青霉素G酰化酶研究进展共26页

【关键字】论文浅谈青霉素研发进展学生姓名康树伟班级生化1406专业名称生化制药技术系部名称制药工程系指导教师马丽锋提交日期答辩日期河北化工医药职业技术学院年月目录一、青霉素的开发历程………………………………………………………………….二、青霉素结构确定……………………………………………………………………..三、青霉素结构与性质………………………………………………………………….四、青霉素分类……………………………………………………………………………...五、青霉素的合成………………………………………………………………………….六、青霉素的抗菌作用机制………………………………………………………….七、青霉素抗生素的耐药性………………………………………………………….八、青霉素的结构改造………………………………………………………………….九、青霉素的生产方法…………………………………………………………………十、青霉素使用现状……………………………………………………………………..十一、结语………………………………………………………………十二、参考文献…………………………………………………………青霉素的研发进展摘要：青霉素是第一种能够治疗人类疾病的抗生素, 在与细菌作斗争和保护人类健康中起重要作用。

青霉素的出现，使人类终于有了对抗细菌感染的特效药，在二战时期欧洲战场上无数伤员因伤口感染化脓而死亡，当时的抗菌良药磺胺也无济于事，此时青霉素发挥了它的作用，挽救了成千上万伤员的生命。

青霉素的发现，引发了医学界寻找抗菌素新药的高潮，人类进入了合成新药的时代。

本文主要对青霉素的发现、发展、结构和分类, 以及青霉素的作用机制、生产方法和使用现状等方面进行了介绍。

关键词：青霉素；青霉素的结构、分类；抗菌作用机制；生产方法一、青霉素的开发历程1928年9月，细菌学家亚历山大•弗莱明在英国伦敦圣玛丽医院的一间实验室里发现，青霉菌具有强烈的杀菌作用，而且就连其培养汤也有较好的杀菌能力。

青霉素酰化酶的生产与应用新进展
崔鹏;万敏
【期刊名称】《化学工业与工程技术》
【年(卷),期】2005(26)6
【摘要】介绍了青霉素酰化酶的生产及应用新进展.着重介绍了青霉素酰化酶固定化技术的发展.青霉素酰化酶主要应用于6-氨基青霉烷酸的工业生产和半合成的β-内酰胺抗生素的合成,是在半合成抗生素的生产上有重要作用的一种酶.此外,青霉素酰化酶也可应用于其它的生物转化,如肽的合成、手性化合物的外消旋混合物的拆分.
【总页数】4页(P42-45)
【作者】崔鹏;万敏
【作者单位】青岛科技大学,山东,青岛,266042;青岛科技大学,山东,青岛,266042【正文语种】中文
【中图分类】Q55
【相关文献】
1.青霉素酰化酶的固定化与应用新进展 [J], 周成;王安明;王华;杜志强;祝社民;杨明;张俊;沈树宝
2.固体制剂药物优质生产优化技术开发应用新进展 [J], 方会庆
3.探究氮化钛粉末生产工艺及其应用新进展 [J], 吕容林
4.青霉素酰化酶的生产及其在制造—6APA上的应用 [J], Shew.,JC;廖福荣
5.辊压机在水泥生产中应用的最新进展 [J], 王振生;石国平;王明治;王娜;柴星腾
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第26卷　第5期2010年9月福建师范大学学报(自然科学版)Jo ur nal of F ujian N or mal U niver sity (Nat ur al Science Edition)V ol.26　N o.5Sept.2010文章编号:1000-5277(2010)05-0072-05渗透休克法提取重组青霉素G 酰化酶及酶学性质研究蒋咏梅1,2,章文贤1,魏东芝2(1.福建师范大学生命科学学院,福建福州　350108;2.鲁华生物技术研究所,华东理工大学,上海　200237) 摘要:为简化后期提取工艺,采用渗透休克法提取基因工程菌重组青霉素G 酰化酶,回收率92.4%的酶蛋白释放到胞外,纯度达80%,比酶活26.4U /mg .酶学性质研究表明,K cP GA 的最适作用pH 和温度分别为pH 7～9和50℃,在pH 5.0～8.0和低于40℃的范围较稳定.关键词:青霉素G 酰化酶;渗透休克;酶学性质中图分类号:Q 814.1 文献标识码:A　收稿日期:2009-09-30　基金项目:上海市重点学科建设项目(B505)　通讯作者:蒋咏梅(1971—　),副教授,博士,主要从事发酵工程研究.ymjiangbio @fjnu .edu .cn Properties of Recombinant Penicillin G Acylase Extractedfrom Escherichia coli by Osmotic ShockJIANG Yong -mei 1,2,ZHANG Wen -xian 1,WEI Dong -zhi2(1.College of L if e Sciences ,Fu j ian N or mal U niver sity ,Fuz hou 350108,China ;2.I nstitute of N ew w or ld Biotechnology ,E ast China U niver sityof Science and T echnology ,Shanghai 200237,China )Abstract :T o simplify the purification pro cess ,an ex tr act method of osm otic -shock w asused to seperate penicillin G acylase from E .coli .92.4%of PGA was released to the bufferso lution,the purity and specific enzyme activity r eached 80%and 26.4U /mg ,respectiv ely.The optimum reaction temper ature and pH of KcPGA were 50℃and pH 7～9,and it w asstable at 40℃and pH 5.0～8.0.Key words :penicillin G acy lase;o smo tic sho ck;char acter of enzym e青霉素G 酰化酶(penicillin G acylase,PGA , E.C.3.5.1.11),也叫青霉素G 酰胺水解酶(penicillin amido hy drolase )或青霉素G 酰胺酶(penicillin am idase ),自1950年在产黄青霉(P enicilnumchy sogenum )Q 176中发现以来[1],就以良好的催化酰化/去酰化特性受到了广泛关注.除了在抗生素工业的应用外,PGA 还因其具有良好的底物专一性和对映体的选择性,用于光学异构体的合成和拆分[2].鉴于青霉素G 酰化酶的广泛用途,有关该酶的提取与纯化也受到了人们的关注.目前应用较多的是大肠杆菌产生的胞内青霉素G 酰化酶,常规采用机械破碎结合多次层析的分离方法,不仅费时费力,得到的PGA 纯度也较低.金属离子亲和层析虽可提高酶的分离效率,回收率却不太理想[3].近年来,采用离子交换和双水相分离法得到了较好的纯化效果,但步骤相对繁琐[4-5].采用渗透休克法选择性地分离目标蛋白,对简化后期纯化工艺十分有利.自1965年首次报道[6]以来,人们尝试采用该方法释放各种胞内酶[7],但由于得到的酶蛋白纯度不高,因此,缺少系统的研究[8].由于大肠杆菌产生的青霉素G 酰化酶定位于仅含总蛋白5%～15%蛋白质的周质空间内,采用渗透休克法提取PGA,无需特殊设备和昂贵药品,有较大的优势.在实际应用中,对青霉素酰化酶的纯度要求往往不高.因此,本文尝试采用渗透休克的方法对大肠杆菌产生的重组青霉素G 酰化酶进行一步纯化,优化了其操作条件,并对PGA 的酶学性质进行了研究.1　材料与方法1.1　实验材料1.1.1　菌种大肠杆菌BL21(DE3)[pET 24(+)],携带p ga (K .citrop hila )基因.1.1.2　主要试剂对二甲基胺基苯甲醛(p -dintethylam ino benzaldehy de ),简称PDAB 溶液,500mL PDAB 溶于100mL 无水甲醇;青霉素G (penicillin G),华北制药厂出品;其余均为市售分析纯试剂.1.1.3　培养基保藏培养基:LB 培养基,含50m g/L 卡那霉素.发酵培养基:酵母粉30.0g /L ,甘油5.0g /L ,NaCl 5.0g /L ,卡那霉素50mg ,微量元素适量.调至pH 7.0.1.2　实验方法1.2.1　培养条件250mL 三角瓶装发酵培养基30mL ,接种量3%,30℃,200r /min ,旋转摇床培养,16h 后加0.5mm ol/L IPTG 诱导,继续培养6h 后收集菌体.1.2.2　超声波破碎细胞离心收集菌体,10mmo l /L T ris -HCl (pH =7.5)缓冲液洗涤离心,菌体重悬,超声破碎10m in (工作2s 间歇3s),保持菌液始终处于低温(0～4℃).破碎后在8000r /min 下冷冻离心10m in,所得上清液即为粗酶液.1.2.3　渗透休克发酵液离心去上清液,菌体洗涤后重悬于同体积高渗液中,室温放置一定时间,4℃离心10min ,取离心后的菌体迅速悬浮于预冷的同体积的50mm ol/L PBS (pH 7.5)中,冰浴15m in.溶液经10000r/m in,10min 离心后,分别取上清液和菌体(超声后使用)进行SDS-PAGE 检测和PGA 酶活测定.1.2.4　酶的最适作用pH 及pH 稳定性分别配制pH 值为4～11的50mmo l /L 缓冲液,包括醋酸盐(pH 4,5),磷酸盐(pH 6,7,8),硼酸盐(pH 9,10,11)缓冲液.青霉素G 钾盐用不同pH 的缓冲液配制成质量分数4%的溶液,在37℃进行酶促反应.用上述缓冲液稀释酶液,在37℃保温24h 后于标准条件检测酶活.1.2.5　酶的最适作用温度及稳定性在相同的pH 缓冲液条件下(pH 7.5),分别在20,30,40,50,60,70℃与质量分数4%的青霉素G 钾盐溶液进行酶促反应.酶液分别在20,30,40,50,60,70℃保温2h 后,在37℃与质量分数为4%的青霉素G 钾盐溶液进行酶促反应,检测酶活.1.3　测定方法1.3.1　蛋白含量测定Low ry 法.牛血清蛋白作为标准分子质量蛋白.1.3.2　SDS-PAGE 检测参照《蛋白质技术手册》[9],采用体积分数15%的电泳凝胶,上样量10 L .考马斯亮蓝R -250染色,凝胶成相分析软件扫描并分析蛋白含量.1.3.3　青霉素G 酰化酶活力的测定(PDAB 法)测定原理是青霉素G 酰化酶在37℃裂解青霉素G 产生6-APA,后者在酸性条件下与PDAB 形成西夫碱,在415nm 下有最大吸收[10].酶活定义为:在pH 7.5,37℃条件下每m in 催化青霉素G 产生1 mol /L 的6-APA 所需的酶量为1个单位(U ).根据以下公式计算酶活:73　第5期 蒋咏梅等:渗透休克法提取重组青霉素G 酰化酶及酶学性质研究酶活=(OD 415-0.02031)×V 反应0.11345×t 反应×V (酶).2　结果与讨论2.1　渗透休克法提取青霉素G 酰化酶条件的优化由于大肠杆菌产生的青霉素G 酰化酶主要定位于周质空间,采用渗透休克法不仅简便易行,还能选择性释放目标蛋白,因此优化了渗透休克法提取PGA 的条件.2.1.1　高渗处理时间实验将发酵结束的菌体悬浮于高渗溶液(质量分数为20%的蔗糖)中,分别静置不同时间,检测低渗液中的PGA 纯度和回收率.结果表明(图1),高渗处理30m in 可得到较好的纯度和收率,后续的条件优化以此为基础.2.1.2　蔗糖质量分数实验渗透休克的操作中,高渗液的质量分数很关键.分别采用不同质量分数的蔗糖进行实验.同时添加10mm ol/L 的EDTA 增加细胞膜的通透作用.由图2可见,随着蔗糖质量分数的增加,胞外的PGA 活力也显著增加,相应地,胞内酶活也随之减少.可见蔗糖质量分数增加导致细胞膜的渗透性增强.蔗糖的质量分数为30%时,85.0%的PGA 渗透出胞外.质量分数增加至40%,PGA 的回收率可达92.7%.图1　高渗时间对PGA 纯化的影响图2　蔗糖质量分数对渗透休克的影响渗透休克得到的主要是周质空间蛋白,由于PGA 定位于此,正如图3所示,杂蛋白较少,且胞外PGA 的2个亚基条带的强度随蔗糖质量分数的增加而增强,这与酶活测定结果相符.对该SDS-PAGE 中的蛋白条带进行纯度扫描(图4),发现蔗糖质量分数为10%时,PGA 在渗出液中所占比例最高,为79.4%.高渗液中蔗糖质量分数增加则导致回收的PGA 纯度下降.当蔗糖质量分数为40%,回收率达92.0%时,PGA 的含量已降至43.2%.增加蔗糖质量分数虽然可以提高回收率,但却以纯度的下降为代价.从实验的角度,选择蔗糖质量分数为30%继续后面的研究,此时的回收率和纯度分别为85.0%和61.5%.泳道1-5:表示渗透液的蛋白条带;泳道1’-5’:表示胞内的蛋白条带;泳道1、(1'),2、(2'),3、(3’),4、(4’),5、(5’):分别表示蔗糖质量分数为0,10%,20%,30%,40%时的蛋白条带图3　采用不同蔗糖质量分数对PGA渗透休克的SDS -PAGE 分析图4　蔗糖质量分数对PGA 纯度的影响　　74福建师范大学学报(自然科学版) 2010年　图5　EDTA 浓度对渗透休克的影响2.1.3　EDTA 浓度实验渗透休克中,通常添加EDT A 螯和细胞壁上的M g 2+,从而使其释放脂多糖(LPS ),导致细胞外膜渗透性增强.本实验在高渗溶液中分别添加不同浓度的EDT A,配合质量分数为30%的蔗糖,考察ED-TA 浓度对PGA 释放的影响.如图5所示,在本实验条件下,即使完全不加EDT A,渗透率已达到72.0%,而不加蔗糖时渗透率几乎为0(图3),这说明渗透休克中起关键作用的是蔗糖产生的高渗环境,EDT A 只起辅助作用.但ED-泳道1-5:表示渗透液的蛋白条带;泳道1'-5’:表示胞内的蛋白条带;泳道1、(1’),2、(2’),3、(3’),4、(4’),5、(5’):分别表示EDTA 浓度为0,1,10,50,100mmol/L 时的蛋白条带图6　采用不同EDTA 浓度对PGA 渗透休克的SDS -PAGE 分析TA 对渗透效果仍有一定影响.1m mol/L 的EDT A 可以使渗透率提高10%以上,随EDT A浓度增加,渗透率也逐步增大.当EDT A 浓度增至100mmo l /L 时,有92.4%的PGA 渗出细胞.对比前后2个实验,发现蔗糖的少量不足可通过增加EDT A 的浓度来弥补.图6为不同EDTA 浓度对PGA 渗透效果的SDS-PAGE 分析,胞外PGA 含量随EDT A浓度增加而增大,这与酶活测定结果相一致.对蛋白条带的PGA 纯度扫描结果(图7)显示,随着EDT A 浓度增加,胞内PGA 纯度随之下降,说明更多的PGA 从胞内释放出来.但ED-TA 在增加细胞透性的同时,导致部分细胞裂1-5:分别表示EDTA 浓度为0,1,10,50,100m mol /L 图7　EDTA 浓度对PGA 纯度的影响解,因此PGA 的纯度下降.经上述条件优化,采用渗透休克法提取重组大肠杆菌周质空间的青霉素G 酰化酶,酶的纯度为80%,回收率92.4%,纯化倍数3.22(表1).可见,与传统超声结合柱层析的方法相比,该法可更方便、快捷地得到周质空间的产品.2.2　青霉素G 酰化酶的酶学性质研究2.2.1　最适作用pH 及其pH 稳定性以上述实验得到的低渗上清液进行酶学性质研究.在一系列pH 值的缓冲液中分别测定酶活,以所得最高酶活为100%作图(图8),发现该酶在pH 5.0～9.0之间酶活较高,超出该范围,活力明显下降.酶液在不同pH 缓冲液中37℃保温24h ,接着在标准条件下检测其残余活力,发现该酶在pH 5.0～8.0的范围内比较稳定,酶活可达80%以上.与最适作用pH 的研究结果相似,都在偏碱性条件下有个急剧的酶活下降过程.表1　渗透休克提取青霉素G 酰化酶的效果总酶活/Um (总蛋白)/mg 比酶活/(U ・mg -1)回收率/%纯化倍数全菌超声破碎液3120638008.2100-渗透休克法28834109126.492.4 3.222.2.2　最适作用温度及其热稳定性在相同的pH 缓冲液条件下(pH 7.5),分别在不同温度测定粗酶液的活性.如图9所示,PGA 的酶活受温度影响很大,最适作用温度为50℃,过高过低都不利于酶促反应的进行.KcPGA 的热稳定性不高,40℃保温2h 后酶活损失4%,50℃保温后酶活仅残余20%.75　第5期 蒋咏梅等:渗透休克法提取重组青霉素G 酰化酶及酶学性质研究图8　pH 对PGA 活性和稳定性的影响图9　温度对PGA 活性和稳定性的影响3　结论由于大肠杆菌的遗传背景清晰,常利用它来表达重组蛋白.根据目的产物分布的位置不同,采用合适的分离方法,可收到事半功倍的效果.本文对重组大肠杆菌BL21(DE3)[PET 24(+)]产生的来源于克鲁沃尔氏菌属(K luy ver a citrop hila )的青霉素G 酰化酶进行了一步纯化的研究.利用渗透休克法提取定位于周质空间的KcPGA ,通过高渗液处理时间及蔗糖和EDT A 浓度的调整,回收率92.4%的PGA 释放到胞外,且纯度达80%,可得到26.4U /m g 的比酶活,纯化倍数为3.22.此外,对PGA 的酶学性质进行了初步研究,发现KcPGA 的最适作用pH 和温度分别为pH 7～9和50℃,在pH 5.0～8.0和低于40℃的范围内比较稳定.参考文献:[1]Sakaguchi K ,M ur ao S .A preliminar y repor t o n a new enzyme “penicillin amidase ”[J ].Jo ur nal of A g riculturaland Chemical Societ y,1950,23:411-418.[2]Br ugg ink A ,Roo s E C ,de V ro om E .Penicillin acylase in the industr ial pr oduction o f -lactam antibio tics [J ].Or ganic P ro cess Resear ch and Dev elo pment ,1998,2:128-133.[3]Sanchez J,V er do ni N ,Fitton V ,et al.Efficient tw o -step chr omato gr aphic pur ification o f penicillin acylase fro mclar ified Escher ichia coli ult raso nic ho mog enat e [J ].Jour nal o f Chr omato gr aphic B Biomedical Science A pplicatio n ,2001,753(1):45-50.[4]F uent es M ,Bata lla P,G razu V ,et al.M ix ed ion exchange suppo rts as useful io n ex chang er s fo r pro tein purifica-t ion :pur ification of penicillin G acylase fr om Escher ichia coli [J ].Bio macro molecules ,2007,8(2):703-707.[5]A guilar O ,A lbit er V ,Serr ano -Carr eon,et al.Dir ect compar ison betw een ion-ex chang e chr omato g raphy andaqueo us tw o -phase pro cesses fo r the par tial pur ifica tio n of penicillin acylase pr oduced by E .coli [J].J Chr omato gr B A nalyt T echnol Biom ed L ife Sci ,2006,835(1/2):77-83.[6]N eu H C,Heppel L A.T he r elease o f enzymes fr om Escher ichia coli by osmo tic sho ck and during the for mation ofspher oplasts [J].J Biol Chem,1965(240):3685-3692.[7]Chen Y u -Cheng ,Chen L i -An ,Chen Shu -Jen .A mo dified osmo tic shock fo r per ipla smic release o f a r ecombinantcr eatinase fr om Escher ichia coli [J].Bio chemica l Engineer ing Jo urnal,2004,19:211-215.[8]Ham bleto n P ,Bennet t A M ,L eaver G,et al.Bio safety mo nitor ing devices for biot echnolog y pro cesses [J].T r endsin Biotechnolog y ,1992,10(6):192-199.[9]汪家政,范明.蛋白质技术手册[M ].北京:科学出版社,2002.[10]Ko rnfeld J M.A new co lo rimetr ic metho d for the deter minatio n o f 6-aminopenicillanic acid [J].A nalyticalBiochemistr y ,1978,86:118-126.(责任编辑:余　望)76福建师范大学学报(自然科学版) 2010年　。

青霉素G酰化酶产生菌发酵条件研究青霉素G酰化酶产生菌发酵条件研究摘要：青霉素G酰化酶是合成半合成青霉素的关键酶，其产生菌的发酵条件对于青霉素生产的效率和产量具有重要影响。

本研究旨在探究影响青霉素G酰化酶产生菌发酵的关键因素，并通过优化发酵条件，提高酶的产量和稳定性。

引言青霉素是一种广泛应用于临床治疗的重要抗生素，其核心结构由青霉素G酰化酶催化青霉素G的酰化反应合成。

青霉素G酰化酶的产量和酶活性直接影响着半合成青霉素的生成量和质量，因此研究青霉素G酰化酶产生菌的发酵条件对于提高生产效率至关重要。

方法和结果1. 菌株的筛选和培养基优化：在实验室内筛选了多个潜在的青霉素G酰化酶产生菌株，并采用试管内培养进行初步筛选。

经过多次筛选和评价后，确定了最优菌株。

2. 发酵条件的优化：通过单因素实验和正交试验，对发酵条件进行全面优化。

经实验测定，最佳发酵温度为30℃，最佳pH为7.5，最佳发酵时间为72小时，最佳搅拌速度为150rpm。

3. 发酵介质的优化：通过改变发酵介质的碳源、氮源和无机盐的组成和浓度，进行多次试验优化。

经实验测定，最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母提取物，最佳无机盐浓度为2.0 g/L。

4. 辅助因素的优化：通过添加适量的表面活性剂和辅酶Q10，进一步提高青霉素G酰化酶的产量和稳定性。

讨论通过对发酵条件的优化，本研究成功提高了青霉素G酰化酶的产量和稳定性。

最佳发酵条件为温度30℃，pH 7.5，发酵时间72小时，搅拌速度150rpm。

最佳发酵介质为含葡萄糖、酵母提取物和2.0 g/L无机盐的培养基。

辅助因素的添加进一步提高了酶的产量和稳定性。

结论本研究对青霉素G酰化酶产生菌的发酵条件进行了研究和优化，为青霉素生产提供了重要的理论基础和实验指导。

通过优化生产条件，有效提高了青霉素G酰化酶的产量和质量，为青霉素药物的生产提供了有力支持。

通过对青霉素G酰化酶产生菌的发酵条件进行优化，本研究成功提高了酶的产量和稳定性。

青霉素酰化酶的固定化与应用新进展在如今医疗体系发展的过程中，青霉素酰化酶已经被广泛的使用到了抗生素制备体系中，以及一些多肽合成体系中。

高效的青霉素酰化酶使用，能够最大限度的提升酶本身在PH值、溶剂极性、温度等各个方面适用效果大幅度提高，这实际上已经成为了青霉素酰化酶在如今工业体系中应用的关键。

本篇文章着重针对青霉素酰化酶的固定化以及应用进展进行了全面详细的探讨。

标签：青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用青霉素酰化酶本身在实际使用的过程中，呈现出了良好的溶剂记性使用想以及反复使用的多方面稳定效果，由于这一特性的存在，使得青霉素酰化酶已经成为了工业体系的关键梭子啊。

下文主要是从载体选择固化以及应用的进展上来进行了全面详细的探讨。

1、载体形式1. 1有机高分子载体有机载体本身在实际使用的过程中，实际上具备了极为优秀的机械性强度，同时也完全可以通过产业化形式进行生产，天然性质的高分子载体在实际运行的过程过程中，表现出了极为优秀的传质性能、无毒性，被广泛使用到了壳聚糖、甲壳素之中。

由于其本身呈现出的有机分子有着较高的强度，但是在传质性能较差的情况下，例如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等一列的物质。

而从相关的研究结果来看，在针对高密度环氧结构体系下的载体固定，使用青霉素酰化酶执行了相应的处理之后又，催化活力所表现出的相关游离酶在这一过程中大幅度的提高，并且呈现出的重复使用稳定性也极强。

1.2无机分子载体在如今材料学持续发展的过程中，已经涌现出了孔分子筛形式的载体，其本身能够有效的对于高稳定的固化酶进行制备处理。

在使用了无机载体执行表面修饰以及酶固定的相关措施之后，其本身所表现出的相关性能实际上必然能够有较大幅度的提升。

某小组在进行课题研究的过程中，曾直接使用表面氨基形式的介孔二氧化硅材料，来针对青霉素酰化酶加以固定处理，其中呈现出的活力实际上直接达到了90%及以上，特别是在循环使用10次的催化处理之后，其中所表现出的活力实际上依然是维持在94%的水平上。

青霉素酰化酶的研究进展
李宁;宗敏华;彭华松;娄文勇
【期刊名称】《生命的化学》
【年(卷),期】2002(22)4
【摘要】青霉素酰化酶(penicillin acylase)是合成半合成青霉素的重要酶。

近年来,对该酶的结构、分离纯化方法、稳定性、固定化及介质工程等方面进行了大量的研究。

本文综述了以上研究的进展。

【总页数】3页(P301-303)
【关键词】青霉素酰化酶;研究进展;固定化;介质工程;疏质子溶剂
【作者】李宁;宗敏华;彭华松;娄文勇
【作者单位】华南理工大学生物工程系
【正文语种】中文
【中图分类】Q55;TQ465.1
【相关文献】
1.固定化青霉素G酰化酶活性的X射线微分析Ⅱ:青霉素G酰化酶活性的定位 [J], 姚子华;黄永章;仇满德
2.青霉素酰化酶促合成β-内酰胺抗生素的过程优化研究进展 [J], 张业旺;刘瑞江;闻崇炜;徐希明
3.青霉素G酰化酶的固定化研究进展 [J], 高磊章;金利群
4.脂肪酶和青霉素酰化酶催化合成手性化合物的研究进展 [J], 薛屏;曹雪荣
5.离子液体提高青霉素G酰化酶催化活性作用机制研究进展 [J], 郑昭玉;薛屏
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青霉素G酰化酶工程菌培养条件的研究任立华【摘要】以产生青霉素G酰化酶的工程菌株LRN075为研究对象,通过正交试验优化了培养条件,研究了不同比例的培养基成分对酶产量的影响.结果显示在最优条件下,进行了2000L发酵罐的发酵试验,该菌株在培养36h酶活最高达到2.28×104U·L-1.细胞破碎实验表明,高压均质法效果最佳,可以使酶达到最大程度的释放.【期刊名称】《药学研究》【年(卷),期】2010(029)011【总页数】4页(P651-654)【关键词】青霉素酰化酶;大肠杆菌;发酵【作者】任立华【作者单位】鲁南制药集团股份有限公司,山东,临沂,276006【正文语种】中文【中图分类】TQ460.38青霉素G酰化酶(酰基转移酶)是用于抗生素中间体6 -氨基头孢烷酸(6-APA)和7-氨基脱乙酰头孢烷酸(7-ADCA)生产的重要酶制剂,目前已经在工业中得到了广泛的应用[1,2].很多微生物,包括细菌、放线菌、真菌均可以产生青霉素酰化酶,目前应用最多的是大肠杆菌和巨大芽孢杆菌生产的青霉素酰化酶[3].在7-ADCA的生产中主要使用了大肠杆菌表达的酶,然后将其固定化,用于催化头孢菌素 G水解生成7-ADCA[4].本实验中应用基因工程手段筛选到一株大肠杆菌LRN075,经检测酶活性比原菌株提高了5倍多,在2000L发酵罐中进行中试培养研究,平均酶活为:2.06×104U·L-1.所得菌体经高压均质,对均质液中的青霉素酰化酶进行了分离纯化,酶比活力达到31.68U·mg-1,活性为63.68U· mL-1.1 材料与方法1.1 材料和仪器蔗糖(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);胰蛋白胨(生化试剂,OXOID);酵母提取物(生化试剂,安琪酵母股份有限公司);氯化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);琼脂粉(生化试剂,北京惠泽奥公司);硫酸铵(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);磷酸二氢钾(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);七水合硫酸镁(分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司);葡萄糖(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);氢氧化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);2000L发酵系统(上海高机生物工程有限公司);FUMA QYC-211摇床(上海福玛实验设备有限公司);DEL TA320酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司); LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司);SBA-4多功能谷氨酸-葡萄糖分析仪(山东省科学院生物研究所).1.2 菌株和培养基1.2.1 菌株:大肠杆菌LRN075(Escherichia coli LRN075),鲁南制药集团股份有限公司保存.1.2.2 斜面培养基(g·L-1):葡萄糖5g,酵母提取物10g,胰蛋白胨20g,NaCl 3g,琼脂15g,p H6.9～7.1,去离子水定容,0.11MPa湿热灭菌30min.1.2.3 摇瓶和一级种子培养基(g·L-1):蔗糖15g,酵母提取物20g,磷酸二氢钾5g,七水合硫酸镁0.5g,碳酸钙0.1g,去离子水定容,p H6.9～7.1,0.11MPa湿热灭菌30min.1.2.4 二级种子培养基(g·L-1):蔗糖10g,酵母提取物10g,磷酸二氢钾5g,七水合硫酸镁0.5g,氢氧化钠0.2g,碳酸钙0.1g,p H6.9～7.1,去离子水定容,0.11MPa湿热灭菌30min.1.2.5 发酵培养基(g·L-1):葡萄糖5g,蔗糖15g,胰蛋白胨30g,磷酸二氢钾10g,七水合硫酸镁0.5g,碳酸钙 0.1g,去离子水定容,p H6.9～7.1,0.11MPa湿热灭菌30min.1.3 培养方法1.3.1 摇瓶发酵方法:将甘油管大肠杆菌LRN075接入试管斜面培养基30℃培养48h后,挑取斜面单菌落接种于种子培养基(250mL三角瓶装液40mL),30℃、摇床转速200r· min-1培养16h,按10%接种于发酵培养基(500mL三角瓶装液50mL),28℃、200r·min-1振荡培养28h.培养完毕后,菌液在4℃,4000r·min-1离心收集菌体用于酶活测定.1.3.2 2m3罐发酵试验:发酵采用250mL摇瓶制备摇瓶种子(250mL三角瓶装液40mL),制备3个摇瓶种子,121℃灭菌30min,从斜面挑取单菌落接种后30℃培养16h,然后按1%接种量接种于20L一级种子罐(装液量12L),30℃、180r· min-1培养8h后按10%接种量转接于200L二级种子罐(装液量120L),30℃、120r·min-1培养12h后转接于2000L发酵罐(装液量1500L,按发酵培养基配方投料,121℃灭菌30min后备用),28℃,150～200r·min-1培养36h后放罐.1.4 分析方法酶活测定方法.1.4.1 发酵、摇瓶菌体活力测定:取5mL发酵液于已知重量的离心管中,10000r·min-1离心5min,弃上清,用滤纸吸干离心管内残余液体,称量并计算湿菌体重量,再向离心管中加入4mL 0.87%的生理盐水,搅拌均匀后,倒入25mL烧杯中,取10mL预热到37℃的底物溶液加入烧杯中,恒温37℃并搅拌,用0.1mol·L-1的NaOH溶液调p H至7.8左右计时,保持p H反应3～5min,记录消耗的碱量. 1.4.2 酶液和固定化酶活力测定:准确量取一定体积的酶液(或称量一定重量的固定化酶),加入25mL烧杯中,取10mL预热到37℃的底物溶液迅速加入至烧杯中,恒温37℃搅拌,用0.1mol·L-1的NaOH溶液调p H至7.8左右计时,保持p H反应3～5min,记录消耗的碱量.酶活力的计算:酶活力单位:单位酶量每分钟消耗1μmol NaOH为一个单位(U).2 试验结果2.1 发酵培养基配方的优化初步的研究发现,发酵培养基配方中葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨、磷酸二氢钾对菌体细胞的酶活影响比较大,因此设计了L9(34)正交试验,因素和水平选择如下:表1 因素水平表因素水平A B C D葡萄糖蔗糖胰蛋白胨磷酸二氢钾1 5 10 20 5 2 7.5 15 25 10 3 10 20 30 15表2 实验方案L9(34)正交表11 1 1 1 1.89 21 2 2 2 2.21 31 3 3 3 2.11 42 1 2 3 1.82 52 2 3 1 2.16 62 3 1 2 2.01 73 1 3 2 2.10 83 2 1 3 1.93 93 3 2 1 2.05 K1 6.21 5.91 5.83 5.98 ∑Yi=18.28 K2 6.00 6.21 6.15 6.32 ¯Y=2.031 K3 6.05 6.14 6.28 5.96￣K1 2.07 1.97 1.9433 1.9933 ∑Y2i=37.2638￣K2 2.00 2.07 2.05 2.1067 ST=∑Y2i-C=0.135089￣K3 2.0167 2.0467 2.0933 1.9867 R 0.07 0.10 0.15 0.12 A1B2C3D2 S 0.008 0.0164 0.0358 0.0273正交试验综合结果表明,最佳组合为A1B2C3D2.正交试验综合结果的方差分析:以S最小者作为误差(Sb),计算F.计算结果列于表3. 根据方差分析,C因素有极显著影响,B和D因素有显著影响.综合分析结果表明,所得到的最佳结果为:葡萄糖5g· L-1,蔗糖15g·L-1,胰蛋白胨30g·L-1,磷酸二氢钾10g· L-1.表3 方差分析表注:＊表示显著性,F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00方差来源偏差平方和自由度均方 Fee 显著性B 0.0164 2 0.0082 2.05 ＊0.0358 2 0.0179 4.475 ＊＊D 0.0273 2 0.0136 3.4 ＊误差 0.008 2 0.004 C2.2 培养温度对酶活的影响工程菌在不同的培养温度下生长状态不同,而且酶的活性对温度变化比较敏感,青霉素G酰化酶的表达量和比活也随着温度的不同而变化,在不同温度条件下对菌株进行培养,测定培养后的细胞酶活,结果如图1所示:图1 不同温度对酶活的影响由图可以看出,在优化后的培养条件下,当菌株的培养温度在30℃时,收获细胞的酶活达到最高:2.28×104U· L-1.2.3 不同破壁方式对酶活的影响青霉素 G酰化酶在7-ADCA转化当中,为提高酶的稳定性、酶对p H值和温度的适应性,以及提高酶的反复使用性,均将细胞破壁后将酶释放出来,然后将其固定化用于酶促反应.破壁方式在很大程度上影响着固定化酶的活性,在本实验中采用溶菌酶法、超声波法、高压均质法和反复冻融法对细胞进行破壁,促进酶的释放,破壁后的悬液在8℃下、8000r·min-1离心,上清用于酶活测定,结果如图2所示.图2 破壁方式对酶活的影响结果表明,几种破壁方式均可以使酶活有不同程度的提高,其中高压均质法可以使酶活提高80%以上,而且高压均质法具有易操作、处理量大、时间短、酶活损失少等优点,是目前主要采用的破壁方式.2.4 2000L发酵罐的培养及酶液收集实验按照优化好的培养基配方配制1.5吨发酵培养基,装入发酵罐,灭菌后按照1.3.2的方法进行发酵,发酵过程采用p H全程自控7.0,通过调节转速和通气量维持溶氧30%以上,培养7.5h后开始流加补料(补料成分:100g·L-1蔗糖,45g·L-1胰蛋白胨,p H7.0,121℃灭菌20min后使用),期间测定残糖,维持还原糖浓度1.2g·L-1左右,36h后停止发酵(菌浓度和酶活性曲线如图3).陶瓷膜收集菌体,用20mmol·L-1磷酸缓冲液(p H7.0)150L悬浮后在50MPa高压均质2～3次,然后保持恒温,陶瓷膜收集上清,浓缩,得到料液103L,测得酶活性为63.38U·mL-1,总酶活6.53×106U.该料液可作为原料酶用于固定化酶的生产.3 讨论大肠杆菌青霉素酰化酶催化制备7-ADCA目前已经在工业中得到了广泛的应用,在传统抗生素的改造中作出了巨大的贡献.工业生产中要求酶有高的催化效率、低的生产成本,而菌种培养条件的优化和高产菌株的选育成为实现以上目标的重要手段.在本实验中构建了高产青霉素酰化酶的大肠杆菌LRN075菌株,并对该菌株进行了培养条件的研究,培养基配方为葡萄糖5g·L-1,蔗糖15g·L-1,胰蛋白胨30g·L-1,磷酸二氢钾10g·L-1,培养温度30℃,收获细胞的酶活达到较高水平:2.28×104U·L-1. 研究过程中考察了菌株在培养过程中不同时间的酶活情况,发现摇瓶培养在 28h达到酶活高峰1.10×104U· L-1,而在发酵罐中 36h才达到酶活高峰2.28×104U· L-1,其原因可能是发酵罐中补料造成了菌体生长对数期的延长,因此酶活高峰也相应延迟,同时研究发现发酵罐中发酵结束时的酶活是摇瓶中的两倍左右.为了降低成本、保证酶的多次重复使用,需将酶固定于固相载体而便于回收[5].而青霉素酰化酶为胞内酶,在固定之前需将其从细胞内释放出来,本实验采用了四种方式进行了细胞破壁,虽然这几种方式使得酶活均有不同程度的提高,但是高压均质法由于设备简单易得、处理量大,而使得工序时间短,酶活损失少,被我们选择使用.在优化工艺的基础上,我们成功进行了2000L发酵罐的培养.目前已经正常生产四十余批,且无一次染菌.生产的发酵液经后续各步骤处理,已成功用于本公司7-ADCA 的生产.在随后的研究中,将进一步探讨青霉素酰化酶的纯化和固定化载体条件的选择和固定化方法.参考文献[1]崔鹏,万敏.青霉素酰化酶的生产与应用新进展[J].化学工业与工程技术,2005,26(6):42～45.[2]Parmar A,Kumar H,Marwaha SS.et.al.Advances in enzymatic transformation of penicillins to 6-aminopenieillanic acid(6-APA)[J].Biotechnol Adv.,2000,18(4):289～301.[3]Kalleaberg AI,Rantwijk F,SheldonR A.Immobilization of penicillin G acylase:The key to optimum performance[J] .Adv.Synth.Catal.,2005,347(7～8):905～926.[4]Dengchao Li,Shiwei Cheng,Dongzhi Wei,et al.Production of enantiomerically pure(S)-β-phenylalanineand(R)-β-phenylalanine by penicillin G acylase fromEscherichia coliin aqueousmedium[J].Biotechnology Letters,2007,29(12):1825～1830.[5]H.Fazelinia,A.Kheirolomoom.Immobilization of penicillin G acylase on non-porous ultrafine silica particles[J].Scientia Iranica,2005,12(3):295～299.。