青霉素G酰化酶工程菌培养条件的研究

第26卷　第5期2010年9月福建师范大学学报(自然科学版)Jo ur nal of F ujian N or mal U niver sity (Nat ur al Science Edition)V ol.26　N o.5Sept.2010文章编号:1000-5277(2010)05-0072-05渗透休克法提取重组青霉素G 酰化酶及酶学性质研究蒋咏梅1,2,章文贤1,魏东芝2(1.福建师范大学生命科学学院,福建福州　350108;2.鲁华生物技术研究所,华东理工大学,上海　200237) 摘要:为简化后期提取工艺,采用渗透休克法提取基因工程菌重组青霉素G 酰化酶,回收率92.4%的酶蛋白释放到胞外,纯度达80%,比酶活26.4U /mg .酶学性质研究表明,K cP GA 的最适作用pH 和温度分别为pH 7～9和50℃,在pH 5.0～8.0和低于40℃的范围较稳定.关键词:青霉素G 酰化酶;渗透休克;酶学性质中图分类号:Q 814.1 文献标识码:A　收稿日期:2009-09-30　基金项目:上海市重点学科建设项目(B505)　通讯作者:蒋咏梅(1971—　),副教授,博士,主要从事发酵工程研究.ymjiangbio @fjnu .edu .cn Properties of Recombinant Penicillin G Acylase Extractedfrom Escherichia coli by Osmotic ShockJIANG Yong -mei 1,2,ZHANG Wen -xian 1,WEI Dong -zhi2(1.College of L if e Sciences ,Fu j ian N or mal U niver sity ,Fuz hou 350108,China ;2.I nstitute of N ew w or ld Biotechnology ,E ast China U niver sityof Science and T echnology ,Shanghai 200237,China )Abstract :T o simplify the purification pro cess ,an ex tr act method of osm otic -shock w asused to seperate penicillin G acylase from E .coli .92.4%of PGA was released to the bufferso lution,the purity and specific enzyme activity r eached 80%and 26.4U /mg ,respectiv ely.The optimum reaction temper ature and pH of KcPGA were 50℃and pH 7～9,and it w asstable at 40℃and pH 5.0～8.0.Key words :penicillin G acy lase;o smo tic sho ck;char acter of enzym e青霉素G 酰化酶(penicillin G acylase,PGA , E.C.3.5.1.11),也叫青霉素G 酰胺水解酶(penicillin amido hy drolase )或青霉素G 酰胺酶(penicillin am idase ),自1950年在产黄青霉(P enicilnumchy sogenum )Q 176中发现以来[1],就以良好的催化酰化/去酰化特性受到了广泛关注.除了在抗生素工业的应用外,PGA 还因其具有良好的底物专一性和对映体的选择性,用于光学异构体的合成和拆分[2].鉴于青霉素G 酰化酶的广泛用途,有关该酶的提取与纯化也受到了人们的关注.目前应用较多的是大肠杆菌产生的胞内青霉素G 酰化酶,常规采用机械破碎结合多次层析的分离方法,不仅费时费力,得到的PGA 纯度也较低.金属离子亲和层析虽可提高酶的分离效率,回收率却不太理想[3].近年来,采用离子交换和双水相分离法得到了较好的纯化效果,但步骤相对繁琐[4-5].采用渗透休克法选择性地分离目标蛋白,对简化后期纯化工艺十分有利.自1965年首次报道[6]以来,人们尝试采用该方法释放各种胞内酶[7],但由于得到的酶蛋白纯度不高,因此,缺少系统的研究[8].由于大肠杆菌产生的青霉素G 酰化酶定位于仅含总蛋白5%～15%蛋白质的周质空间内,采用渗透休克法提取PGA,无需特殊设备和昂贵药品,有较大的优势.在实际应用中,对青霉素酰化酶的纯度要求往往不高.因此,本文尝试采用渗透休克的方法对大肠杆菌产生的重组青霉素G 酰化酶进行一步纯化,优化了其操作条件,并对PGA 的酶学性质进行了研究.1　材料与方法1.1　实验材料1.1.1　菌种大肠杆菌BL21(DE3)[pET 24(+)],携带p ga (K .citrop hila )基因.1.1.2　主要试剂对二甲基胺基苯甲醛(p -dintethylam ino benzaldehy de ),简称PDAB 溶液,500mL PDAB 溶于100mL 无水甲醇;青霉素G (penicillin G),华北制药厂出品;其余均为市售分析纯试剂.1.1.3　培养基保藏培养基:LB 培养基,含50m g/L 卡那霉素.发酵培养基:酵母粉30.0g /L ,甘油5.0g /L ,NaCl 5.0g /L ,卡那霉素50mg ,微量元素适量.调至pH 7.0.1.2　实验方法1.2.1　培养条件250mL 三角瓶装发酵培养基30mL ,接种量3%,30℃,200r /min ,旋转摇床培养,16h 后加0.5mm ol/L IPTG 诱导,继续培养6h 后收集菌体.1.2.2　超声波破碎细胞离心收集菌体,10mmo l /L T ris -HCl (pH =7.5)缓冲液洗涤离心,菌体重悬,超声破碎10m in (工作2s 间歇3s),保持菌液始终处于低温(0～4℃).破碎后在8000r /min 下冷冻离心10m in,所得上清液即为粗酶液.1.2.3　渗透休克发酵液离心去上清液,菌体洗涤后重悬于同体积高渗液中,室温放置一定时间,4℃离心10min ,取离心后的菌体迅速悬浮于预冷的同体积的50mm ol/L PBS (pH 7.5)中,冰浴15m in.溶液经10000r/m in,10min 离心后,分别取上清液和菌体(超声后使用)进行SDS-PAGE 检测和PGA 酶活测定.1.2.4　酶的最适作用pH 及pH 稳定性分别配制pH 值为4～11的50mmo l /L 缓冲液,包括醋酸盐(pH 4,5),磷酸盐(pH 6,7,8),硼酸盐(pH 9,10,11)缓冲液.青霉素G 钾盐用不同pH 的缓冲液配制成质量分数4%的溶液,在37℃进行酶促反应.用上述缓冲液稀释酶液,在37℃保温24h 后于标准条件检测酶活.1.2.5　酶的最适作用温度及稳定性在相同的pH 缓冲液条件下(pH 7.5),分别在20,30,40,50,60,70℃与质量分数4%的青霉素G 钾盐溶液进行酶促反应.酶液分别在20,30,40,50,60,70℃保温2h 后,在37℃与质量分数为4%的青霉素G 钾盐溶液进行酶促反应,检测酶活.1.3　测定方法1.3.1　蛋白含量测定Low ry 法.牛血清蛋白作为标准分子质量蛋白.1.3.2　SDS-PAGE 检测参照《蛋白质技术手册》[9],采用体积分数15%的电泳凝胶,上样量10 L .考马斯亮蓝R -250染色,凝胶成相分析软件扫描并分析蛋白含量.1.3.3　青霉素G 酰化酶活力的测定(PDAB 法)测定原理是青霉素G 酰化酶在37℃裂解青霉素G 产生6-APA,后者在酸性条件下与PDAB 形成西夫碱,在415nm 下有最大吸收[10].酶活定义为:在pH 7.5,37℃条件下每m in 催化青霉素G 产生1 mol /L 的6-APA 所需的酶量为1个单位(U ).根据以下公式计算酶活:73　第5期 蒋咏梅等:渗透休克法提取重组青霉素G 酰化酶及酶学性质研究酶活=(OD 415-0.02031)×V 反应0.11345×t 反应×V (酶).2　结果与讨论2.1　渗透休克法提取青霉素G 酰化酶条件的优化由于大肠杆菌产生的青霉素G 酰化酶主要定位于周质空间,采用渗透休克法不仅简便易行,还能选择性释放目标蛋白,因此优化了渗透休克法提取PGA 的条件.2.1.1　高渗处理时间实验将发酵结束的菌体悬浮于高渗溶液(质量分数为20%的蔗糖)中,分别静置不同时间,检测低渗液中的PGA 纯度和回收率.结果表明(图1),高渗处理30m in 可得到较好的纯度和收率,后续的条件优化以此为基础.2.1.2　蔗糖质量分数实验渗透休克的操作中,高渗液的质量分数很关键.分别采用不同质量分数的蔗糖进行实验.同时添加10mm ol/L 的EDTA 增加细胞膜的通透作用.由图2可见,随着蔗糖质量分数的增加,胞外的PGA 活力也显著增加,相应地,胞内酶活也随之减少.可见蔗糖质量分数增加导致细胞膜的渗透性增强.蔗糖的质量分数为30%时,85.0%的PGA 渗透出胞外.质量分数增加至40%,PGA 的回收率可达92.7%.图1　高渗时间对PGA 纯化的影响图2　蔗糖质量分数对渗透休克的影响渗透休克得到的主要是周质空间蛋白,由于PGA 定位于此,正如图3所示,杂蛋白较少,且胞外PGA 的2个亚基条带的强度随蔗糖质量分数的增加而增强,这与酶活测定结果相符.对该SDS-PAGE 中的蛋白条带进行纯度扫描(图4),发现蔗糖质量分数为10%时,PGA 在渗出液中所占比例最高,为79.4%.高渗液中蔗糖质量分数增加则导致回收的PGA 纯度下降.当蔗糖质量分数为40%,回收率达92.0%时,PGA 的含量已降至43.2%.增加蔗糖质量分数虽然可以提高回收率,但却以纯度的下降为代价.从实验的角度,选择蔗糖质量分数为30%继续后面的研究,此时的回收率和纯度分别为85.0%和61.5%.泳道1-5:表示渗透液的蛋白条带;泳道1’-5’:表示胞内的蛋白条带;泳道1、(1'),2、(2'),3、(3’),4、(4’),5、(5’):分别表示蔗糖质量分数为0,10%,20%,30%,40%时的蛋白条带图3　采用不同蔗糖质量分数对PGA渗透休克的SDS -PAGE 分析图4　蔗糖质量分数对PGA 纯度的影响　　74福建师范大学学报(自然科学版) 2010年　图5　EDTA 浓度对渗透休克的影响2.1.3　EDTA 浓度实验渗透休克中,通常添加EDT A 螯和细胞壁上的M g 2+,从而使其释放脂多糖(LPS ),导致细胞外膜渗透性增强.本实验在高渗溶液中分别添加不同浓度的EDT A,配合质量分数为30%的蔗糖,考察ED-TA 浓度对PGA 释放的影响.如图5所示,在本实验条件下,即使完全不加EDT A,渗透率已达到72.0%,而不加蔗糖时渗透率几乎为0(图3),这说明渗透休克中起关键作用的是蔗糖产生的高渗环境,EDT A 只起辅助作用.但ED-泳道1-5:表示渗透液的蛋白条带;泳道1'-5’:表示胞内的蛋白条带;泳道1、(1’),2、(2’),3、(3’),4、(4’),5、(5’):分别表示EDTA 浓度为0,1,10,50,100mmol/L 时的蛋白条带图6　采用不同EDTA 浓度对PGA 渗透休克的SDS -PAGE 分析TA 对渗透效果仍有一定影响.1m mol/L 的EDT A 可以使渗透率提高10%以上,随EDT A浓度增加,渗透率也逐步增大.当EDT A 浓度增至100mmo l /L 时,有92.4%的PGA 渗出细胞.对比前后2个实验,发现蔗糖的少量不足可通过增加EDT A 的浓度来弥补.图6为不同EDTA 浓度对PGA 渗透效果的SDS-PAGE 分析,胞外PGA 含量随EDT A浓度增加而增大,这与酶活测定结果相一致.对蛋白条带的PGA 纯度扫描结果(图7)显示,随着EDT A 浓度增加,胞内PGA 纯度随之下降,说明更多的PGA 从胞内释放出来.但ED-TA 在增加细胞透性的同时,导致部分细胞裂1-5:分别表示EDTA 浓度为0,1,10,50,100m mol /L 图7　EDTA 浓度对PGA 纯度的影响解,因此PGA 的纯度下降.经上述条件优化,采用渗透休克法提取重组大肠杆菌周质空间的青霉素G 酰化酶,酶的纯度为80%,回收率92.4%,纯化倍数3.22(表1).可见,与传统超声结合柱层析的方法相比,该法可更方便、快捷地得到周质空间的产品.2.2　青霉素G 酰化酶的酶学性质研究2.2.1　最适作用pH 及其pH 稳定性以上述实验得到的低渗上清液进行酶学性质研究.在一系列pH 值的缓冲液中分别测定酶活,以所得最高酶活为100%作图(图8),发现该酶在pH 5.0～9.0之间酶活较高,超出该范围,活力明显下降.酶液在不同pH 缓冲液中37℃保温24h ,接着在标准条件下检测其残余活力,发现该酶在pH 5.0～8.0的范围内比较稳定,酶活可达80%以上.与最适作用pH 的研究结果相似,都在偏碱性条件下有个急剧的酶活下降过程.表1　渗透休克提取青霉素G 酰化酶的效果总酶活/Um (总蛋白)/mg 比酶活/(U ・mg -1)回收率/%纯化倍数全菌超声破碎液3120638008.2100-渗透休克法28834109126.492.4 3.222.2.2　最适作用温度及其热稳定性在相同的pH 缓冲液条件下(pH 7.5),分别在不同温度测定粗酶液的活性.如图9所示,PGA 的酶活受温度影响很大,最适作用温度为50℃,过高过低都不利于酶促反应的进行.KcPGA 的热稳定性不高,40℃保温2h 后酶活损失4%,50℃保温后酶活仅残余20%.75　第5期 蒋咏梅等:渗透休克法提取重组青霉素G 酰化酶及酶学性质研究图8　pH 对PGA 活性和稳定性的影响图9　温度对PGA 活性和稳定性的影响3　结论由于大肠杆菌的遗传背景清晰,常利用它来表达重组蛋白.根据目的产物分布的位置不同,采用合适的分离方法,可收到事半功倍的效果.本文对重组大肠杆菌BL21(DE3)[PET 24(+)]产生的来源于克鲁沃尔氏菌属(K luy ver a citrop hila )的青霉素G 酰化酶进行了一步纯化的研究.利用渗透休克法提取定位于周质空间的KcPGA ,通过高渗液处理时间及蔗糖和EDT A 浓度的调整,回收率92.4%的PGA 释放到胞外,且纯度达80%,可得到26.4U /m g 的比酶活,纯化倍数为3.22.此外,对PGA 的酶学性质进行了初步研究,发现KcPGA 的最适作用pH 和温度分别为pH 7～9和50℃,在pH 5.0～8.0和低于40℃的范围内比较稳定.参考文献:[1]Sakaguchi K ,M ur ao S .A preliminar y repor t o n a new enzyme “penicillin amidase ”[J ].Jo ur nal of A g riculturaland Chemical Societ y,1950,23:411-418.[2]Br ugg ink A ,Roo s E C ,de V ro om E .Penicillin acylase in the industr ial pr oduction o f -lactam antibio tics [J ].Or ganic P ro cess Resear ch and Dev elo pment ,1998,2:128-133.[3]Sanchez J,V er do ni N ,Fitton V ,et al.Efficient tw o -step chr omato gr aphic pur ification o f penicillin acylase fro mclar ified Escher ichia coli ult raso nic ho mog enat e [J ].Jour nal o f Chr omato gr aphic B Biomedical Science A pplicatio n ,2001,753(1):45-50.[4]F uent es M ,Bata lla P,G razu 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经验交流298 2015年5月人工设计青霉素G酰化酶酶原的实验研究曹春来1肖拥军1田忠2刘合栋1张伟11联邦制药股份有限公司，广东珠海 519041 2遵义医学院珠海校区研究生院，广东珠海 519041摘要：目的：提供一种人工设计的青霉素G酰化酶酶原以及编码青霉素G酰化酶酶原的核苷酸序列和发酵方法，以提高青霉素G酰化酶的酶活性。

方法：将人工设计的青霉素G酰化酶酶原的核苷酸序列，通过重组DNA技术导入四种大肠杆菌中，经筛选获得产青霉素G酰化酶能力最佳的两种重组工程菌，通过发酵实验可测定两种工程菌产生的青霉素G酰化酶的最高酶活性，并通过HPLC(高效液相色谱法)测定其合成阿莫西林的能力。

结果：通过重组DNA技术获得产酶能力最佳的两种基因工程菌BL21/pET9a-PGA和BL21(DE3)/pET28a-PGA，两种工程菌表达的青霉素G酰化酶的分解活性都有了很大的提高，分别为28000U/L和35000 U/L，且具有催化6-APA和HPGMe.HCl合成阿莫西林的能力。

结论：本实验人工设计的青霉素G酰化酶原的氨基酸编码序列在工程菌BL21/pET9a-PGA和BL21(DE3)/pET28a-PGA中表达产生青霉素G酰化酶的能力强，且得到的青霉素G酰化酶酶活性高，能催化6-APA和HPGMe.HCl合成阿莫西林。

本研究为提高青霉素G酰化酶酶活性提供了一种新的方法：和技术。

关键词：青霉素G酰化酶；核苷酸序列；重组ＤＮＡ技术；酶活性中图分类号：R730.5 文献标识码：A 文章编号：1671-5837(2015)09-0298-03青霉素酰化酶是一种重要的工业酶，广泛应用于抗生素工业生产。

抗生素生产正经历由化学合成到生物催化的转变，青霉素酰化酶是该催化过程中最重要的一类酶[1]，其来源十分广泛，包括细菌、酵母和真菌等。

从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的蛋白质数据库中，检索青霉素G酰化酶共获得了2595条序列，其中大肠杆菌162条，铜绿假单胞菌125条。

青霉素G酰化酶制备,晶体生长及初步晶体学研究
伍伯牧;陈红
【期刊名称】《生物物理学报》
【年(卷),期】1997(013)004
【摘要】用基因工程菌Ｅ．ＣｏｌｉＡＥ１０９生产青霉素Ｇ酰化酶，该酶经分离纯化后，摸索了晶体生长条件。

用ＰＥＧ８０００作为沉淀剂以两种方法获得了晶体，晶体衍射能力超过２．０Ａ，初步晶体学研究显示晶胞参数ａ＝５２．１９Ａ，ｂ＝６９．３５Ａ，ｃ＝７３．９０Ａ，α＝６８．８０°β＝７１．４０°，γ＝７４．２０°，空间群Ｐ１，收集了一套２．５Ａ分辨率的数据。

【总页数】3页(P702-704)
【作者】伍伯牧;陈红
【作者单位】中国科学院生物物理研究所;中国科学院生物物理研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q555.302
【相关文献】
1.毕赤酵母系统来源的重组人血清白蛋白的制备及初步晶体学分析 [J], 陈蕴;黄鹏飞;郭瑞庭;金坚
2.B链羧端去三肽(B28-B30)与去四肽(B27-B30)胰岛素的制备及去三肽胰岛素的初步晶体学研究 [J], 茅毓新;李梅
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4.葡萄球菌核酸酶R型的晶体生长及初步晶体学分析 [J], 叶升;万柱礼
5.斑头雁脱氧血红蛋白的晶体生长及X射线晶体学的初步研究 [J], 华子千;方益菱因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

青霉素G酰化酶产生菌发酵条件研究青霉素G酰化酶产生菌发酵条件研究摘要：青霉素G酰化酶是合成半合成青霉素的关键酶，其产生菌的发酵条件对于青霉素生产的效率和产量具有重要影响。

本研究旨在探究影响青霉素G酰化酶产生菌发酵的关键因素，并通过优化发酵条件，提高酶的产量和稳定性。

引言青霉素是一种广泛应用于临床治疗的重要抗生素，其核心结构由青霉素G酰化酶催化青霉素G的酰化反应合成。

青霉素G酰化酶的产量和酶活性直接影响着半合成青霉素的生成量和质量，因此研究青霉素G酰化酶产生菌的发酵条件对于提高生产效率至关重要。

方法和结果1. 菌株的筛选和培养基优化：在实验室内筛选了多个潜在的青霉素G酰化酶产生菌株，并采用试管内培养进行初步筛选。

经过多次筛选和评价后，确定了最优菌株。

2. 发酵条件的优化：通过单因素实验和正交试验，对发酵条件进行全面优化。

经实验测定，最佳发酵温度为30℃，最佳pH为7.5，最佳发酵时间为72小时，最佳搅拌速度为150rpm。

3. 发酵介质的优化：通过改变发酵介质的碳源、氮源和无机盐的组成和浓度，进行多次试验优化。

经实验测定，最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母提取物，最佳无机盐浓度为2.0 g/L。

4. 辅助因素的优化：通过添加适量的表面活性剂和辅酶Q10，进一步提高青霉素G酰化酶的产量和稳定性。

讨论通过对发酵条件的优化，本研究成功提高了青霉素G酰化酶的产量和稳定性。

最佳发酵条件为温度30℃，pH 7.5，发酵时间72小时，搅拌速度150rpm。

最佳发酵介质为含葡萄糖、酵母提取物和2.0 g/L无机盐的培养基。

辅助因素的添加进一步提高了酶的产量和稳定性。

结论本研究对青霉素G酰化酶产生菌的发酵条件进行了研究和优化，为青霉素生产提供了重要的理论基础和实验指导。

通过优化生产条件，有效提高了青霉素G酰化酶的产量和质量，为青霉素药物的生产提供了有力支持。

通过对青霉素G酰化酶产生菌的发酵条件进行优化，本研究成功提高了酶的产量和稳定性。

青霉素G酰化酶的改造和固定化研究的开题报告一、选题背景及意义青霉素G是一种具有广谱抗菌活性的β内酰胺类抗生素，在医学和兽药领域被广泛应用。

但是，青霉素酰基水解酶的存在限制了其使用范围和药效，因此寻找革新青霉素酰化技术的方法显得尤为重要。

而酰化酶的改造和固定化则成为了当前较为研究的方向与方法。

二、研究目的本研究的目的在于通过改造青霉素G酰化酶的活性位点，构建出具有高活性和产率的工程菌，并通过固定化技术，提高酰化酶的稳定性与重复使用性，从而实现合成高纯度、高质量的青霉素G。

三、研究内容和方法1.青霉素G酰化酶的建模与分析。

利用生物信息学和分子模拟等方法，根据已知的结构信息和功能位点，建立青霉素G酰化酶的三维结构模型，分析酶的结构特征和作用机制。

2.酶的改造与筛选。

利用线性和平面的改造方法改变酶的活性位点，经过筛选与优化，得到具有高活性和稳定性的新型青霉素G酰化酶。

3.青霉素G的合成实验。

选取酰化酶的最佳条件，苯丙酸（或其酯）和青霉素G为底物，通过化学合成制备合成前体，最终通过提纯得到高纯度、高质量的青霉素G。

4.酶的固定化实验。

通过将酰化酶固定在载体上，如Nylon 6和聚乙烯醇（PVA）等，使其具有更好的稳定性和重复利用性。

并在不同的操作条件下，比较固定化酶和游离酶的酰化效率、产率和稳定性差异。

四、研究预期结果1.成功建立青霉素G酰化酶的三维结构模型，分析了其结构和功能特点。

2.通过改造酶的活性位点，筛选出具有高活性和高稳定性的酯化酶，并合成了高纯度、高质量的青霉素G。

3.通过固定化实验，得到具有更高稳定性和重复利用性的酰化酶。

五、研究进度安排1.前期准备和文献调研：一周。

2.酶的结构建模与分析：两周。

3.酶的改造和筛选：三周。

4.青霉素G的合成实验：三周。

5.酶的固定化实验：两周。

6.结果分析和论文撰写：两周。

7.答辩准备和论文修改：一周。

总计实践时间：14周。

2003 年6 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities June 2003 文章编号:1003-9015(2003)03-0266-06重组枯草芽孢杆菌生产青霉素G酰化酶发酵条件的研究徐志南, 陈秀奇, 陈新爱, 岑沛霖(浙江大学化学工程与生物工程学系, 浙江杭州 310027)摘要: 对产青霉素G酰化酶的温度诱导型重组枯草芽孢杆菌发酵条件进行了研究。

结果表明，培养基的最佳氮源和碳源组成为：35g⋅L−1牛肉膏、3g⋅L−1葡萄糖和6g⋅L−1淀粉；最佳诱导时机是细胞对数生长的中后期，诱导前应将pH调节至中性；最佳诱导条件为升高温度至50℃并维持4min；随后将温度降低到34℃进行重组蛋白的表达。

在上述条件下，PGA的表达水平可以达到5.8U⋅mL−1。

SDS-PAGE电泳分析表明该重组菌能够将绝大部分表达的PGA分泌到细胞外，而且表达的PGA蛋白占有高比例(≥90%)。

关键词：　青霉素G酰化酶; 温度诱导; 重组枯草杆菌; 发酵条件中图分类号：TQ920.1; Q55 文献标识码：A1 前言β-内酰胺类抗生素及其中间体的生产正经历一场变革，传统的化学转化工艺正在为酶促反应所取代[1]。

青霉素G酰化酶(Penicillin G acylase,E C 3.5.1.11,PGA)是β-内酰胺类抗生素工业中最为关键的酶之一，既能催化青霉素G水解成为6-氨基青霉烷酸和苯乙酸，又能催化头孢霉素C生产7-氨基头孢烯酸，还能用于高效催化半合成头孢菌素的合成。

工业化生产PGA主要采用大肠杆菌和巨大芽孢杆菌，虽然经过复杂的诱变育种，仍存在产酶水平较低、变温发酵和需要苯乙酸诱导等缺点[2]。

目前，国内外研究者都在利用基因重组技术将PGA基因克隆并在大肠杆菌或芽孢杆菌中表达，以期大幅度提高PGA的产量和简化生产工艺[3~6]。

与重组大肠杆菌系统相比，重组枯草杆菌系统具有较强的表达蛋白后加工能力，产物能够分泌到胞外，从而有利于目标蛋白的分离和纯化[7]。

巨大芽孢杆菌BP931胞外青霉素G酰化酶的产生条件
崔福绵;韩文珍
【期刊名称】《微生物学报》
【年(卷),期】1996(036)003
【摘要】研究了巨大芽孢杆菌ＢＰ９３１胞外青霉素Ｇ酰化酶的产生条件。

菌在
由葡萄糖０．７％，氮源１号０．５％，酵母膏１．０％和苯乙酸０．８％组成的液体培养基中，２８℃振荡培养４４ｈ以６－硝基－３－苯乙酰胺基苯甲酸为底物，培养滤液酶活力为９．０ＩＵ／ｍｌ。

【总页数】6页(P193-198)
【作者】崔福绵;韩文珍
【作者单位】中国科学院微生物研究所;中国科学院微生物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.124
【相关文献】
1.巨大芽孢杆菌发酵产青霉素G酰化酶的条件优化 [J], 颜丽;张永玲;杨富民;邵威
平
2.重组巨大芽孢杆菌产青霉素G酰化酶发酵条件研究 [J], 范超;黎继烈;吴浩;朱晓媛;郝聚喜;丁丽霞;张蕾
3.棘孢木霉胞外β-糖苷水解酶的产生条件及基本特征 [J], 王剑锋;李江;杨红;谭可;张浩;刘亚洁
4.巨大芽孢杆菌产胞外核糖核酸酶的分离纯化及部分酶学性质研究 [J], 赵芯;成丽
丽;邓玉;敬海明;唐云明
5.高产生物膜乳酸菌的筛选、鉴定及胞外多糖分泌条件的研究 [J], 钟华晨;张悦;顾悦;郑砚学;纪亚楠;王艳;贺银凤
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青霉素酰化酶性质及应用研究的开题报告开题报告：一、选题背景青霉素是由放线菌属菌株所产生的一种抗生素，具有广谱抗菌活性。

但是，随着细菌对青霉素的抵抗性不断提高，使得治疗效果不尽如人意。

为了解决这一问题，科学家们采用酰化技术对青霉素进行改良。

其中，青霉素酰化酶作为酰化技术的关键酶类，成为当前研究热点之一。

二、研究目的本研究旨在通过收集和分析青霉素酰化酶的性质、生理活性及应用研究现状，全面了解该酶类的特点和应用前景。

同时，结合现有文献，展望该技术在医药领域中的潜在价值，以促进其实际应用推广。

三、研究内容1. 青霉素酰化酶的基本性质及结构- 青霉素酰化酶的生物学特点- 青霉素酰化酶的结晶结构与活性位点- 青霉素酰化酶的亚型分类及功能特点2. 青霉素酰化酶的生物学活性研究- 青霉素酰化酶的酯化反应机制- 青霉素酰化酶对不同基质的催化效果研究- 青霉素酰化酶对温度、酸碱值等因素的适应性研究3. 青霉素酰化酶在药物研发中的应用研究- 青霉素酰化酶在青霉素衍生物的合成中的应用- 青霉素酰化酶在糖皮质激素药物中的应用- 青霉素酰化酶在抗肿瘤药物中的应用四、研究方法本研究将采用文献资料收集和分析的方法，结合实验数据，对青霉素酰化酶的性质及应用进行深入探究。

同时，通过对相关研究文献的综合分析，获得准确的结论和科学的结论。

五、研究意义本研究对于青霉素酰化酶的特性、作用机制及其在医药领域的应用研究具有重要的科学意义。

其结果不仅有助于深入了解酰化技术的原理和发展，也有助于开发新的抗生素等药物及药效更为显著的医药品种，为临床疾病的治疗提供更可靠的手段。

青霉素G酰化酶工程菌培养条件的研究任立华【摘要】以产生青霉素G酰化酶的工程菌株LRN075为研究对象,通过正交试验优化了培养条件,研究了不同比例的培养基成分对酶产量的影响.结果显示在最优条件下,进行了2000L发酵罐的发酵试验,该菌株在培养36h酶活最高达到2.28×104U·L-1.细胞破碎实验表明,高压均质法效果最佳,可以使酶达到最大程度的释放.【期刊名称】《药学研究》【年(卷),期】2010(029)011【总页数】4页(P651-654)【关键词】青霉素酰化酶;大肠杆菌;发酵【作者】任立华【作者单位】鲁南制药集团股份有限公司,山东,临沂,276006【正文语种】中文【中图分类】TQ460.38青霉素G酰化酶(酰基转移酶)是用于抗生素中间体6 -氨基头孢烷酸(6-APA)和7-氨基脱乙酰头孢烷酸(7-ADCA)生产的重要酶制剂,目前已经在工业中得到了广泛的应用[1,2].很多微生物,包括细菌、放线菌、真菌均可以产生青霉素酰化酶,目前应用最多的是大肠杆菌和巨大芽孢杆菌生产的青霉素酰化酶[3].在7-ADCA的生产中主要使用了大肠杆菌表达的酶,然后将其固定化,用于催化头孢菌素 G水解生成7-ADCA[4].本实验中应用基因工程手段筛选到一株大肠杆菌LRN075,经检测酶活性比原菌株提高了5倍多,在2000L发酵罐中进行中试培养研究,平均酶活为:2.06×104U·L-1.所得菌体经高压均质,对均质液中的青霉素酰化酶进行了分离纯化,酶比活力达到31.68U·mg-1,活性为63.68U· mL-1.1 材料与方法1.1 材料和仪器蔗糖(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);胰蛋白胨(生化试剂,OXOID);酵母提取物(生化试剂,安琪酵母股份有限公司);氯化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);琼脂粉(生化试剂,北京惠泽奥公司);硫酸铵(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);磷酸二氢钾(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);七水合硫酸镁(分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司);葡萄糖(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);氢氧化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);2000L发酵系统(上海高机生物工程有限公司);FUMA QYC-211摇床(上海福玛实验设备有限公司);DEL TA320酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司); LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司);SBA-4多功能谷氨酸-葡萄糖分析仪(山东省科学院生物研究所).1.2 菌株和培养基1.2.1 菌株:大肠杆菌LRN075(Escherichia coli LRN075),鲁南制药集团股份有限公司保存.1.2.2 斜面培养基(g·L-1):葡萄糖5g,酵母提取物10g,胰蛋白胨20g,NaCl 3g,琼脂15g,p H6.9～7.1,去离子水定容,0.11MPa湿热灭菌30min.1.2.3 摇瓶和一级种子培养基(g·L-1):蔗糖15g,酵母提取物20g,磷酸二氢钾5g,七水合硫酸镁0.5g,碳酸钙0.1g,去离子水定容,p H6.9～7.1,0.11MPa湿热灭菌30min.1.2.4 二级种子培养基(g·L-1):蔗糖10g,酵母提取物10g,磷酸二氢钾5g,七水合硫酸镁0.5g,氢氧化钠0.2g,碳酸钙0.1g,p H6.9～7.1,去离子水定容,0.11MPa湿热灭菌30min.1.2.5 发酵培养基(g·L-1):葡萄糖5g,蔗糖15g,胰蛋白胨30g,磷酸二氢钾10g,七水合硫酸镁0.5g,碳酸钙 0.1g,去离子水定容,p H6.9～7.1,0.11MPa湿热灭菌30min.1.3 培养方法1.3.1 摇瓶发酵方法:将甘油管大肠杆菌LRN075接入试管斜面培养基30℃培养48h后,挑取斜面单菌落接种于种子培养基(250mL三角瓶装液40mL),30℃、摇床转速200r· min-1培养16h,按10%接种于发酵培养基(500mL三角瓶装液50mL),28℃、200r·min-1振荡培养28h.培养完毕后,菌液在4℃,4000r·min-1离心收集菌体用于酶活测定.1.3.2 2m3罐发酵试验:发酵采用250mL摇瓶制备摇瓶种子(250mL三角瓶装液40mL),制备3个摇瓶种子,121℃灭菌30min,从斜面挑取单菌落接种后30℃培养16h,然后按1%接种量接种于20L一级种子罐(装液量12L),30℃、180r· min-1培养8h后按10%接种量转接于200L二级种子罐(装液量120L),30℃、120r·min-1培养12h后转接于2000L发酵罐(装液量1500L,按发酵培养基配方投料,121℃灭菌30min后备用),28℃,150～200r·min-1培养36h后放罐.1.4 分析方法酶活测定方法.1.4.1 发酵、摇瓶菌体活力测定:取5mL发酵液于已知重量的离心管中,10000r·min-1离心5min,弃上清,用滤纸吸干离心管内残余液体,称量并计算湿菌体重量,再向离心管中加入4mL 0.87%的生理盐水,搅拌均匀后,倒入25mL烧杯中,取10mL预热到37℃的底物溶液加入烧杯中,恒温37℃并搅拌,用0.1mol·L-1的NaOH溶液调p H至7.8左右计时,保持p H反应3～5min,记录消耗的碱量. 1.4.2 酶液和固定化酶活力测定:准确量取一定体积的酶液(或称量一定重量的固定化酶),加入25mL烧杯中,取10mL预热到37℃的底物溶液迅速加入至烧杯中,恒温37℃搅拌,用0.1mol·L-1的NaOH溶液调p H至7.8左右计时,保持p H反应3～5min,记录消耗的碱量.酶活力的计算:酶活力单位:单位酶量每分钟消耗1μmol NaOH为一个单位(U).2 试验结果2.1 发酵培养基配方的优化初步的研究发现,发酵培养基配方中葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨、磷酸二氢钾对菌体细胞的酶活影响比较大,因此设计了L9(34)正交试验,因素和水平选择如下:表1 因素水平表因素水平A B C D葡萄糖蔗糖胰蛋白胨磷酸二氢钾1 5 10 20 5 2 7.5 15 25 10 3 10 20 30 15表2 实验方案L9(34)正交表11 1 1 1 1.89 21 2 2 2 2.21 31 3 3 3 2.11 42 1 2 3 1.82 52 2 3 1 2.16 62 3 1 2 2.01 73 1 3 2 2.10 83 2 1 3 1.93 93 3 2 1 2.05 K1 6.21 5.91 5.83 5.98 ∑Yi=18.28 K2 6.00 6.21 6.15 6.32 ¯Y=2.031 K3 6.05 6.14 6.28 5.96￣K1 2.07 1.97 1.9433 1.9933 ∑Y2i=37.2638￣K2 2.00 2.07 2.05 2.1067 ST=∑Y2i-C=0.135089￣K3 2.0167 2.0467 2.0933 1.9867 R 0.07 0.10 0.15 0.12 A1B2C3D2 S 0.008 0.0164 0.0358 0.0273正交试验综合结果表明,最佳组合为A1B2C3D2.正交试验综合结果的方差分析:以S最小者作为误差(Sb),计算F.计算结果列于表3. 根据方差分析,C因素有极显著影响,B和D因素有显著影响.综合分析结果表明,所得到的最佳结果为:葡萄糖5g· L-1,蔗糖15g·L-1,胰蛋白胨30g·L-1,磷酸二氢钾10g· L-1.表3 方差分析表注:＊表示显著性,F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00方差来源偏差平方和自由度均方 Fee 显著性B 0.0164 2 0.0082 2.05 ＊0.0358 2 0.0179 4.475 ＊＊D 0.0273 2 0.0136 3.4 ＊误差 0.008 2 0.004 C2.2 培养温度对酶活的影响工程菌在不同的培养温度下生长状态不同,而且酶的活性对温度变化比较敏感,青霉素G酰化酶的表达量和比活也随着温度的不同而变化,在不同温度条件下对菌株进行培养,测定培养后的细胞酶活,结果如图1所示:图1 不同温度对酶活的影响由图可以看出,在优化后的培养条件下,当菌株的培养温度在30℃时,收获细胞的酶活达到最高:2.28×104U· L-1.2.3 不同破壁方式对酶活的影响青霉素 G酰化酶在7-ADCA转化当中,为提高酶的稳定性、酶对p H值和温度的适应性,以及提高酶的反复使用性,均将细胞破壁后将酶释放出来,然后将其固定化用于酶促反应.破壁方式在很大程度上影响着固定化酶的活性,在本实验中采用溶菌酶法、超声波法、高压均质法和反复冻融法对细胞进行破壁,促进酶的释放,破壁后的悬液在8℃下、8000r·min-1离心,上清用于酶活测定,结果如图2所示.图2 破壁方式对酶活的影响结果表明,几种破壁方式均可以使酶活有不同程度的提高,其中高压均质法可以使酶活提高80%以上,而且高压均质法具有易操作、处理量大、时间短、酶活损失少等优点,是目前主要采用的破壁方式.2.4 2000L发酵罐的培养及酶液收集实验按照优化好的培养基配方配制1.5吨发酵培养基,装入发酵罐,灭菌后按照1.3.2的方法进行发酵,发酵过程采用p H全程自控7.0,通过调节转速和通气量维持溶氧30%以上,培养7.5h后开始流加补料(补料成分:100g·L-1蔗糖,45g·L-1胰蛋白胨,p H7.0,121℃灭菌20min后使用),期间测定残糖,维持还原糖浓度1.2g·L-1左右,36h后停止发酵(菌浓度和酶活性曲线如图3).陶瓷膜收集菌体,用20mmol·L-1磷酸缓冲液(p H7.0)150L悬浮后在50MPa高压均质2～3次,然后保持恒温,陶瓷膜收集上清,浓缩,得到料液103L,测得酶活性为63.38U·mL-1,总酶活6.53×106U.该料液可作为原料酶用于固定化酶的生产.3 讨论大肠杆菌青霉素酰化酶催化制备7-ADCA目前已经在工业中得到了广泛的应用,在传统抗生素的改造中作出了巨大的贡献.工业生产中要求酶有高的催化效率、低的生产成本,而菌种培养条件的优化和高产菌株的选育成为实现以上目标的重要手段.在本实验中构建了高产青霉素酰化酶的大肠杆菌LRN075菌株,并对该菌株进行了培养条件的研究,培养基配方为葡萄糖5g·L-1,蔗糖15g·L-1,胰蛋白胨30g·L-1,磷酸二氢钾10g·L-1,培养温度30℃,收获细胞的酶活达到较高水平:2.28×104U·L-1. 研究过程中考察了菌株在培养过程中不同时间的酶活情况,发现摇瓶培养在 28h达到酶活高峰1.10×104U· L-1,而在发酵罐中 36h才达到酶活高峰2.28×104U· L-1,其原因可能是发酵罐中补料造成了菌体生长对数期的延长,因此酶活高峰也相应延迟,同时研究发现发酵罐中发酵结束时的酶活是摇瓶中的两倍左右.为了降低成本、保证酶的多次重复使用,需将酶固定于固相载体而便于回收[5].而青霉素酰化酶为胞内酶,在固定之前需将其从细胞内释放出来,本实验采用了四种方式进行了细胞破壁,虽然这几种方式使得酶活均有不同程度的提高,但是高压均质法由于设备简单易得、处理量大,而使得工序时间短,酶活损失少,被我们选择使用.在优化工艺的基础上,我们成功进行了2000L发酵罐的培养.目前已经正常生产四十余批,且无一次染菌.生产的发酵液经后续各步骤处理,已成功用于本公司7-ADCA 的生产.在随后的研究中,将进一步探讨青霉素酰化酶的纯化和固定化载体条件的选择和固定化方法.参考文献[1]崔鹏,万敏.青霉素酰化酶的生产与应用新进展[J].化学工业与工程技术,2005,26(6):42～45.[2]Parmar A,Kumar H,Marwaha SS.et.al.Advances in enzymatic transformation of penicillins to 6-aminopenieillanic acid(6-APA)[J].Biotechnol Adv.,2000,18(4):289～301.[3]Kalleaberg AI,Rantwijk F,SheldonR A.Immobilization of penicillin G acylase:The key to optimum performance[J] .Adv.Synth.Catal.,2005,347(7～8):905～926.[4]Dengchao Li,Shiwei Cheng,Dongzhi Wei,et al.Production of enantiomerically pure(S)-β-phenylalanineand(R)-β-phenylalanine by penicillin G acylase fromEscherichia coliin aqueousmedium[J].Biotechnology Letters,2007,29(12):1825～1830.[5]H.Fazelinia,A.Kheirolomoom.Immobilization of penicillin G acylase on non-porous ultrafine silica particles[J].Scientia Iranica,2005,12(3):295～299.。