大鼠肺成纤维细胞的体外培养及急性炎症模型的建立

大鼠皮肤成纤维细胞分离培养方法的研究作者：冯颖来源：《吉林农业》2014年第12期摘要：目的：对大鼠皮肤成纤维细胞进行分离培养并观察形态。

方法：组织块培养法分离大鼠成纤维细胞并进行传代培养并通过细胞形态学观察和HE染色对其细胞进行鉴定。

结果体外培养的成纤维细胞呈梭形或多角形，24小时贴壁，通过HE染色，细胞核被染成蓝紫色，胞浆被染成粉红色。

结论：该方法成功培养了大鼠背部皮肤的成纤维细胞，所获得的大鼠背部皮肤成纤维细胞可在体外稳定培养，为一些组织来源较少的成纤维细胞培养提供一种有效且可行的实验方法。

关键词：大鼠；成纤维细胞；体外培养中图分类号： R329.2 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/ki.jlny.2014.23.0019成纤维细胞是真皮组织的主要组成成分，在构建人工皮肤和组织创伤修复中发挥着重要作用，对成纤维细胞的培养研究已经为细胞水平上研究伤口愈合的机制提供了有力工具[1]。

本文旨在探索组织块培养法进行大鼠成纤维细胞分离和体外培养。

1 材料与方法1.1 材料、仪器及试剂新出生SD大鼠、超净工作台、超低温冰箱、CO2培养箱、眼科剪、培养瓶、离心管、尼龙纱网、乙醇、PBS溶液、新生牛血清、DMEM培养液、中性蛋白酶、胰蛋白酶、血球计数板。

1.2 实验方法1.2.1 成纤维细胞的分离与培养取新出生的SD大鼠，断颈处死，在75%乙醇中浸泡3～5分钟。

在无菌条件下，剪取大乳鼠背部皮肤。

去除皮下组织，PBS溶液反复漂洗后，将组织块剪切成约1立方毫米的小块，0.25%中性蛋白酶在4℃处理12～16小时，去除表皮，将剩余的真皮组织以0.3～0.5毫米间距接种于培养瓶内壁，加入少量DMEM培养液，置入5% CO2，37℃的CO2培养箱中培养24小时，待组织块吸附牢固后，次日补加培养液至正常体积，三天后换液。

当成纤维细胞汇合成片，占培养瓶底面的80%左右时，加入PBS溶液洗涤2次，加入少量0.25%胰蛋白酶覆盖瓶底，消化3～5分钟，当细胞间隙变大，胞质回缩时，加入含有小牛血清的培养基终止消化，由上至下，由左至右吹打瓶壁，细胞脱落后，以1200转/分钟离心5分钟，弃上清加入10%小牛血清的DMEM培养基重悬，台盼蓝染色进行细胞计数，按照8×104密度接种培养。

放射性肺纤维化大鼠动物模型1.造模材料动物：健康雌性Wistar大鼠，实验等级为二级，体重(220±20)g；器械：60Coγ射线发生器。

2.造模方法用60Coγ射线进行全胸照射，其中照射野面积为4.5cm×4.0cm。

将大鼠上至两腋窝、下至胸骨剑状突的位置对准此照射野，用10cm厚铅砖屏散装置屏蔽大鼠其余部分。

照距为3m，剂量率为2.7Gy/min，剂量为30Gy。

3.造模原理60Coγ射线导致动物肺纤维化。

4.造模后一般变化用60Coγ射线对Wistar成年雌性大鼠进行30Gy全胸单次照射后，大约在第3周见动物胸背部照射野皮肤开始脱毛，鼻腔出现出血现象。

约1个月左右胸背部照射野皮肤脱毛更加明显，并可在该处皮肤发生湿疹、红斑、糜烂和溃疡，鼻腔出血也更加严重。

3个月后上述症状减轻，但鼻腔出血现象仍不时可见，被毛6个月以后见再生长现象。

上述症状出现的同时，动物发生死亡，死亡从3周后开始可持续到照后3.5个月，但死亡高峰集中在照后1.5～2个月。

合计死亡率为34.98％。

5.造模后病理变化照后3～7天，大鼠肺脏及其他部位未见明显异常。

照后2～3周，见肺脏表面和切面散在点状或斑点状出血。

照射4周之后，见胸腔积少量或多量淡黄色或红黄色液体，肺脏充血、出血、肿胀，切面有大量泡沫样液体流出，肺体积增大、重量增加。

肺重与体重之比也比正常对照动物明显增高，可达3％，最高达4.9％。

照射2个月以后，肺脏的急性炎症性变化逐渐减退，3个月后明显减退，6个月后肺脏可见灰黄色或灰白色的绿豆大到蚕豆大的致密实变区，尤左、右肺上叶表现明显。

光镜所见：对照组大鼠肺组织学结构正常。

照射组大鼠肺组织学变化初期表现为急性炎症变化，中后期则转变为亚急性或慢性进行性发展变化，可大致分为2个阶段4个期。

早期即急性炎症期或渗出期，该期发生时段主要在照后2个月以内，表现为肺泡壁毛细血管和支气管周围血管充血、肺出血、间质水肿，肺泡腔积液并有红细胞、巨噬细胞、肺泡上皮细胞等聚积。

大鼠体外循环模型肺部炎症反应的研究---——434?._——theLeide~V/lll~OrlandACEI/Dp01),I∞lplli∞insubty~0fisch—at~lliestroke[J].JNeurol,2001,248(9):756.[5]AlheneGF,RichardJ,CcD,eta1.Distributionoi"plasmaa,lgio—t~sinI-convertingenzymelevelsinhealthyZ-*relationshiptoell!tiron—mentalandhormlalpa功Ⅱ[J].JlabClinMed,1991,117(I):33.[6]Cambie,lF,AlheneGF,HerbethB,eta1.Familialre~mblaneeoi"pla8? mangiotemin—convertingerminelevel:theNancystudy[J].AmJHum文章编号:1007—4287(2OO5)O3—0434—03ChinJlabDia印,June,2O06.Vlol9.No~.3Genet,1988,43(5):774.[7]lVldloG,叮|硼E,GeminiF,eta1.blatemal—FetalFlow,veEvents,andPIeec1aⅡla.Roleoi"ACEI/DP0b,nmplIi∞[J].Hyl~r-tension,2003,41(4):932.[8]王庆彬,刘疆,焦丽红,等.子宫一胎盘血管紧张素极其受体[J].生命科学,2OOO,12(5).'224.(收稿日期:20o4—03—28)大鼠体外循环模型肺部炎症反应的研究吕民,张秀和,符韶鹏,姜亦忠,张柏民,孙雪峰(吉林大学中日联谊医院心脏外科,吉林长春130033)摘要:目的在体外循环(cBP)过程中产生的全身炎症反应与术后呼吸功能不全有关,本实验研究p38丝裂原激活蛋白激酶(p38K)与体外循环中肺损伤的内在关系.方法复制大鼠体外循环模型,随机分为2组,实验组和对照组,每组9只.实验组体外循环3o分钟后,开放肺动脉,接呼吸机,3o分钟后取左肺肺组织;对照组只是行胸部正中切口.全身肝素化.检测大鼠肺组织p38MAPX~活性,测定p38MAPK的表达.肺组织的炎症反应通过检测rINF-口,m-1/3和组织学改变来测定.肺水肿通过估计组织中水的百分比来测定.结果大鼠在体外循环后,肺组织充血,水肿,大量炎症细胞浸润,rINF-口,m-113明显增高,p38MAt'K灰度值分析结果显示体外循环后p38MAP~:较对照组明显增高.结论大鼠肺组织p38MAt'K在体外循环缺血再灌注时被激活,表达增多.推测是可能参与术中肺炎症反应的发生发展,导致肺损伤有关.同时为体外循环肺保护提供一个新途径.关键词:p38丝裂原激活蛋白激酶;体外循环;炎症反应;肺损伤;TNF-~t,m-1/3中图分类号:R645.1文献标识码:APnlmnnaryinflammatory'0nseinratmodelofearaiopdmurybypassLUM/n,ZHANGXi,u-he,FUShao-peng,eto1.(China-JapanUnionHospitaloyJilin,伽130033,踟)A】bsact:ObjectiveCardiopulmonarybypass(CBP)producesansystemicirrfl~mmatoryrespo nseassociatedwithpl】l玎枷aIydysfuneton.Thepresentstuayc0n丘Ⅱnsp381Vlitogen-activatedproteinkir~(p38MAt'K)areactivatedduringCPBandpotentiall ycontributetolunginjury.1~Ietlhods"l'neRatmodelofCPBwasusedinthisstudy.Patswerepl aoedoll<=E'B(17,=9)andpo6t-CPBxep~mion.Controlarlimals(17,=9)underwent~temotomyandhe∞only.LJng~amplesweIeedleetedafterl~t-CPBrepeffmion.Activatedforms0fpaSMAl~weIemeasuredbyWesternblot.PulmonaryⅡa0nwas&te~inedbyrIa,IL广l~-,allis蝴.PdI~naryedemawasestin~tedbytissuewaterpercentage.IteA~vatedp38weIeincreased如r30m.m0fCPB8nd30miI10f~t-CPBrepeffmionc0mwitlls(P<0.01).tti~tologiesigns0flun g.mjuryincludedleuk~/teint~trationintlleCPBgroup.'I~-II.m-ll~tllelungandTissueWitherpercentagewasinere~d witllCPB.C0玎dI咖TheIe?suits0fOUrstraydemonstratethatCPBinere.asespulmonaryp38ac.p38NAPKactivationm ayinpartmedia船tl1epId'r~naryjIam叫lyresponseandprovi&apotentialsite0finterventiontopreventpulmonarydyffunetion duetoCPB.Key~rds:p38~gPK;caIdi叩1】1nl0flarybypass;aw~tion;pulmonary.mjury;rIN王1-a;IL-lb(Ch/nJ脚,2005,9:434)细胞外信号向细胞核转导信息时,需要细胞内信号分子的参与,丝裂原激活蛋白激酶级联是炎症过程中细胞内主要的信号转导系统.细胞运用这一系统将细胞外刺激信号传递到细胞核,介导细胞产生炎症反应.哺乳动物细胞NAPK通路主要有:Ras,ERK.JNK/SAPK和p38/HOG三条途径.近年来的研究发现,p38NAPK信号通路参与缺血再灌注损伤…和体外循环炎症反应【2】.1材料1.1实验对象人工饲养SD雌性大鼠27只,体重250～300g,随机分为对照组及实验组.1.2主要试剂主要试剂为P38NAPK原位杂交试中国实验诊断学2005年6月第9卷第3期剂盒,其余均为国产试剂.1.3主要仪器江湾I型微型人工呼吸器,IllT~X型图像分析仪,恒流泵(HL-3型上海沪西仪器厂生产),水浴恒温器.2方法2.1实验分组对照组(9只):单纯行胸部正中切口,全身肝素化,处死后,迅速切取左肺肺组织,置于一70℃冰箱中保存.实验组(9只):体外循环3O分钟后,开放肺动脉,接呼吸机,吸人氧浓度改为100%,呼吸频率为5O次/分钟,停止转流.3O分钟后取左肺肺组织.2.2大鼠体外循环模型9只实验组大鼠(A组)以硫喷妥钠(5mg/kg)经尾静脉注入麻醉后,气管切开,呼吸机控制呼吸,潮气量10mUkg,频率55次/ 分,吸人氧浓度(FiO2)30%,开胸,确保胸膜不破,右心耳注入肝素1000mCkg,肝素化后,游离右颈总动脉,右颈总动脉及右心耳分别插人22,20号穿刺针,分别接CPB管道,并结扎右颈总动脉的远端,管道经恒温器保温38摄氏度.选取大鼠9只(B组),以其肺脏作为氧合器使用,具体过程如下:以相同方法迅速建立麻醉,辅助呼吸,游离右颈总动脉.肝素化后,右颈总动脉放血,收集肝素化血液,加人适量胶体及生理盐水稀释,至HCr25%以备预充管道用.将心肺一同取下, 同时切开右心耳及心尖减压,经右室流出道插管人肺动脉,接A组大鼠静脉CPB引流管,置人血液回收器,收集肺静脉回流血液,回流的血液经恒流泵'——435?-——(HL-3型上海沪西仪器厂生产)以5ml/min泵人实验组大鼠的右颈总动脉,阻断A组大鼠主肺动脉,停A组大鼠呼吸机,B组大鼠肺脏接呼吸器,氧浓度100%,造成大鼠完全体外循环模型.2.3肺的再灌注实验组大鼠在转流3O分钟后,开放肺动脉,接呼吸机,吸人氧浓度为100%,呼吸频率为5O次/分钟,转机平稳后,停止转流.3O分钟后取左肺肺组织,置于一70%冰箱中保存.2.4P38MAPK水平检测按照原位杂交检测试剂盒说明书操作.采用经地高辛标记的针对大鼠MaP~p38的寡核甘酸探针序列5'一GTGTG CCGAGCCAGTCCAAAATCCAGAA TC一3',p38MAPK 的细胞浆着色呈棕黄色.采用图像分析技术测定mRNA的相对含量.2.5细胞因子的检测方法肺组织称重后大约取500mg肺组织置于液氮中快速冷冻到一2o℃,备用.检测时取250mg肺组织溶于1ml冰盐水中,离心10 min,取上清液贮存于一20℃,用酶联免疫法测上清液中的Da和Ⅱ,18水平.2.6肺水肿的测量鼠处死后取右肺组织,测量肺湿重,ll0~C干燥12小时,测量干重,用(肺湿重一干重)/湿重×100表示结果.2.7组织学观察肺组织用4%福尔马林固定一夜,石蜡包埋,切片厚度51Tlln,光学显微镜观察.3结果3.】表1实验结果采用t检验,p38MAPKP<O.05,其余各组均P<O.01 3.2组织学观察结果实验有大量白细胞浸润,和肺泡出血.有广泛的肺部炎症产生.对照组只有轻微反应.3.3原位杂交p38MAPK检测结果肺脏缺血前鼠的肺组织内仅见问质细胞胞浆内轻度着色.缺再灌注30分钟后大鼠肺组织p38MAPKmRNA在血管内皮细胞胞浆内,支气管粘膜上皮及肺泡上皮, 间质细胞多量表达,尤其在血管内皮细胞内为显着. 灰度值分析结果如表1,显示缺血再灌注后大鼠灰度值较对照组明显升高,表明p38MAPKmRNA在缺血再灌注后表达增多.4讨论肺脏是唯一一个接受全部心输出量的器官,因此在心血管手术,尤其在心内直视手术体外循环(CBP)过程中,肺脏受到的刺激最多,特别是经血液传递刺激,肺受损伤的机会最多,肺损伤仍然是目前心血管手术的主要死亡原因之一.心血管手术肺损伤原因归纳如下:1.在体外循环时肺组织缺血缺-———436---——氧,在这一时期造成肺组织损伤;2.机械性损伤.3.外源性刺激,如:血液与外源性管道系统接触引起损伤反应,有补体反应,炎症反应等,也是体外循环中引起肺损伤的主要原因.CBP是一种非生理性的循环方式,血液与异物表面相接触以及由此引发的CBP相关的炎症反应可导致肺血管和实质的病理改变,从而影响术后肺的呼吸功能.内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁上的脂多糖,在体外循环过程中,由于手术操作本身及血流不当,引起肠道粘膜缺血缺氧,导致肠道内细菌内毒素进入血液.内毒素作用于单核巨噬细胞系统,促进多种炎症介质及细胞裂解介质的释放,目前,在体外循环过程中能测到的细胞裂解介质主要有TNF-~t,IL-1,IL-6,IL-8J.TNF-a,Ⅱ,l主要由过敏毒素及内毒素诱导由单核细胞及上皮细胞产生,其作用增强血管粘附分子(IQ.1,E选择素)的表达,能促使中性粒细胞粘附于血管内皮,脱颗粒导致破坏性氧化剂和蛋白酶释放,促使炎症的发生发展,诱导单核细胞产生IL-6L4J.IL-6主要由内皮细胞,肺成纤维细胞及T淋巴细胞,单核细胞产生,IL-6主要诱导因子是TNF-a,IL-1.多数意见认为术后IL-6的升高可能是组织损伤的早期敏感指标.IL-8主要由肺成纤维细胞,Ⅱ型肺泡上皮细胞及肝细胞产生.诱导IL-8产生的主要是a,IL-1.II,-8主要作用是趋化中性粒细胞,使中性粒细胞在内脏血管内聚集. 细胞裂解介质高浓度进入血液循环后,可能非常有害.CBP相关的炎症反应广泛存在,对肺的损伤不可避免.一般是亚临床性损伤,如术后肺顺应性降低,肺泡动脉血氧梯度增大,非通气血流比失调.损伤严重可导致灌注肺综合征,预后差,是引起体外循环术后的患者,特别是先天性心脏病复杂畸形根治术后患者死亡的主要原因J.本实验重点研究肺组织在缺血及再灌注后,肺组织038MAPK的活性变化,进一步探讨体外循环过程中炎症变化过程及肺损伤的机制.MAPK广泛分布在细胞浆中,具有丝氨酸和苏氨酸双重磷酸化作用,是细胞内重要的信号传递者, 参与多种生理功能】.细胞受到刺激后,激活MAP_KKK,再进一步激活MAPKK,然后通过双位点磷酸化调控MAPK活性.其中MAVKp38是MAPK超家族的成员,主要对炎症细胞因子和多种类型的细胞OlinJlabDia,June,20O5.Vld9.No.3应激信号进行转导.p38MAPK在体内广泛分布.038MAPK被激活后,可进入细胞核或其他部位,主要参与应激条件下细胞的免疫调节,炎症反应及细胞凋亡过程】.038MAPK在信号转导过程中在细胞核内通过磷酸化作用激活许多转录因子,调节细胞因子,如TNF-a,IL-1,IL-6,IL-8等基因表达;还能激活细胞内的某些蛋白激酶,进一步磷酸化低分子热休克蛋白HSP27,从而介导细胞骨架的重构,参与细胞应激反应.038途径对许多炎症介质在基因表达过程中起调控作用,反过来炎症介质能激活038MAPK进而作用于038MAPK下游底物,从而在肺内形成一个逐级放大的炎症反应过程.肺部炎症变化过程中,浸润的炎症细胞及肺脏组织细胞之间存在着广泛的信号联系.在肺部炎症中,应激情况下的p38MAPK级联导致许多炎症介质的产生.本实验结果表明,在体外循环过程中,肺再灌注3O分钟时,肺组织血管内皮细胞,肺泡上皮细胞,及间质细胞胞浆内p38MAPK活性增强,表达增多,其结果与同期肺组织a,IL广lp,以及组织学观察结果呈同步变化,推测肺组织血管内皮细胞,肺泡上皮细胞,及间质细胞胞浆内p38MAPK是术中肺炎症变化及肺损伤的原因之一.同时本研究为体外循环肺保护提供一个新途径.作者简介:吕R,(1969一),男,从事心脏外科专业12年,主治医师,硕士学位.参考文献:[1]KoikeN,TakeyoshiI,OhkiS.Effects0faddingP38nfitogm-netiveted protein-kinaz~inhibitortocelsio~solutioninnehearttrnrtsplnntnfion fromnon-henrt-beatingdonor[J].Transplnntation,2O04,77(2):286. [2]ⅪlaIlTA,Bianehic,AxaujoEG.Aetiwfiondpulmonm7nfitogen-neti. vate【lproteinkirmsesaul~sldi0l】nⅧaIybypass[J].JSIⅡgRes, 2003.115(1):56.[3]BIldJ.Irdanmaoryresponsetoca】di0l】nmaIybyp[J].AnnTho- Tacsurg.1993.55:552.[4]wannA,BousheyH,LeeTH,eta1.II~oI1incicd~rue—fivepulr~disease:ProceedingsfromtheTranCeAirw町C~cl--erlce[J].AmJRe印irG-itCareMed,1999,160:S1.[5]胡小琴,主编.心血管麻醉及体外循环[M].北京:人民卫生出版社,1999.357.[6]caJS,scg=R,GravesJD.TheMAPKinasec8scade[J].Re- centhDgHormRes,1995,50:131.[7】urerwoodDC,GriswoldDE.Inhibition0fp38MkirIBse[J].hDgR吲pirRes,2001,31:342.(收稿日期:2004—12—27)。

大鼠肺间质纤维化造模的2种方法比较研究闫莉;谢艳华;杨倩;王四旺;崔嘉辉;吴让鑫【摘要】目的探讨气管和腹腔注射2种给药方式复制特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis ，IPF）大鼠模型的差异。

方法240～260 g雄性SD大鼠24只，按照随机数字表法分为气管对照组（QC组）、气管给药组（Q组）、腹腔对照组（FC组）和腹腔给药组（F组），每组6只。

分别经气管一次性注射生理盐水0.2 mL或博莱霉素（BLM ）5 mg · kg －1· d－1；腹腔注射生理盐水0.2 mL或博莱霉素15 mg · kg －1· d－1，连续10 d。

28 d后处死。

观察每组小鼠生存率、体质量、肺脏外观、病理改变及肺组织羟脯氨酸含量。

结果Q组生存率为66．7％；F组生存率为83．3％，二者比较差异有统计学意义（ P ＜0．05）。

2种方法给药组大鼠体质量均减轻，F组动物体质量在1～7 d内下降，第8天起开始恢复；Q组动物体质量在前15 d内持续下降，第16 d起开始恢复。

2种方法给药组的肺脏外观基本相同，没有显著差别。

病理检查证实，Q组的胶原纤维沉积主要分布在气管周围，而F组的胶原沉积则分布在胸膜和肺间质。

2种方法复制的模型组肺组织羟脯氨酸含量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0．05）；模型组间差异无统计学意义。

结论气管给药与腹腔给药对于复制大鼠IPF无明显差别，但气管给药法更方便、经济和可靠。

%Objective To explorethe similarities and differences between the intratracheal and intraperitoneal injection to prepare idi‐opathic pulmonary fi brosis (IPF) rat model .Methods 24 male SD rats 240‐260 g ,were randomly divided into intratracheal control group (QC group) ,intratracheal administration group (Q group) ,intraperitoneal control group (FC group) and intraperitoneally administered group (F group) ,n=6 .They were treated with a singleintratracheal injection of saline 0 .2 mL or bleomycin (BLM) 5 mg · kg -1 · d-1 ;intraperitoneal injection of saline 0 .2 mL or BLM 15 mg · kg -1 · d-1 ,for 10 days consecutively .All rats were killed at 28 days .The survival rate ,weight ,lung appearance ,pathological changes and lung tissue hydroxyproline content of each group were observed .Results Q group survival rate was 66 .7% ;F group survival rate was 83 .3% .There was a significant differ‐ence (P<0 .05) between the 2 groups .The weight of the rats given BLM was lost after injection ,the weight of F group was les‐soned in the first 7 days and started to recover on the 8th day ;the weight of Q group continuously declined in the first 15 days and began to recover since the 16th day .There was no significant difference between Q group and P group in lung appearance .Fibro‐sis was widely and stablyformed ,mainly around the trachea in the group Q ,however ,the same changes were mainly seen under the pleura and pulmonary interstial space in the rat of group P .Lung tissue hydroxyproline of the 2 models was significantly high‐er than control groups ,the difference was statistically significant (P<0 .05);but there was no difference between the 2 models . Conclusion Intratracheal administration and intraperitoneal administration showed no significant difference for pulmonary fibrosis in rats .【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2016(031)005【总页数】5页(P485-489)【关键词】博莱霉素;肺间质纤维化;造模【作者】闫莉;谢艳华;杨倩;王四旺;崔嘉辉;吴让鑫【作者单位】第四军医大学药学院天然药物学教研室，西安 710032;第四军医大学药学院天然药物学教研室，西安 710032;第四军医大学药学院天然药物学教研室，西安 710032;第四军医大学药学院天然药物学教研室，西安 710032;第四军医大学学员旅，西安 710032;第四军医大学学员旅，西安 710032【正文语种】中文【中图分类】R965肺纤维化是指在不同因素刺激下引起肺部炎症反应，肺泡持续损伤，细胞外基质被反复破坏、修复、重建并过度沉积，最终导致正常肺组织结构改变、功能丧失的一类疾病，是所有间质性肺病的终末结局。

2021年2月第29卷㊀第1期中国实验动物学报ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICAFebruary 2021Vol.29㊀No.1张毅,程晨,苏景超,等.急性肺损伤大鼠模型制备及不同时段肺损伤比较[J].中国实验动物学报,2021,29(1):27-34.Zhang Y,Cheng C,Su JC,et al.Preparation of rat model of acute lung injury and comparison of injury at different periods [J].Acta Lab Anim Sci Sin,2021,29(1):27-34.Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2021.01.004[基金项目]国家自然科学基金项目(81373743),安徽省自然科学基金项目(2008085MH267),安徽中医药大学自然科学基金重点项目(2020zrzd03),安徽省省级大学生创新训练项目(202006170243,202006170475)㊂Funded by National Natural Science Foundation of China(81373743),Project of Natural Science Foundation of Anhui Province(2008085MH267),Key Projects of Natural Science Foundation of Anhui University of Chinese Medicine (2020zrzd03),Innovative Training Program for Provincial College Students in Anhui Province(202006170243,202006170475).[作者简介]张毅(1990 ),男,在读硕士研究生,研究方向:针刺作用机制㊂Email:644689045@ [通信作者]刘自兵(1974 ),男,教授,硕士生导师,博士,研究方向:针刺作用机制㊂Email:zibingliu@急性肺损伤大鼠模型制备及不同时段肺损伤比较张毅1,程晨1,苏景超2,张新芳2,刘心月3,项水英3,4,王彩云1,李尹1,林先刚3,4,刘自兵2,3,4∗(1.安徽中医药大学研究生院,合肥㊀230038;2.安徽中医药大学中西医结合学院,合肥㊀230038;3.安徽中医药大学针灸推拿学院针灸经络研究所,合肥㊀230038;4.针灸基础与技术安徽省重点实验室,合肥㊀230038)㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀通过气管滴注脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建急性肺损伤大鼠模型,观察不同时段肺损伤变化规律㊂方法㊀32只健康SD 大鼠随机分为正常组㊁模型组,正常组8只大鼠,模型组24只大鼠㊂模型组依据LPS 滴注时长不同分为三个亚组:3h 组㊁6h 组和12h 组,每组8只㊂以LPS(2mg /kg)暴露式气管滴注法复制ALI大鼠模型㊂通过大鼠一般状况㊁肺大体观察㊁肺功能检测㊁计算肺湿干重比值㊁支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素-1β(IL-1β)㊁白细胞介素-8(IL-8)㊁肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测和肺组织中丙二醛(MDA)㊁超氧化物歧化酶(SOD)检测㊁苏木素-伊红染色(HE 染色)组织形态学观察,评估不同时段急性肺损伤伤情变化情况㊂结果㊀造模后模型组大鼠存活率为100%㊂大鼠一般状况显示,3h 组与正常组相比,精神处于淡漠状态㊁摄食减少㊁活动明显减少㊁鼻腔处粘液分泌物增多㊁大鼠的呼吸频率加快㊁可闻及哮鸣音㊂肺大体观察显示,3h 组左右肺门处可见肺组织肝样变,左右肺叶上散布出血点,出血部位颜色鲜红㊂肺功能显示3h 组大鼠第0.1秒用力呼气量(FEV 0.1)㊁第0.3秒用力呼气量(FEV 0.3)以及各占用力肺活量(FVC)之比(FEV0.1/FVC;FEV0.3/FVC)均显著下降(P <0.05,P <0.01);肺湿干重比值明显升高(P <0.01);BALF 中IL-1β㊁IL-8㊁TNF-α含量明显升高(P <0.01),MDA 含量显著升高(P <0.01),SOD 含量显著降低(P <0.01);HE 染色可见明显肺泡间隔增厚㊁肺间质水肿㊁红细胞渗出㊂结论㊀暴露式气管滴注LPS 法,可以引起大鼠肺功能显著下降㊁剧烈的肺部炎症㊁氧化-抗氧化失衡及严重肺水肿和肺出血,导致急性肺损伤,在3h 时段更有利于ALI 大鼠模型的构建㊂ʌ关键词ɔ㊀急性肺损伤;模型;气管滴注法;脂多糖ʌ中图分类号ɔQ95-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1005-4847(2021)01-0027-08Preparation of rat model of acute lung injury and comparison ofinjury at different periodsZHANG Yi 1,CHENG Chen 1,SU Jingchao 2,ZHANG Xinfang 2,LIU Xinyue 3,XIANG Shuiying 3,4,WANG Caiyun 1,LI Yin 1,LIN Xiangang 3,4,LIU Zibing 2,3,4∗(1.Graduate School,Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230038,China.2.College of Integrated Chinese andWestern Medicine,Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230038.3.Institute of Acu-Moxibustion and Meridian in College of Acupuncture and Tuina,Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230038.4.Key Laboratory of Basic andTechnical Acupuncture and Moxibustion in Anhui Province,Hefei 230038)Corresponding author:LIU Zibing.E-mail:zibingliu@ʌAbstractɔ㊀Objective㊀A rat model of acute lung injury(ALI)was established by intratracheal instillation of lipopolysaccharide(LPS)and changes in the lung injury were observed at various periods.Methods㊀Thirty-two healthy Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into normal(n=8)and model(n=24)group.In accordance with the duration of LPS infusion,the model group was divided into three subgroups:3,6and12h groups,with eight rats in each group.The ALI rat model was established by tracheal instillation of LPS(2mg/kg).Observations included the general performance of rats,gross observation of lungs,detection of lung functions,calculation of the lung wet/dry weight ratio, detection of interleukin(IL)-1β,IL-8,and tumor necrosis factor-αin bronchoalveolar lavage fluid,detection of malondialdehyde and superoxide dismutase in lung tissue,and histomorphological observation by hematoxylin-eosin staining in lung tissue.Changes of acute lung injury were also evaluated at different stages.Results㊀After modeling,the survival rate of rats in the model group was100%.Compared with the normal group,the general performances of rats in the3h group were similar with less food intake,less activity,more mucus secretions in the nasal cavity,faster respiratory frequency,and audible wheezing.Gross observation of the lungs showed liver-like degeneration of the lung tissue in the left and right hilum of the lung in the3h group,bleeding spots were scattered on the left and right lobes,and the bleeding site was bright red.The pulmonary functions of rats after LPS exposure for3h showed significant decreases in the forced expiratory volume(FEV)in0.1s,forced expiratory volume in0.3s,ratio of forced expiratory volume in0.1s to forced vital capacity,and ratio of forced expiratory volume in0.3s to forced vital capacity(P<0.05,P<0.01).The wet/dry weight ratio was increased significantly(P<0.01).The contents of IL-1β,IL-8,and tumor necrosis factor-αin bronchoalveolar lavage fluid were increased significantly(P<0.01).The content of malondialdehyde was increased significantly(P<0.01).The content of superoxide dismutase was decreased significantly(P<0.01).Hematoxylin-eosin staining showed obvious thickening of the alveolar septum,pulmonary interstitial edema,and erythrocyte exudation. Conclusions㊀Tracheal instillation of LPS causes significant decreases in lung functions,severe pulmonary inflammation, an oxidation-antioxidation imbalance,and severe pulmonary edema in rats,which lead to acute lung injury.Furthermore,it is more beneficial to establish an ALI rat model at the3h time point.ʌKeywordsɔ㊀acute lung injury;model;tracheal instillation;lipopolysaccharideConflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.㊀㊀急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是由于肺内外致病因素造成弥漫性炎性肺泡浸润㊁出血㊁肺水肿和透明膜形成,患者血氧结合能力降低为主的危急症候,严重者发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[1-2]㊂在过去的二十年里,已经开发了几种治疗策略,并取得了显著的进展;然而,死亡率仍然很高,超过三分之一的患者死亡,一些幸存者由于长期低氧而出现脑损伤等并发症[3-4]㊂研究发现强烈的炎症反应和肺泡毛细血管膜通透性增加在急性肺损伤的病理生理机制中起重要作用[5]㊂制备稳定的动物模型对观察ALl病理改变和探究潜在药物作用机制和防治并发症等具有重要意义㊂目前关于ALI模型制备途径主要分为原发诱导和继发诱导两种㊂原发诱导通过向气管内滴注脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)[6]㊁盐酸[7]㊁活的(或热杀死)细菌和病毒[8]等物质直接诱导肺部损伤,而继发诱导则是由其他疾病诱发ALI包括烧伤[9]㊁腹腔注射LPS[10]㊁盲肠结扎穿刺等[11]㊂脂多糖刺激已被广泛认为是通过致炎建立与临床相关的ALI动物模型的有效策略[12-13]㊂LPS 诱导的ALI动物模型肺部炎性细胞聚集㊁肺泡毛细血管通透性增加导致弥漫性肺水肿㊁肺出血等症[14-15]㊂本研究通过气管滴注LPS法直接对大鼠肺造成损伤[16-17],建立急性肺损伤动物模型,探究肺损伤程度在不同时间段是否存在差异㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料1.1.1㊀实验动物32只8周龄成年SPF级雄性SD大鼠,体重(230ʃ20)g,由安徽医科大学动物实验中心提供ʌSCXK(皖)2019-0002ɔ,饲养于安徽医科大学动物实验中心ʌSYXK(皖)2019-005ɔ,使用许可证号经安徽科技厅审批㊂饲养环境:昼夜各半循环照明,湿度恒定,室温(23ʃ2)ħ,大鼠分笼饲养,自由饮水㊁摄食㊂实验过程中对动物的处置符合2006年9月科技部颁布的‘关于善待实验动物的指导性意见“,所有操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审查号:AHUM-rats-2020009)㊂1.1.2㊀主要试剂与仪器脂多糖(L2880,美国Sigma公司);肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)㊁白介素-1β(interleukin1β,IL-1β)㊁白介素-8(IL-8)ELISA试剂盒(武汉基因美科技有限公司);丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究院);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究院)㊂手术器械(上海医疗器械股份有限公司);小动物呼吸功能检测仪(北京贝兰博科技公司);Ani-Res2005动物肺功能分析软件(北京贝兰博科技公司);电子天平(上海菁海仪器有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司);Image J 生物医学图像分析软件(美国国立卫生研究院)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀动物分组32只大鼠适应性饲养1周后,随机分为正常组和模型组,正常组8只大鼠,模型组24只大鼠,模型组依据LPS滴注时长不同分为3个亚组:3h组㊁6h 组和12h组,每组8只,造模过程中大鼠死亡,采用差额补充的方法以保证每组的实验动物例数㊂1.2.2㊀模型制备8只正常组大鼠不进行任何处理㊂24只模型组大鼠采用脂多糖(LPS)气管滴注法[16-17]建立ALI 大鼠模型,用3%戊巴比妥钠(1mL/kg)腹腔注射麻醉后固定于解剖台上,沿颈正中线手术暴露气管,采用气管插管的方式向大鼠气管内滴注LPS(2mg/ kg),气管滴注后将大鼠直立,垂直旋转大鼠,使药物能在大鼠肺部均匀布散,以制备急性肺损伤模型,按组别于3㊁6㊁12h末检测肺功能和取材㊂1.2.3㊀观察大鼠一般状况气管滴注LPS后,将大鼠放回饲养笼,给予充足的饲料和水,观察所有大鼠饮食㊁活动㊁呼吸频率等一般状况㊂1.2.4㊀肺功能检测大鼠于3㊁6㊁12h各时间点检测完肺功能,大鼠称重后3%戊巴比妥钠(1mL/kg)腹腔注射麻醉,行气管切开后插管,保持气道畅通㊂大鼠仰卧位放于体描箱中,通过导管连接呼吸机和信号调理器,使用肺功能检测软件,检测大鼠用力肺活量(forced vital capacity,FVC)㊁第0.1秒用力呼气量(forced expiratory volume in0.1s,FEV0.1)㊁第0.1秒用力呼气量与用力肺活量比值(FEV0.1/FVC)㊁第0.3秒用力呼气量(forced expiratory volume in0.3s, FEV0.3)㊁第0.3秒用力呼气量与用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)㊂1.2.5㊀ELISA法检测各组大鼠BALF中细胞因子TNF-α㊁IL-1β㊁IL-8含量收集支气管肺泡灌洗液,将大鼠开胸,结扎左总支气管,用注射器插入气管插管上端,取8mL生理盐水分3次注入右肺,反复冲洗并回收3遍灌洗液,将收集的BALF离心取上清液,采用双抗体夹心酶联免疫分析法检测各指标含量,操作步骤严格按照试剂盒说明书加样,用酶标仪测定OD值,计算实际样品的浓度㊂1.2.6㊀观察肺大体改变大鼠在抽取支气管肺泡灌洗液后,解剖胸腔立即进行肺组织取材,观察大鼠肺组织大体改变㊂1.2.7㊀确定肺湿干重(W/D)比大鼠处死后取左肺,将左肺置于滤纸上去除多余水分并称湿重(W),标记组别后将肺组织连同滤纸一同放入60ħ恒温干燥箱内干燥,48h后干燥完毕,将滤纸与左肺一同取出称干重(D),计算肺湿干重比值,评估肺水肿㊂1.2.8㊀试剂盒检测MDA㊁SOD含量取100mg肺组织捣碎匀浆,在4ħ条件下3500 r/min,离心10min,取上清并保存于-80ħ备用㊂操作步骤严格按照试剂盒说明书操作,用酶标仪测定OD值,计算实际样品浓度㊂1.2.9㊀HE染色法观察肺组织病理学变化取右肺上叶,4%多聚甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,切片(5μm),二甲苯脱蜡脱水,苏木精染色,封片后,10ˑ40倍镜下拍照,用Image J软件观察分析大鼠肺组织病理变化㊂1.3㊀统计学分析所有数据均在SPSS23.0统计学软件上进行统计学分析,以平均值ʃ标准差( xʃs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD检验㊂以P<0.05为差异具有统计学意义㊂2㊀结果2.1㊀大鼠的死亡率/存活率24只模型组大鼠采用气管内滴注LPS法建模,从造模后到取材前3h组㊁6h组和12h组大鼠均存活,存活率为100%㊂2.2㊀大鼠的一般状况大鼠气管滴注LPS后,3h组与正常组相比,精神处于淡漠状态,未见摄食及饮水,蜷卧笼角,活动减少,鼻腔处粘液分泌物增多,部分大鼠鼻腔分泌粘液为血性粘液,大鼠的呼吸频率加快,胸廓起伏加深,可闻及哮鸣音㊂6h 组与3h 组比较,大鼠少量饮水,活动次数增加,鼻腔粘液分泌物减少,呼吸频率较3h 组平稳㊂12h 组大鼠精神状况趋于平稳,摄食及饮水次数增多,鼻腔处未见明显粘液分泌,呼吸平稳,未见明显哮鸣音㊂2.3㊀大鼠肺大体观察LPS 气管灌注3㊁6㊁12h 后,与正常组相比,3h组左右肺门处可见肺组织肝样变,该肝样变区域由肺门处往肺周边蔓延,具有明显的分界,左右肺叶上散布出血点,出血部位颜色鲜红;6h 组表现为右肺上叶处肝样变出血,区域占比为右肺面积10%~20%;12h 组右肺上叶处和右肺中叶处有大片肝样变出血,区域占比为右肺面积的50%~60%,出血部位颜色呈深褐色,表明肺出血较6h 组加剧(见图1)㊂2.4㊀肺功能各组大鼠FVC 差异不显著(P >0.05),与正常组相比,3h 组FEV 0.1㊁FEV 0.1/FVC㊁FEV 0.3㊁FEV 0.3/FVC 均下降明显(P <0.05,P <0.01);6h组FEV 0.3㊁FEV 0.3/FVC 明显降低(P <0.05),FEV 0.1和FEV 0.1/FVC 数值降低,但不具备统计学差异(P >0.05);12h 组FEV 0.1㊁FEV 0.3㊁FEV0.1/FVC㊁FEV 0.3/FVC 下降明显(P <0.05,P <0.01)㊂3h 组与6h 组比较,FEV 0.1㊁FEV 0.1/FVC 差异显著(P <0.05)(图2)㊂2.5㊀左肺湿干重比值3h 组与正常组比较,大鼠左肺湿/干重比值明显增加(P <0.01),6h 组与正常组比较,差异具有显著性(P <0.05),12h 组与正常组比较,差异具有显著性(P <0.01)㊂3h 组与6h 组比较,3h 组湿干重比值更显著(P <0.05)(图3)㊂2.6㊀支气管肺泡灌洗液中促炎因子含量3h 组与正常组比较,BALF 中IL-1β㊁IL-8㊁TNF-α含量明显升高(P <0.01),6h 组与正常组比较,BALF 中IL-1β㊁IL-8㊁TNF-α含量显著升高(P <0.05,P <0.01),12h 组与正常组比较,BALF 中IL-1β㊁IL-8㊁TNF-α含量上升明显(P <0.01),3h 组与6h 组㊁12h 组比较,IL-1β㊁IL-8㊁TNF-α升高显著(P <0.01),6h 组与12h 组比较,IL-8㊁TNF-α含量具备明显差异(P <0.01)(图4)㊂图1㊀不同损伤时间节点观察图Figure 1㊀Observation of nodes with different damagetime注:与正常组比较,∗P <0.05,∗∗P <0.01;与3h 组比较,#P <0.05㊂(下图同)图2㊀大鼠肺功能指标比较(x ʃs ,n =8)pared with the normal group,∗P <0.05,∗∗P <pared with 3h group,#P <0.05.(The same in the following figures)Figure 2㊀Comparison of pulmonary function indexes in rats(x ʃs ,n =8)注:与3h 组比较,##P <0.01;与6h 组比较,әP <0.05,әәP <0.01㊂(下图同)图4㊀BALF 中IL-1β㊁IL-8㊁TNF-α比较(x ʃs ,n =8)pared with 3h group,##P <pared with 6h group,әP <0.05,әәP <0.01.(The same in the following figures)Figure 4㊀Comparison of IL-1β,IL-8and TNF-αin BALF(x ʃs ,n =8)图5㊀肺组织中MDA 和SOD 比较(x ʃs ,n =8)Figure 5㊀Comparison of MDA and SOD in lung tissue(x ʃs ,n =8)2.7㊀肺组织中MDA 、SOD 含量3h 组与正常组比较,MDA 含量显著升高(P <0.01),SOD 含量显著降低(P <0.01),6h 组与正常组比较,MDA 含量明显升高(P <0.05),SOD 明显降低(P <0.01),12h 组与正常组比较,MDA 含量显著升高,SOD 显著降低(P <0.01)㊂模型组组间比较,3h 组与6h 组比较,MDA 含量和SOD 含量具备差异(P <0.05,P <0.01),3h 组与12h 组比较,差异不显著(P >0.05),6h 组与12h 组比较,㊀㊀㊀㊀图3㊀大鼠左肺湿/干重比值比较( x ʃs ,n =8)Figure 3㊀Comparison of wet /dry weight ratio ofleft lung in rats(x ʃs ,n =8)6h 组MDA 含量和SOD 含量具备显著差异(P <0.05,P <0.01)(图5)㊂2.8㊀HE 染色正常组大鼠HE 染色显示肺泡完整且大小均匀,无明显炎性细胞浸润㊂3h 组㊁6h 组和12h 组均可见不同程度的急性肺部炎症㊂3h 组主要表现为肺泡隔增厚,肺泡壁塌陷,肺实质内有炎性细胞浸润,间质水肿㊁红细胞渗出;6h 组可见肺泡壁增厚,炎性细胞浸润,红细胞渗出;12h 组肺泡壁增厚,肺泡壁塌陷,炎性细胞浸润明显㊂三组比较,3h 组肺部损伤最典型(图6)㊂3㊀讨论急性肺损伤是一种常见疾病,临床表现为肺水肿㊁肺出血㊁患者呼吸功能下降为主要特征的肺部炎性疾病㊂引起ALI 的病因有很多,包括休克[18]㊁脓毒症[19]㊁肺挫伤[20]㊁肺炎[21]㊁输血[22]㊁急性胰腺炎[23]等直接因素,以及呼吸机诱导[24]㊁机械伤害[25]等间接因素均可导致ALI㊂从分子机制上分析,主要是蛋白酶和抗蛋白酶失衡㊁氧化应激造成细胞凋亡,整个疾病过程中多种促炎细胞因子的过图6㊀肺组织不同时间段病理学变化(HE染色,ˑ400) Figure6㊀Pathological changes in different time periods(HE staining,ˑ400)度释放,迁移因子和炎性介质过表达,造成级联式的免疫应激反应[26],诱发细胞因子风暴,疾病发展迅速,严重者出现呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[27]㊂关于ALI发病机制的研究几十年来从未间断,但其中细胞分子机制仍有待我们进一步挖掘,制备稳定可靠的ALI动物模型是探究ALI发病机制的重要保证㊂目前制备ALI模型应用最广泛的是气管滴注法,分为暴露法和非暴露法㊂LPS作为内毒素主要成分,是造成ALI重要起病因子[28]㊂本实验造模方法基于参考文献结合课题组前期研究基础上改良[17,29],采用暴露式气管滴注LPS法制备ALI大鼠模型,施术者延颈部正中线切开暴露气管后,可以直接观察到注射针头插入气管内,有效的保证LPS 通过气管进入肺腔,同时能更好的控制药量,保证造模的成功率,研究发现暴露气管滴注法要优于非暴露式气管滴注法[30]㊂参照2011年美国胸科学会评定动物急性肺损伤官方报告[31]制定模型评价标准,在LPS诱导的ALI大鼠模型制备成功后对各组模型进行评判㊂大鼠在气管滴注LPS后出现肺功能明显下降,肺湿干重比值增加,表明肺水肿形成,病理切片显示肺组织呈现肺损伤的特征,包括肺泡间隔增厚㊁肺泡壁塌陷㊁炎性细胞浸润㊁肺间质水肿和出血㊂BALF中炎性因子检测IL-1β㊁IL-8㊁TNF-α含量上升显著,提示大鼠肺内炎症反应剧烈,肺组织中MDA的上升和SOD的下降,表明肺部的氧化和抗氧化机制的失衡,以上指标趋势均符合2011年美国胸科学会评定动物急性肺损伤官方报告[31]对ALI动物评价标准,表明本次实验复制ALI大鼠模型成功,且结果表明3h组造模效果要优于6h组㊁12h组㊂从组织学的角度来看,肺是一个非常复杂的器官㊂肺上皮由两种主要细胞类型组成,肺泡Ⅰ型(alveolar type I,ATI)细胞和肺泡Ⅱ型(alveolar type II,ATII)细胞,又称I型和II型肺泡细胞㊂ATI与ATII细胞共同构成肺外周部完整的上皮衬里,在肺内稳态中发挥重要作用[32]㊂肺泡上皮是保护肺部免受外界环境伤害的机械屏障,它积极参与肺部的免疫反应,有助于维持肺泡表面液体平衡[33]㊂急性肺损伤病理学表现为肺泡上皮细胞损伤㊁大量中性粒细胞在肺中聚集以及弥漫性的肺水肿㊂在LPS 的诱导下,肺上皮细胞损伤㊁凋亡,释放大量的促炎因子和趋化因子,从外周血液中招募大量的中性粒细胞进入肺中,中性粒细胞进一步释放炎性介质和趋化因子,造成炎症级联式反应,引起细胞因子风暴产生[34]㊂另外肺泡上皮屏障被破坏,使得血管内大量富含蛋白质的液体进入肺泡,造成弥漫性肺水肿㊂实验结果表明,气管内灌注LPS诱导肺泡上皮细胞损伤,中性粒细胞浸润,弥漫性肺水肿,成功建立ALI大鼠模型㊂肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AM)是支气管肺泡内主要的常驻免疫细胞,它与肺泡上皮细胞一起,对到达下呼吸道的有毒物质和病原体产生即时反应,有助于维持肺内环境稳态[35]㊂AM在接受不同刺激物诱导后,可经典活化为M1型肺泡巨噬细胞和M2型肺泡巨噬细胞㊂M1主要分泌细胞因子TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6等促炎;M2主要分泌细胞因子IL-10,TGF-β等发挥抗炎作用[36]㊂LPS属于经典的巨噬细胞激活剂[37]㊂AM对LPS的反应和随后细胞因子的释放依赖于Toll样受体4(toll-like receptor4,TLR4)[38]㊂通常AM中TLR4的表达量很低,但在LPS暴露后TLR4的表达迅速增强[39]㊂LPS与TLR4受体结合,导致促炎通路NF-κB (nuclear factor-kappa B)活化,产生多种炎症介质TNF-α㊁IL-6,最终导致细胞损伤和急性肺损伤的临床表现[40]㊂此外,气管内注射LPS可诱导坏死性AM释放IL-1α,继而激活内皮细胞,增加血管通透性,造成肺间质水肿[41]㊂实验中,暴露式气管灌注LPS法主要表现为肺间质水肿,也从侧面佐证了这一点㊂本研究表明,通过暴露式气管滴注LPS法成功复制ALI大鼠模型,同时针对3h这一时段,暴露式气管滴注LPS法能更好的反映急性肺损伤这一疾病的病理特性㊂参㊀考㊀文㊀献(References)[1]㊀Butt Y,Kurdowska A,Allen TC.Acute 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大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。

2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。

3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。

二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。

2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。

左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。

用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。

3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。

4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。

5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。

用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。

组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。

气管镜肺活检（TBLB）和局部肺泡灌洗，肺活检报告示慢性肉芽肿性病变伴凝固性坏死，灌洗液和痰均找到抗酸杆菌，最终诊断为两肺肺结核。

经过HRZE四联抗结核治疗，辅以激素控制结核中毒症状，患者病情迅速好转出院。

成人继发性肺结核影像常常呈现为多形态表现（即同时出现渗出、增殖、纤维和干酪性病变，还可伴有钙化），容易形成空洞。

而本例患者起病较急，影像表现为两肺弥漫性肺间质病变、左肺大片实变、两肺斑片状阴影等多种病变，显然与典型继发性肺结核的表现有许多不同。

与一般的成人继发性肺结核相比，有免疫损害及老年肺结核患者表现常常不典型。

有资料认为成人继发性肺结核的不常见的X线表现有：①下肺结核；②粟粒性肺结核伴两肺间质性病变；③类似肺癌的纤维干酪块；④胸片正常。

回顾本例的诊治过程，我们的体会是：目前肺结核的临床表现多种多样，为了尽可能的减少肺结核的漏诊和误诊，提高对类似下呼吸道感染表现的肺结核的认识，了解和熟悉肺结核少见的X线表现，注意结核的高危因素和高危人群及胸部影像学的追踪观察，重视痰找抗酸杆菌、纤维支气管镜、组织活检病理等检查是十分必要的。

成年大鼠肺成纤维细胞的原代培养和鉴定徐卫华沈华浩浙江大学医学院附属二院呼吸科，浙江大学呼吸疾病研究所（310009）体外培养肺成纤维细胞是研究肺部疾病如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等的重要手段和工具。

目前对于成年大鼠肺成纤维细胞的原代培养，国内尚未见报道。

我们利用组织块培养法对成年SD大鼠肺成纤维细胞进行了原代培养，并用免疫细胞化学的方法进行了鉴定。

一、材料和方法1．试剂和器材0.25%胰蛋白酶（杭州吉诺公司），DMEM细胞培养液（杭州吉诺公司），胎牛血清（杭州四季清公司），兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体及鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），免疫组化染色SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司），小鼠抗波形蛋白单克隆抗体及免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

不同诱因急性肺损伤模型大鼠肺内外炎症动态变化的开题报告一、研究背景急性肺损伤是一种常见的、病死率高的肺部疾病，其主要病理特征为肺泡上皮细胞和内皮细胞受损导致肺水肿、肺炎和呼吸功能异常。

急性肺损伤的发病机制尚不清楚，可能涉及多种诱因，如感染、创伤、药物和化学物质等。

在急性肺损伤的发病机制中，黏附分子的表达和炎症细胞的聚集起着重要的作用。

黏附分子介导炎症细胞的粘附和移行，导致肺部组织炎症反应的加剧和肺部功能的受损。

因此，研究不同诱因所致急性肺损伤模型大鼠肺内外炎症动态变化，对于深入了解急性肺损伤的发病机制具有重要意义。

二、研究目的本研究旨在建立不同诱因所致急性肺损伤模型大鼠，观察肺内外炎症动态变化及黏附分子表达水平的变化，以期为进一步探讨急性肺损伤的发病机制提供实验依据。

三、研究设计1. 实验动物：40只SD大鼠，雄性，体重200-220g。

2. 分组设计：（1）正常对照组：注射等量生理盐水，末次注射后24h处死；（2）LPS组：腹腔注射LPS（10mg/kg），末次注射后2、6、12和24h处死；（3）氧化氮组：腹腔注射氧化氮（30μmol/kg），末次注射后2、6、12和24h处死；（4）乳糜组：静脉注射乳糜（4ml/kg），末次注射后2、6、12和24h处死。

3. 观察指标：（1）肺组织病理学变化的评价；（2）肺泡灌洗液（BALF）细胞计数及分类；（3）BALF中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的ELISA检测；（4）肺组织黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-选择素表达的免疫组化检测。

四、预期结果和意义通过建立LPS、氧化氮、乳糜三种不同诱因所致急性肺损伤模型大鼠，观察其肺内外炎症动态变化和黏附分子表达水平的变化，为深入了解急性肺损伤的发病机制提供实验依据，并为临床诊疗提供科学依据。