性疾病的治疗提供了重要的参考信息。

其次，研究人员在细胞培养过程中，发现大鼠DRG内神经前体细胞的分化过程可以被不同的细胞因子和基因调控。

这些因素和基因以不同的方式影响着神经前体细胞的命运，例如维生素A酸、衍生物1类、神经生长因子等物质都能够诱导DRG内神经前体细胞向神经元的方向分化发展。

同时，研究人员还发现，神经系统发育过程中的一些信号途径，例如Wnt、Shh和Nodal等，也能够对神经前体细胞的分化起到调控作用。

无论在体内还是体外的情况下，这些调控因素对DRG内神经前体细胞的影响表现出了显著的效果。

因此，研究DRG内神经前体细胞分化的因素，可为神经系统疾病特别是神经类肿瘤的治疗提供新的策略。

最后，大鼠DRG内神经前体细胞在神经系统衰退性疾病的治疗中具有很大的潜力。

当前很多神经退行性疾病，所造成的背景环境的恶化对于这种病因有着重要的作用，在这样的病因环境下，DRG内神经前体细胞的再生能力很差，难以治疗。

但是，在特定的微环境下，这些细胞具有一定的自我修复能力，亦可通过移植方式调整周围的环境来保证其正常分化。

当前的一些实验表明，如果通过移植方式将DRG内神经前体细胞与一些适当的细胞因子和置换为正常化环境，这些细胞就能重新发挥出分化为神经元的能力，有效地治疗与神经系统细胞死亡有关的疾病。

胚胎大鼠背根神经节神经元的原代培养孙青;梁晓春;张宏【摘要】目的原代培养胚胎大鼠背根神经节神经元(DRGn),并观察其生长特性.方法取E15 SD胎鼠的背根神经节,用胰蛋白酶消化法分离成单细胞,通过密度梯度离心法和差速贴壁法进行分离纯化,在无血清培养基中培养,用抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体鉴定神经元.结果纯化培养神经元生长状态良好,纯度可达93％左右.结论该方法具有较好的可操作性和可重复性,用于DRGn的相关实验研究.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2016(045)001【总页数】4页(P66-68,73)【关键词】背根神经节神经元;原代培养;胚胎大鼠【作者】孙青;梁晓春;张宏【作者单位】100730 中国医学科学院/北京协和医学院北京协和医院中医科;100730 中国医学科学院/北京协和医学院北京协和医院中医科;100005 中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所细胞中心【正文语种】中文【中图分类】R3背根神经节神经元(dorsal root ganglion neuron，DRGn)是周围神经系统重要的初级感觉神经元，能量代谢旺盛，线粒体丰富，这种结构和功能特点使其对高糖和氧化应激等具有高度易感性，是周围神经病变重要的靶细胞之一[1]。

DRGn因其原代培养难度大、纯化复杂、培养基条件要求高，相关报道较少。

本研究介绍一种实验中摸索出的DRGn原代培养方法，旨在为周围神经病变的体外研究提供可靠的实验模型。

1.实验动物：孕15天(E15)的SPF级Sprague Dawley(SD)大鼠，购自北京大学医学部实验动物科学部，实验动物许可证号：SCXK(京)2006-0008。

2.主要试剂与仪器：Neurobasal培养基、DMEM高糖培养基、神经生长因子、B27添加剂(美国Invitrogen公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、Hepes、多聚赖氨酸(美国Sigma公司)；青霉素、链霉素(华北制药集团有限公司)；人淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品公司)；兔抗大鼠NSE多克隆抗体(丹麦Dako公司)；其余试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

新生大鼠脊髓运动神经元的纯化培养与鉴定杨林;刘阳;吕德成【摘要】背景：神经元是有丝分裂后的细胞，体外培养很难存活。

脊髓运动神经元的分离、纯化和培养同时也是细胞培养的技术难点。

目的：建立新生大鼠脊髓运动神经元培养体系，并予以分类鉴定和测定其纯度。

方法：取新生大鼠脊髓腹侧组织分离成细胞悬液，经密度梯度离心及差速贴壁后纯化培养，采用免疫细胞化学双标染色法对培养盖片上的细胞予以鉴定、分类，结合Hoechst荧光染核，计数各细胞成分的含量。

结果与结论：细胞贴壁生长良好，神经元占85.8%，其中运动神经元达71.6%，星形胶质细胞占7.8%，NF200和胶质纤维酸性蛋白染色皆为阴性的细胞占6.4%。

结果说明，取新生大鼠腹侧脊髓组织结合密度梯度离心及差速贴壁接种法可以培养出高纯度的脊髓运动神经元。

%BACKGROUND:neurons are post-mitotic cels that are difficult to survive. Isolation, purification and culture of spinal motor neurons are technical difficulties of cel culture technology. OBJECTIVE:To establish the culture system of spinal motor neurons from neonatal rats and to identify and determine the purity of spinal cord neurons. METHODS: Ventral spinal cord tissues from neonatal rats were made into cel suspension that was subjected to density gradient centrifugation and differential adherence folowed by purification culture. Then, the cels on cover plates were identified and classified using immunocytochemical double staining method, and the content of cel components was calculated in combination with fluorescent Hoechst nuclear staining. RESULTS AND CONCLUSION:The cels adhered wel, and the neurons accounted for 85.8%, among which, motor neurons reached71.6%, astrocytes accounted for 7.8%, cels negative for neurofilament 200 and glial fibrilary acidic protein were 6.4%. These findings indicate that the ventral spinal cord tissues from neonatal rats combined with density gradient centrifugation and differential adherence can develop high-purity spinal motor neurons.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(000)042【总页数】5页(P6782-6786)【关键词】组织构建;组织工程;运动神经元;免疫化学;纯化培养;新生大鼠;辽宁省自然科学基金【作者】杨林;刘阳;吕德成【作者单位】大连医科大学/大连医科大学附属第一医院，辽宁省大连市 116024;大连医科大学/大连医科大学附属第一医院，辽宁省大连市 116024;大连医科大学/大连医科大学附属第一医院，辽宁省大连市 116024【正文语种】中文【中图分类】R318文章亮点：体外原代神经细胞培养是一种研究神经元形态、功能的重要方法，近年来已越来越受到神经科学研究人员及临床工作人员的重视。

华中科技大学硕士学位论文SD大鼠背根神经节细胞新取材和培养方法姓名：艾玛AmmarAliAhmed申请学位级别：硕士专业：外科学（手外科）指导教师：康皓2011-05SD大鼠背根神经结细胞的新取材和培养方法华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所　硕士研究生：艾玛　 指导教师：　康皓 教授　中文摘要　【目的】：探讨有效摘取ＳＤ大鼠背根神经结（ＤＲＧ）的方法，为实验取材奠定基础。

　方法①取材　选择为三周ＳＤ大鼠，提取ＤＲＧ神经元。

用显微解剖获取足够数量的ＳＤ大鼠背根神经结，通过胰蛋白酶＋Ⅳ型胶原酶消化②分离：ＰＢＳ洗涤吸干液体，加入０．２％Ⅳ型胶原酶和０．２５％胰蛋白酶放入３７０Ｃ温箱边消化边用眼科剪剪碎背根神经结重复数次，直到消化液变得粘稠后就可以用滴管吹打，吹打后就可以完全的把背根组织彻底的消化掉，加入含有血清的ＮＢＬ培养基终止消化，用１０００转离心，③原代培养将细胞悬液加入底面铺有Ｌ一多聚赖氨酸的培养皿（ＰＰ　）中，放人３７℃、体积分数为０．０５的ＣＯ２培养箱中，让其自然贴壁。

定期在倒置相差显微镜下观察。

　【结果】背根神经结细胞原代贴壁生长较慢，一个月以后才能长满瓶底生长二天后２０倍光镜下背根神经结细胞。

细胞成簇生长，向四周放射状排列，细胞核圆形透亮，细胞形态多边型，向四周伸出较长的触须，其他类型细胞基本上已经死掉而悬浮在培养基里。

　【关键词】背根神经结；细胞培养　New method in extracting and culture of dorsal rootganglion neurons of SD ratDepartment of Hand surgery, Union Hospital, Tong Ji Medical School, HuazhongUniversity of Science and TechnologyPostgraduate: Ammar Ali Ahmed TaherSupervisor: Pro. KangHaoAbstract【Objectives】To explore the effective method applied in extracting of dorsal root ganglion (DRG) of SD rats, thus lay a foundation for obtainment of the experimental materials.【Methods】①Obtainment of materials: Select 3-week SD rats to extract DRG neuron. Sufficient dorsal root ganglions of SD rat may be obtained via microdissection and digested using trypsin + collagenase IV. ② Isolation:The liquid is washed and sucked up with PBS, add 0.2% collagenase IV and 0.25% trypsin, after that it is placed in 37℃incubator for digestion, during which the dorsal root ganglion should be sheared with ophthalmic scissor for several time until the digestive juice becomes thick, and then a pipette is used to blow, the dorsal root tissue may be digested totally after blowing, add NBL medium containing serum to terminate the digestion process, and centrifuged at 1000r. ③Culture of primary generation of cells: Add cellular suspension in Petri dish (PP) with L-poly-lysine laid down at its bottom, and placed in incubator (37℃, 0.05 volume fraction of CO2) to allow natural adherent growth. The inverted phase contrast microscope is used regularly to perform the observation.【Results】The adherent growth of the primary generation of dorsal root ganglion cells isso slow that a month is needed to cover the bottom of the flask. The dorsal root ganglion cells under 20 x optical microscope grow for two days. The cluster of cells grows in radial arrangement to the surrounding; the nucleus appears round and transparent and cellular morphology in shape of polygon while the longer tentacles expand around the cell; other types of cell have been basically dead and suspend in the medium.【Keywords】Dorsal root ganglion; Cell culture独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。

大鼠感觉神经元-背根神经节神经元原代培养纯化-神经生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——周围神经损伤与变性疾病在临是较为常见的疾病，常常会累及感觉神经元-背根神经节（dorsalroot ganglion, DRG）神经元，为探究其损伤与修复机制，体外培养DRG 神经元是重要的实验技术。

目前，在DRG 神经元的原代培养过程上，常使用阿糖胞苷（cytarabine,Ara-C）抑制神经胶质细胞的生长以纯化DRG 神经元[1-4],这种方法仍然存在一些问题：由于需要多轮纯化，获得纯度较高的DRG 神经元需要的周期较长，同时Ara-C 对神经元的细胞活力也有一定的影响；此外，Ara-C 试剂生产厂家不同、批号不一，会造成纯化次数不定、纯度不能保证、不同批次培养的细胞差异性较大等问题。

因此，本研究对大鼠DRG 神经元原代培养中的纯化方法进行了改良，以克服传统方法的不足。

1材料与方法1.1动物出生1 d（P1）的SD 大鼠，由南通大学实验动物中心提供。

动物实验已通过伦理委员会审查同意。

1.2试剂DMEM 培养基、Neurobasal 培养基、胎牛血清（febtal bovine serum, FBS）、羊血清、0.25%胰酶和0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（phosphate bufferedsaline,PBS 购自Gibco 公司；B27 和多聚赖氨酸（poly-L-ly sine, PLL）购自Invitrogen 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、L -谷氨酰胺、Ara-C 和Ⅰ型胶原蛋白酶购自Sigma 公司；CCK8 购自Dojindo 公司；其他试剂为均分析纯。

1.3细胞培养方法1.3.1 大鼠DRG 的取材准备 5 只P1 大鼠逐个取材，用75%乙醇全身消毒大鼠后，无菌超净台内，剪开背部皮肤，打开脊髓腔，用显微镊小心取出双侧的DRG,置于冰上的DMEM 培养基中。

大鼠脊髓神经元细胞的分离及培养方法1、培养板的包被（1）将盖玻片裁成0.5cm×0.5cm 大小，洗洁精浸洗、烘干。

（2）经 5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗20min，三蒸水冲洗，浸泡过夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。

用前酒精灯烤干，放入 24 孔细胞培养板。

（3）用0.01%的L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。

吸弃L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。

2、大鼠脊髓神经元细胞的分离及培养(1) 75%（体积分数）酒精消毒新生 24h 内的健康SD大鼠，在无菌条件下断头，分离并切取脊髓，置于盛冷的pH7.2,无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

(2) 无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。

(3) 用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 10min，期间振摇 2~3 次。

（4）巴斯德吸管轻轻吹打20次，静置5min，将细胞上清移入新的无菌离心管，加入完全接种液终止消化。

剩余组织按照上述步骤继续消化，重复2-3次，制成细胞悬液。

（5）将新的离心管中细胞悬液，离心（1000r/min，10 min，4℃），弃去上清液。

加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。

（6）将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。

以8.0 ×104至1.0 ×105/mL的密度将细胞以400µl/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24 孔培养板（7）置37℃、5%CO2培养箱培养 4～6h，全量更换为无血清培养液。

（8）体外培养第 3天，加入Ara-C 工作液，以抑制非神经细胞过度增殖，作用 24 h后吸出。

(9) 此后每 3d半量换液1次 , 体外培养第 7～21天的细胞用于实验。