目的基因的遗传转化
- 格式:doc
- 大小:188.50 KB
- 文档页数:6
转基因的基础知识目录1. 转基因概述 (2)1.1 转基因的定义 (2)1.2 转基因技术的发展历史 (3)1.3 转基因技术的分类 (4)2. DNA及基因的介绍 (5)2.1 DNA的结构与功能 (7)2.2 RNA和基因表达 (8)2.3 基因的识别和分离 (9)3. 转基因的方法学 (10)3.1 直接基因运输法 (12)3.1.1 显微吸管法 (13)3.1.2 电穿孔法 (14)3.1.3 粒子轰击转化法 (15)3.2 载体介导的转基因技术 (16)3.2.1 病毒载体 (17)3.2.2 细菌载体 (18)3.2.3 人工染色体载体 (19)3.3 基因编辑与基因驱动 (20)4. 转基因伦理与法律考量 (22)4.1 转基因伦理争议 (24)4.2 转基因法律法规现状 (25)4.3 公众认知与消费者权利 (26)5. 转基因在农业中的应用 (27)5.1 转基因作物开发 (28)5.2 转基因农作物的益处与风险 (30)5.3 转基因作物的常见类型 (31)6. 转基因在生物医药领域的应用 (32)6.1 基因治疗 (33)6.2 基因工程用于疫苗与药物 (34)6.3 转基因动物模型 (36)7. 转基因的未来趋势 (37)7.1 新基因编辑工具的发展 (38)7.2 转基因技术的精确性与安全性提升 (40)7.3 生态系统平衡与生物多样性保护 (41)7.4 全球化与转基因的国际合作 (42)1. 转基因概述又称基因工程,是一项革新性的生物技术,通过基因操作改变生物遗传物质,赋予其新的特性或增强现有特性。
核心原理是将目标基因(如抗病基因、抗虫基因、提高营养价值等)从一个生物体(供体生物)分离并插入到另一个生物体的基因组中(受体生物),从而改变受体生物的基因组成。
这一过程能够使受体生物获得新的功能,例如抵抗特定病害、耐受农药、提高产量、增强营养价值等。
转基因技术广泛应用于农业、医药、环境保护等领域,对人类生活产生了深远影响。
主讲:胡银岗植物科学系农学院植物科学系西北农林科技大学农学院西北农林科技大学植物基因受体系统质粒介导基因转化直接导入的基因转化第四节花粉管通道法介导基因转化第五节病毒介导的基因转化第六节植物基因转化系统的选择第七节单子叶植物的基因转化依赖于良好的植物受体系统的建立。
用于转化的外植体(如发苗产生子叶、胚轴等)通过组织培养途径或其它非组织培养途径能高效、稳定地再生无性系接受外源DNA整合对转化选择抗生素敏感植物基因转化受体系统的条件(一)高效稳定的再生能力(二)较高的遗传稳定性(三)具有稳定的外植体来源(四)对选择性抗生素敏感(五)对农杆菌侵染有敏感性(一)高效稳定的再生能力从理论上讲,植物的任何体细胞都具有再生完整植(totipotency)但在组织培养的实践中,并不是所有的体细胞都能再生出完营养生长中心(分生组织)和薄壁细易再生出植株。
再生频率必须具有好的稳定性和重复性。
植物转化频率一般情况下只有0.1%。
基因转化操作,如农杆菌侵染,使用抗菌素筛选及继代培养,都会使转化外植体再生频率降低,有的甚至不能分化,或只能分化形成芽,而难以形成植株。
若只有10%再生率,则转化率10% ×0.1% = 0.01%后不影响其分裂和分化,并能稳定地将外源基因遗传给后代,保持遗传的稳定性,尽量减少变异。
不因导入优良性状的目的基因,使原有的目的性状(优良性状)在后代发生了变异。
注意组培过程(组培方法,再生途径及外植体基因型)引稳定的外植体来源,即外植体容易得到并且可以大量提供。
因基因转化的频率很低,需要多项反复地实验,所以就需要大量的外植体材料。
转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼叶等,或采用快速无需复杂的培养和繁殖操作过程,数量亦多;接种前的无菌处理简便易行;一些植物可由无菌幼苗形成愈伤组织和再生植株;无需保持无菌苗的无性系,只要有种子,随时可大量培养已适应组织培养条件,有利于外植体转化生长;可直接采用、无需消毒;材料来源量大而稳定。
基因工程中的遗传转化技术随着科技的不断进步和人类对于基因的深入研究,基因工程开辟了一个全新的领域,为我们带来了更多的可能性和前景。
而在基因工程中,遗传转化技术作为其中一项重要的技术之一,具有不可忽视的意义。
本文将重点介绍遗传转化技术在基因工程中的应用以及其相关的技术和问题。
一、什么是遗传转化技术遗传转化技术(Genetic transformation)是指将异物(如DNA)导入生物细胞内,使其成为一个新的功能基因,从而改变生物的遗传特征。
遗传转化在某种程度上实现了跨物种的融合,使得基因改良的范围变得更加宽广。
而在基因工程中,遗传转化技术一般指在体外进行转录(in vitro transcription)并随后在体内转化(in vivo transformation)。
二、遗传转化技术在基因工程中的应用1、传统农业领域经过遗传转化技术改良后的农作物,可以更好的适应环境和提高产量,同时具有抗病性和适应性等优势。
比如水稻的基因改良使得其极大地提高了产量和抗病性,而通过向玉米引入拟南芥的基因能够增加玉米与蚜虫之间的抗性。
2、生物医学领域遗传转化技术在生物医学领域中也有着广泛的应用,可以通过改良基因来治疗疾病。
例如将带有缺陷的基因进行修复或替换,帮助治疗一些罕见病并降低复发率。
另外,通过编辑细胞的基因,可以改变细胞自身的功能,使得细胞在特定情况下具有特定的特性和生物活性。
3、环境保护领域利用遗传转化技术对环境中的生物进行改良,具有一定的环保效果。
如将某些细菌的功能进行改良,使其能够对特定的毒物或有害气体进行处理,达到降低污染的目的。
三、遗传转化技术中的问题及其解决方法1、基因流失目前,遗传转化仍然存在基因流失的问题,即将转基因物种与外部环境中的野生物种杂交,导致转基因物种的基因流入野生物种中。
这种基因流失的现象往往会对生态系统造成一定的影响。
为了解决这个问题,应该通过对外部环境中野生动植物的监测和分析,以及对生态链的探究,来规避基因流失这个风险。
总结遗传转化过程各个环节的要点及注意事项
应用重组DNA技术、细胞组织培养技术或种质系统转化技术,有目的地将外源基因或DNA片段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获得新植株的技术第一类:外源裸露基因的直接导入法;通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物基因组中。
基因枪转法第二类:载体介导的转化方法;通过将目的基因连接在植物表达载体上,随着载体DNA的转移而将外源目的基因整合到植物基因组中。
农杆菌介导转化法,病毒介导的转化法第三类:种质转化系统法;包括植物原位真空渗入法和花粉管通道法。
(一)基因枪法;(1)原理:基因枪法把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器。
气体基因枪可在广泛的细胞型中得到瞬时的、稳定的和高效率的转化作用,气体基因枪有一个产生冲击波的特殊结构,在恰当的气压范围内从3.5MPa-10MPa,具有相应不同的可破裂膜,将包覆DNA的粒子穿越,射入在轰击室底部的靶细胞中。
(2)程序与方法:(1)轰击微弹的制备(2)基因枪轰击参数(3)受体材料(4)轰击样品。
第2课时目的基因的导入和检测[目标导读] 1.结合教材P77~81图文,阐明目的基因的导入的四种方法。
2.分析教材P81~83内容,掌握目的基因的检测与表达产物的测定。
[重难点击] 1.目的基因的导入方法。
2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。
方式一通过前面的学习,我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。
在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后,下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选,获得大量的重组DNA分子,这就是外源基因的无性繁殖,即克隆(cloning)。
方式二目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过检测与鉴定才能知道。
这是基因工程的第四步工作。
以上步骤完成后,在全部的受体细胞中,真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。
因此,必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。
检测的方法有很多种,例如,大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因,当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒,并被转入受体细胞后,就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明目的基因完成了表达过程。
一、目的基因的导入1.花粉管通道法(如图)(1)概念:是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞,借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。
常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。
(2)实验:利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序①原理:授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入,经过珠心通道进入胚囊,转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。
②操作过程a.提取含有目的基因的总DNA或者质粒DNA,配成质量分数为0.01%的溶液。
b.用棉线捆住将要在第二天开花的花朵,不让花朵自动开放。
c.第二天清晨给花朵进行人工授粉,授粉后套袋,作好标记。
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术,用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》,供大家借鉴与参考,希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体(Protoplast)原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分,包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系,其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交,从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养(Protoplast Culture)原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养,以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合,克服远缘杂交障碍,实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合(Protoplast Fusion)原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞,可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生(Regeneration)再生是指通过培养技术,使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一,也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化(Genetic Transformation)遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内,并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分,也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术,可以将目的基因导入植物细胞内,并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养(Plant Tissue Culture)植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养,以获得再生的植物组织或细胞。
植物遗传转化中存在的问题与对策大家好,今天我们来聊聊植物遗传转化这个话题。
我们得明白什么是遗传转化。
遗传转化是指将一个生物体的基因转移到另一个生物体的过程。
在植物领域,遗传转化技术被广泛应用于培育新品种、提高抗病性、改善营养成分等方面。
这项技术也存在一些问题,接下来我们就来看看这些问题以及应对措施。
1.1 问题一:成本高昂遗传转化技术的成本非常高,这是因为它涉及到很多复杂的实验和操作。
例如,需要先从一个生物体中提取出目标基因,然后通过化学方法将其插入到另一个生物体的DNA中。
这个过程非常繁琐,而且需要大量的实验室设备和人力投入。
因此,遗传转化技术通常只被用于研究目的,而不是大规模的商业化生产。
1.2 问题二:效率低下虽然遗传转化技术可以实现基因转移,但是它的效率并不高。
有时候,即使成功地将目标基因插入到另一个生物体的DNA中,也不一定能够稳定地表达出来。
这就导致了遗传转化产生的新品种往往存在很多不稳定性和变异性,难以进行大规模的推广和应用。
2.1 问题一:安全性问题遗传转化技术还存在一定的安全性问题。
由于涉及到基因的操作,一旦操作不当就可能导致不良后果。
例如,有可能出现新的病毒或者细菌,对人体健康造成威胁。
遗传转化技术还可能对环境造成污染,影响生态平衡。
2.2 问题二:道德争议除了安全性问题外,遗传转化技术还引发了一些道德争议。
有人认为,将基因直接插入到另一个生物体中是对自然界的破坏和干预,不符合伦理原则。
还有人担心遗传转化技术可能被用于制造“超级作物”,从而导致资源的不公平分配和社会问题的加剧。
3.1 问题一:法律法规缺失目前,我国对于遗传转化技术的法律法规还比较薄弱。
虽然有一些相关政策和规定出台了,但是执行力度不够强,监管不够严格。
这就给一些不法分子提供了可乘之机,利用遗传转化技术进行非法活动。
3.2 问题二:人才培养不足要想发展好遗传转化技术,还需要大量的专业人才支持。
然而目前我国在这方面的人才培养还比较滞后,很多高校和科研机构缺乏相关的教授和研究人员。
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果,通过构建基因表达载体,将目的基因导入水稻细胞中,从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料:水稻品种为南桂占,农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105,目的基因(GFP基因)载体为pBI121。
2. 试剂:农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器:PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆:将GFP基因从质粒载体pBI121中切出,插入到农杆菌载体pBin19中,构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化:将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中,在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化:将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合,用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上,28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒:将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒,再用无菌水冲洗3次,然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染:将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上,用无菌滤纸轻轻擦拭叶片,使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导:将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中,28℃条件下培养5-7天,诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选:将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中,28℃条件下培养3-4周,筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生:将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中,28℃条件下培养2-3周,诱导再生植株。
9. 抗性鉴定:将再生植株种植于田间,对植株进行潮霉素筛选,筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测:对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测,验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆:成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化:农杆菌转化效率较高,大部分叶片出现愈伤组织。
遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。
其中,农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。
其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上,并使之与植物内源基因同步表达的能力。
农杆菌介导法的具体步骤如下:1. Ti质粒的构建:利用农杆菌进行遗传转化前,必须对Ti质粒进行改造。
改造的目的有以下几点:去除T-DNA区的激素基因,因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂,阻碍正常植株的再生。
保留T-DNA区的左右边界,尤其是左边界,以保证T-DNA的正常转化。
在去除的T-DNA区,增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因,以使转化细胞易于被检测出来。
在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。
在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒,该基因只能在细菌中表达,而不能在植物中表达。
2. 外源基因的转化:除Ti质粒外,发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。
发根农杆菌感染植物伤口,向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA,经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。
发状根没有向地性,可在无激素的培养基上培养生长,生长迅速并产生许多分枝,其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。
发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。
例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。
3. 外源基因的转化:一般而言,农杆菌只感染双子叶植物;但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。
农杆菌介导的遗传转化技术简单,易于掌握,对植物受体要求不严,绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可,且转化频率较高,转化周期较短,是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。
以上内容仅供参考,建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。
一、实验目的本研究旨在通过农杆菌介导法对大豆进行遗传转化,将目的基因导入大豆基因组中,并成功获得转基因大豆植株。
通过本实验,旨在探索大豆遗传转化技术,为大豆育种提供新的技术手段,提高大豆的产量和品质。
二、实验材料1. 大豆品种:Williams822. 农杆菌菌株:E. coli DH5α3. 转化载体:含有目的基因的质粒pBI1214. 实验试剂:抗生素、植物激素、DNA提取试剂盒等5. 实验设备:离心机、PCR仪、凝胶成像系统、组织培养室等三、实验方法1. 质粒提取与鉴定(1)采用DNA提取试剂盒提取质粒DNA。
(2)通过PCR扩增质粒中的目的基因,并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2. 农杆菌培养与活化(1)将农杆菌菌株E. coli DH5α接种于含有抗生素的LB培养基中,37℃培养过夜。
(2)将活化后的农杆菌接种于含有抗生素的YEB培养基中,28℃培养过夜。
3. 转化载体的构建(1)将目的基因插入到质粒pBI121的T-DNA区域。
(2)通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定转化载体。
4. 农杆菌介导的大豆遗传转化(1)将转化载体与活化后的农杆菌共培养,使农杆菌吸收转化载体。
(2)将农杆菌接种于含有抗生素的YEB培养基中,28℃培养过夜。
(3)将农杆菌悬浮液滴加到大豆子叶节上,进行农杆菌介导的大豆遗传转化。
5. 转基因大豆植株的再生与筛选(1)将转化后的大豆子叶节接种于含有抗生素和植物激素的培养基上,进行组织培养。
(2)通过PCR和琼脂糖凝胶电泳筛选阳性植株。
6. 转基因大豆植株的鉴定(1)采用RT-PCR技术检测目的基因在转基因大豆植株中的表达。
(2)通过Western blot技术检测目的蛋白在转基因大豆植株中的表达。
四、实验结果1. 质粒提取与鉴定:成功提取质粒DNA,并通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定出目的基因。
2. 农杆菌培养与活化:成功活化农杆菌菌株E. coli DH5α。
3. 转化载体的构建:成功构建含有目的基因的转化载体。
目的基因片段与载体连接全文共四篇示例,供读者参考第一篇示例:目的基因片段与载体连接是分子生物学领域中常见的实验操作,它是为了将感兴趣的基因片段插入载体中,以便在细胞或生物体内进行研究和表达。
这一过程是基因工程、基因克隆和表达的基础步骤之一,对于揭示基因功能、疾病研究以及生物技术应用具有重要意义。
为了实现目的基因片段与载体的连接,研究人员通常采用多种方法和技术。
其中最常用的方法是利用酶切和连接技术。
酶切是指使用特定的限制性内切酶切割DNA,将基因片段和载体进行切割,以便于它们能够形成互补的粘性末端。
连接过程中需要使用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接在一起,形成一个完整的重组DNA分子。
连接过程分为以下几个步骤:1. 酶切:首先需要使用适当的限制性内切酶对目的基因片段和载体进行酶切,生成具有粘性末端的DNA片段。
2. 处理:将酶切后的目的基因片段和载体经过处理,以去除杂质和保持DNA稳定性。
3. 连接:在连接反应中,目的基因片段和载体通过DNA连接酶的作用,将它们连接在一起。
这种连接通常是在适当的实验条件下进行,以确保连接的可靠性和效率。
4. 转化:将连接好的重组DNA分子引入宿主细胞中,通常通过转化的方式实现。
转化是指利用细胞膜通透性增加的方法,将DNA分子引入细胞内,使其在细胞内表达。
除了酶切和连接技术外,还有其他方法可以实现目的基因片段与载体连接,如PCR扩增、梯度离心、化学连接等。
这些方法各有特点,研究人员根据实验需要和经验选择最适合的连接方法。
目的基因片段与载体连接的成功与否直接影响到后续的实验结果和研究进展。
在连接过程中,需要严格控制实验条件、操作技术和试剂质量,避免出现非特异性连接或连接失败的情况。
合理设计连接实验方案、选择合适的酶切位点和优化连接条件也是确保连接成功的关键。
目的基因片段与载体连接是基因工程和分子生物学研究中至关重要的步骤,它为科学家提供了有效的手段,揭示基因功能、探索生命奥秘。
植物遗传转化步骤植物遗传转化是一种通过改变植物的遗传物质来实现特定目的的技术。
这一技术已经被广泛应用于植物育种、基因工程和农业生产中。
下面我们将介绍植物遗传转化的具体步骤。
一、选择目标植物和目标基因在进行植物遗传转化之前,首先需要确定目标植物和目标基因。
目标植物通常是经济作物或者重要的研究对象,而目标基因则是具有特定功能的基因,如抗病性、耐旱性等。
二、构建载体构建载体是进行植物遗传转化的重要步骤之一。
载体是将目标基因导入植物细胞的媒介,通常由DNA序列构成。
在构建载体时,需要将目标基因插入到适当的表达载体中,并加入其他必要的DNA片段,如启动子、终止子和选择标记基因等。
三、转化载体到植物细胞将构建好的载体导入植物细胞是植物遗传转化的核心步骤。
目前常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将构建好的载体转化到农杆菌中,然后利用农杆菌侵染植物组织,将载体导入植物细胞。
基因枪法则是利用高压气体将载体直接“射击”到植物细胞中。
四、筛选转化植株在转化植物细胞后,需要进行筛选以获得含有目标基因的转化植株。
为了区分转化植株和未转化的植株,常常会在载体中加入选择标记基因。
选择标记基因通常会使转化植株对某种抗生素或除草剂具有耐受性,在培养基中添加相应抗生素或除草剂后,只有含有目标基因的转化植株能够生长下去。
五、培养和繁殖转化植株筛选出含有目标基因的转化植株后,需要进行培养和繁殖。
通常会将转化植株移至含有适当营养物质的培养基中进行生长,以获得足够数量的转化植株。
六、鉴定转化植株在培养和繁殖转化植株后,需要对其进行鉴定,确认其是否成功转化。
鉴定方法包括PCR扩增、Southern印迹和Western印迹等。
通过这些方法,可以检测目标基因在转化植株中的存在和表达情况。
七、后续分析和应用一旦确认转化植株成功,就可以进行后续的分子生物学和生理学分析,如基因表达分析、蛋白质功能研究等。
此外,转化植株也可以用于基因工程和农业生产中,如改良作物品质、提高产量等。
转基因包括人工转基因和自然转基因原理
人工转基因:将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中,使之稳定遗传与表达。
自然转基因:自然界自发的基因在不同动物或植物间的转移现象。
动物克隆即是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术,即通过核移植生产遗传结构与细胞核供体动物相同的动物个体的过程。
转基因技术要点
1、目的基因的获得
2、目的基因重组质粒的构建
3、受体材料的选择
4、转基因方法
克隆技术要点:概括起来说主要有两类:
第一类是以载体为媒介的遗传转化,也称为间接转移系统法。
核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎移入代孕母畜(寄母)等步骤。
遗传转化方法嘿,朋友们!今天咱就来好好聊聊遗传转化方法。
这可是个相当神奇又重要的领域呢!你想想看,遗传就像是生命的密码本,而遗传转化方法呢,就是那能改写密码的神奇之笔。
它能让我们按照自己的意愿去改变生物的遗传特性,这多厉害呀!比如说,在农业方面,通过遗传转化方法,我们可以让庄稼长得更茁壮、更抗病虫害。
这不就像是给庄稼穿上了一层坚固的铠甲嘛!让它们能在各种环境下都茁壮成长,给我们带来更多的丰收和喜悦。
再看看医学领域,利用遗传转化方法,也许未来我们就能攻克好多疑难杂症呢。
就好像是找到了打开健康之门的钥匙,为人们带来更多的希望和生机。
常见的遗传转化方法有好几种呢。
比如农杆菌介导法,这就像是一个勤劳的快递员,把我们需要的遗传物质准确无误地送到目的地。
还有基因枪法,那可真是干脆利落,“砰砰”几下就把遗传信息传递过去啦。
然后呢,还有电击法,就如同给细胞来了一场小小的电击冒险,让它们在刺激中发生改变。
这是不是很有趣呀?每种方法都有它的特点和适用范围。
就像我们生活中的工具一样,有的适合修修补补,有的适合大刀阔斧地干活。
我们得根据具体的情况来选择最合适的遗传转化方法。
而且啊,这遗传转化可不是随随便便就能成功的。
它需要科学家们精心设计、细心操作,就像一个大厨在烹饪一道美味佳肴一样,每一个步骤都要恰到好处。
想象一下,如果遗传转化方法运用不当,那会造成什么样的后果呢?会不会出现一些奇奇怪怪的生物呀?所以呀,我们一定要谨慎再谨慎。
在这个不断探索的过程中,肯定会遇到各种各样的困难和挑战。
但这就是科学呀,不就是在不断解决问题中前进的嘛!我们要相信,随着技术的不断进步,遗传转化方法会给我们的生活带来更多意想不到的惊喜和改变。
总之呢,遗传转化方法是个充满魅力和潜力的领域。
它让我们看到了生命的无限可能,也让我们对未来充满了期待。
让我们一起期待它能为我们创造出更加美好的世界吧!。
实验十目的基因的遗传转化一、目的基因的表达载体构建1. 实验目的本实验以强化植物基因工程平台技能训练为目的,涵盖PCR分离克隆全长目的基因、Gateway 技术构建目的基因的表达载体、农杆菌介导目的基因的转化、转基因植株的驯化和移栽等系列实验。
此外,还就如何利用新型的反向遗传学技术RNAi(RNA interfere,RNA 干涉)进行基因功能研究进行试验指导。
为从事相关领域的科学研究奠定基础。
通过本实验,要求学生理解和掌握Gateway 技术构建目的基因的表达载体的基本原理和具体实验步骤。
2. 实验原理利用高保真聚合酶,采用PCR方法在克隆基因两侧引入attB重组位点,然后将含有attB 位点的PCR产物与含有attp位点和Gateway BP Clonase混合,之后转化E. coli。
在两对att 位点之间的位点特异性重组过程中产生一个融合载体,融合载体随即分解成两个分子,重组位点在结构上重新分配,目标基因进入新的载体骨架,通过筛选阳性克隆,获得此重组产物,称为“entry克隆”。
在得到的entry克隆中目标基因位于att重组位点之间。
将此重组产物与选定的Gateway载体和Gateway LR Clonase酶混合,在entry克隆中的attL位点间的序列取代表达(目标)载体的attR位点之间的序列即目标基因进入表达载体,形成表达(目标)克隆(图)。
Gateway技术构建植物表达载体原理3. 仪器设备微量取液器、制冰机、微型离心机、PCR仪、凝胶成像系统、毛细管自动测序仪、电子天平、高速冷冻离心机、振荡器、恒温金属浴、干燥箱、紫外分光光度计、电泳仪、-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱等。
4. 实验试剂克隆全长基因,pDONR TM221 载体(Invitrogen,12535-019),目标载体(购自Invitrogen,类型可选)。
(1)核酸和质粒提取试剂,测序试剂,T-vector,DNA片段回收试剂盒,Taq聚合酶,反转录试剂盒,DNA marker,氨苄青霉素,X-gal,IPTG等试剂的配方和购买公司见模块一中相应章节。
(2)BP Clonase TM Enzyme Mix(11789-013)*12、LR Clonase TM Enzyme Mix*13(11791-019)均购自Invirtrogen公司。
5. 实验方法克隆含有B序列的目标基因:(1)设计B序列引物,用于扩增带有B序列接头全长基因。
(2)利用上面第一组引物,进行PCR反应。
(3)以在全长基因上加入一半B序列的扩增产物为模板,进行第二次PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)纯化含有B序列PCR产物(磁珠回收纯化法)。
(5)克隆产物与T载体的连接。
连接产物的转化。
(6)阳性克隆的筛选及质粒提取。
(7)DNA序列测定。
BP反应:(1)BP反应的目的在于将含有线性attB表达克隆或attB接头的PCR产物克隆到含有attP 的donor载体上以产生entry克隆。
attB-PCR 产物或线性attB表达克隆0.5 µLpDONR221 1 µL5ХBP Clonase TM Reaction Buffer 4 µLTE Buffer(pH 8.0)10 µLBP ClonaseTM enzyme mix 4 µLTotal 20 µL25 ℃温育16 hr,之后向体系中加入2 µL蛋白酶K溶液,37 ℃温育10 min,以终止BP反应。
(2)BP反应产物的转化。
(3)阳性克隆的鉴定。
LP反应:(1)LR反应的目的在于将已经重组入entry载体的目标基因再克隆到表达(目标)载体,以产生表达(目标)克隆。
表达(目标)载体1µL Entry clone (100-300 ng )1 µL5ХLR Clonase TM Reaction Buffer 4 µL TE Buffer (pH 8.0) 10 µL LR Clonase TM enzyme mix 4 µL Total20 µL25 ℃温育16 hr ,之后向体系中加入2 µL 蛋白酶K 溶液,37 ℃温育10 min ,以终止LR 反应。
(2)LR 反应产物的转化。
(3)对阳性克隆可采用PCR 和酶切结合进行鉴定。
EcoRV 酶切后电泳见左下图。
重组质粒图谱见右下图。
6. 注意事项attB 上下游PCR 引物的设计在遵循引物设计原则的基础上,还必须满足以下条件: (1)5’末端具有4个G 残基。
(2)4个G 残基与25 bp 的AttB 1位点相连。
(3)至少有18-25 bp 的特异基因序列或模板序列。
(4)attB 上游引物位点末端连有T 残基。
(5)如果需要PCR 产物与N 末端标签框架结合,引物必须包括另外两个碱基,使得在AttB 1区域保持正确的读码框。
这两个碱基不能是GA 、AA 或AG ,以防形成终止密码子。
(6)对于下游引物而言,如果需要PCR 产物与C 末端标签框架结合,引物必须包括另外一个碱基,使attB2区域保持正确的读码框。
同时,任何存在于attB2位点和目的基因之间的 终止密码子必须被去除。
如果不需要PCR 产物与C 末端标签框架结合,则克隆基因或引 物必须包含终止密码子。
7. 作业(1)Gateway 技术原理是什么?2000bp1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp816bpM DREB1A酶切电泳图pH2GW7-DREB1A 重组质粒图谱(2)载体上具备ccdB 基因的意义是什么?二、愈伤组织的遗传转化及转基因植株的检测 1. 实验目的掌握诱导水稻胚性愈伤组织方法;掌握农杆菌介导的遗传转化及转基因植株检测的原理及实验步骤。
2. 实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的革兰氏阳性菌,它能在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
当农杆菌通过植物伤口进入细胞后,可将农杆菌细胞中的一段T-DNA 插入到植物基因组中,是一种天然的植物遗传转化体系。
将目的基因插入到经过改造的T-DNA 区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物基因组的转移和整合,然后通过细胞和组织培养技术再生出转基因植株。
近年来,农杆菌介导法广泛地应用在一些单子叶植物(尤其是水稻)的遗传转化中。
3. 仪器设备机械脱壳机,50 mL 无菌试管(若干),灭菌培养皿,灭菌烧杯(若干),灭菌滤纸,灭菌镊子。
灭菌滤纸、烧杯、镊子、吸水纸、无菌三角瓶、培养皿。
4. 实验试剂(1)1.5 % 次氯酸钠消毒液。
(2)70 % 酒精,无菌水,蔗糖。
水稻愈伤组织遗传转化流程图2-3周种子(2N6)农杆菌(AB ) OD 600=0.15-0.2愈伤组织前培养(2N6)(3)N6 Basal Salt mixture :(4)2,4-D (2,4-dichlorohenoxyacetic acid ),琼脂糖(Agarose type Ⅰ;sigma, A-6013)。
(5)琼脂糖。
(6)潮霉素(Hygromycin )溶液 (50 mg/mL )。
(7)乙酰丁香酮(AS )溶液。
(8)农杆菌培养(AB )母液。
(9)农杆菌悬浮液(AAI )母液。
5. 实验方法(1)诱导愈伤组织。
(2)培养农杆菌。
用接菌环从农杆菌(PIG121)原液中蘸取少许菌液,在AB 培养基上划线。
28 ℃黑暗培养2-3 d 。
配置AAI 培养基,调pH 至5.2。
分装,每管100 mL ,高压灭菌,使用前加入10 µL/100 mL AS (乙酰丁香酮)。
在无菌的试管中加入25 mL 含有AS 的AAI 培养基,收集步骤3中的农杆菌(用药匙刮取平板上的农杆菌),混匀,25 ℃黑暗条件下振荡培养2-3 hr 。
测OD 600值。
用加入AS 的AAI 培养基稀释菌液至OD 600= 0.15-0.2。
(3)侵染和共培养:取500 µL 菌液于1.5 mL 离心管中,4 ℃、4 000 rpm 条件下离心2 min ,弃上清。
用含200 µmol/L AS 的30 mL AAM 侵染液制成悬浮液(菌液OD 600的终浓度为0.01);挑选一定大小的水稻愈伤组织,放入农杆菌悬浮液中侵染5 min ;取出愈伤组织,置于无菌的滤纸上沥干30-40 min ;将愈伤组织置于共培养培养基(N6-CO )上,在25 ℃暗培养2.5-3 d 。
(4)选择性培养基的配制:1000 × N6 维生素 1mL Glycine 2 g Nicotine acid 0.5 g Piridoxine HCl 0.5 g Thiamine HCl 1 g 定溶至1 L1000 × N6 维生素 1 mL Cassmino acids 0.3 g Proline 2.8 g 蔗糖 30 g 2,4-D 2 mg 定溶至1 L调pH到5.7,加入4.0 g Gelrite,高压灭菌。
当培养基的温度下降到60 ℃时,加入Carbenicillin(500 mg/L)和Hygromycin(50 mg/L),混匀,倒平板。
(5)抗性愈伤组织的选择:取出愈伤组织,无菌水清洗5-6次,其间需不停地振荡。
再用含500 mg/ L Carbenicillin的无菌水清洗1-2遍。
最后置于无菌滤纸上沥干2 hr。
凉干的愈伤组织转入选择性培养基上进行第一轮选择,30 ℃,3000 Lx光照条件下,培养14 d。
具有抗性的初始愈伤组织继代到选择性培养基上进行第二轮选择,30 ℃,3 000Lx光照条件下培养,直到颗粒状抗性愈伤组织生成为止。
(6)配制再分化培养基(MS):Kinetin 2.0 mg/LNAA 0.2 mg/LSorbitol 20 g/LSucrose 30 g/L定溶至 1 L定溶至1 L,调pH至5.7,加入4.0 g Gelrite,高压灭菌,当培养基的温度下降到60 ℃时,加入Carbenicillin(300 mg/L)和Hygromycin(40 mg/L),混匀,倒平板。
(7)配制生根培养基(1/2MS):Sucrose 10 g/LN6 vitamins 5 mL定溶至 1 L调pH至5.7,加入4.0 g Gelrite,高压灭菌,当培养基的温度下降到60 ℃时,加入Carbenicillin(300 mg/L)和Hygromycin(50 mg/L),混匀,倒平板。
(8)抗性愈伤组织的诱导分化:挑取颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗,继代到含有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中,用封口膜封好,恒温培养室中分化培养15-30 d。