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目的基因的连接转化涂板培养课件

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目的基因的连接、转化、涂板培养-刘玥共33页

目的基因的连接、转化、涂板培养-刘玥共33页
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
目的基因的连接、转化、涂板培养-刘 玥
46、法律有权打破平静。——马·格林 47、在一千磅法律里，没有一盎司仁 爱。— —英国
48、法律一多，公正就少。——托·富 勒 49、犯罪总是以惩罚相补偿；只有处 罚才能 使犯罪 得到偿 还。— —达雷 尔
50、弱者比强者更能得到法律的保护 。—— 威·厄尔
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基因的转移 PPT课件

基因的转移 PPT课件

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二、转化的方法
转化大肠杆菌的方法有2类： 1. 感受态细胞法 将宿主细胞制备成感受态，这种细胞容 易接受外源DNA。 2. 电击法（电转化法） 利用电击的方法，在宿主细胞上瞬间打 “洞”，让外源DNA进入细胞内。
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三 感受态细胞的制备
（一）基本概念 由于质粒载体缺失了mob 基因，不能 自行接合转移，必须改变E.coli 质膜的 通透性。 1. 感受态* Compenent 受体细胞经过诱导，产生一种短暂的吸 收外源DNA的生理状态。 2. 感受态细胞 Compenent cells 经物理和化学方法处理，受体细胞膜的 通透性改变，允许外源DNA 进入。
６.符合重组DNA操作的安全标准。
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三、 E.coli受体细胞
1. 特性 用于转化的E.coli 细胞的特点
（1）限制修饰系统缺陷的突变体，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株 （Rˉ，Mˉ），
（2）允许外源DNA 进入E.coli体内，并稳定地遗 传给后代 。
18
2. 受体菌的条件与选择 符合生物安全性的要求。 宿主菌的限制酶和重组酶应为缺陷型。 宿主菌处于感受态。 转化率。 3. 常用E.coli菌株 DH5α、DH10B JM101~JM109 其它
8
体外包装好的重组噬菌体感染受体菌， 使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。每 g DNA能形成106噬菌斑。 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出 来、再次感染另一（受体）细胞时，发 生在供体细胞与受体细胞之间的DNA 转移及重组。

9
图 转导作用
10
（3）体外包装的噬菌体的转导
① 体外包装 in vitro ing 定义：将重组的噬菌体DNA或Cosmid 质粒包装成具有感染能力的噬菌体颗 粒。

第四章目的基因的制备连接导入与基因文库的构建PPT

第四章目的基因的制备连接导入与基因文库的构建PPT
生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能的互补区域
探针等寡聚核苷酸合成
某段连续的氨基酸序列 CysMetAsp Glu Met Lys Arg Asn Ile
所有可能的DNA序列
TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA
平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组
原理在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。
5’p-GATCCCGG-3’
从宿主细胞中提取DNA，用探针杂交。
PCR（Polymerase CysMetAsp Glu Met Lys Arg Asn Ile
TTTTTp 5’ AAAAAOH 3’
cDNA法克隆目的基因的基本战略
双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：
平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组
分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收
例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能 自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克 隆这些新基因，进而研究其生物学功能
差异分离程序 多瘤病毒感染的FR3T3细胞
正常的FR3T3细胞 提取mRNA
总mRNA 共价交联
总mRNA 上柱
病毒诱导表达的基因 cDNA克隆
双链cDNA
AAAAAAAAAAAAAA 其中un） 现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染
cDNA法分离目的基因的基本程序 转化率：103个 / g DNA；

实验三 目的基因的连接、转化

实验三 目的基因的连接、转化
的形成。
1、转化时一般要加一定量的巯基乙醇或 DMSO，其作用是防止细胞被胀破。
2、10 l连接产物可以进行2-3 次转化。
3、热休克作用原理 Ca2+诱导大肠杆菌成为感受态细胞， 感受态细胞经热休克（42oC，45～90 s） 发生收缩作用，使细胞膜出现空隙， 有利于外源基因的导入。
一、 PCR产物的回收
常见的回收方法：
1、冻融法：
1）在UV灯下，用手术刀片切下含DNA片段的琼脂 糖凝胶，-70oC冷冻至少15min；
2）在65oC水浴中使胶融化，加入等倍体积TE-饱合 酚，剧烈振荡30s，-70oC冷冻15min；
3）室温融化后，12,000rpm离心5min，将上层水相 移至另一管中，2.5倍体积乙醇、0.1倍体积 3mol/L NaAc沉淀、漂洗和干燥DNA。
可按下列配方进行连接反应：
回收的PCR产物（DNA片段） T载体 T4 DNA 连接酶buffer
T4 DNA ligase
7 l 1 l 1 l 1 l
终体积
10 l
轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1h。
连接产物可以直接用于转化，也可以置-20oC保存备用。
TA克隆原理
1、TaqDNA聚合酶：PCR产物的3`端突出一个A
实验三 目的基因的连接、转化
转化——
将（重组）DNA分子导入原核细胞的 过程。
本次实验是将重组T载体导入大肠杆菌。
实验三.目的基因的连接、转化
实验内容
1. PCR产物的回收； 2. 连接反应； 3. 感受态细胞的制备； 4. 铺制LB培养平板； 5. 连接产物的转化； 6. 涂板筛选转化成功的大肠杆菌。
2 、挤胶法
（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的 琼脂糖凝胶切下，放入小离心管中；

人教版高中生物必修二第六章第2节基因工程及其应用课件共35张PPT[可修改版ppt]

人教版高中生物必修二第六章第2节基因工程及其应用课件共35张PPT[可修改版ppt]
通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的 “超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、 镉等重金属，分解DDT等毒害物质。
利用基因工程培育的“指示生物”能十分 灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污
染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。
转基因食物的安全性争论
G AA TT C
C TT AA G
C TT AA G
用同种限制酶切割
G AA TT C
G AA TT C
C TT AA G
C TT AA G
黏性末端相同
G AA TT C
C TT AA G
2：基因工程的
“” 作用
指“DNA连接酶
”
将互补配对的两个黏性末端连 接起来，使之成为一个完整的 DNA分子。
人教版高中生物必 修二第六章第2节基 因工程及其应用课
件共35张PPT
第六章第二节
基因工程及其应用
一、基因工程
• 基因工程：又叫基因拼接技术或DNA的重组技
术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生 物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放 到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的性状 。
供体细胞 目的基因
优点：
• 1.解决粮食短缺问题； • 2.减少农药使用，从而减少环境污染； • 3.节省生产成本，降低粮食售价； • 4.增加食物营养，提高附加价值； • 5增加食物种类，提升食物品质； • 6.促进生产效率，带动相关产业发展
转基因食物的安全性争论
缺点：
• 1.可能产生新毒素，和新过敏原 • 2.可能产生抗除草剂的杂草 • 3.可能是疾病的传播跨越物种障碍 • 4.可能会损坏农作物的生物多样性 • 5.可能干扰生态系统的稳定性

基因工程的操作过程课件PPT(ppt64张)

基因工程的操作过程课件PPT(ppt64张)
原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生 在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素
1.转化的原理与技术
（3）l噬菌体DNA的转染
感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基 中培养至OD600
吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟
5'
GCATGCCCCCC G
C GGGGGGACGTC
Klenow
Pst I
5'
GCATGCCCCCCTGCAG
CGTACGGGGGGACGTC
5'
GCATGCCCCCCTGCAG
CGTACGGGGGGACGTC
G 3' GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG 3' G
CTGCAGGGGGG C
5' 5'
5' 5'
3. 不同粘性末端的连接
5'
CTGCAG
GACGTC
PstI
5' 5'
5'
CTGCA 3'
G
G
3' ACGTC
5'
T4-DNA pol
切平
GGATCC CCTAGG
BamHI
5' GATCC G
Klenow
GGATCC
CCTAGG
5'
G CCTAG 5'
补平
5'
C
G
G
C
5'
T4-DNA ligase
80℃烘干固定影印薄膜 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：

第二章目的基因连接及导入 PPT

时在T4DNA连接酶得作用下同样能连接起来。
质粒
产生平末端得 内切酶
目得基因
核酸酶S1
重组质粒
DNA连接 酶
本法适用于在质粒
与目得基因上没有相 同得酶切位点！
(三) 人工接头法
合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割, 产生粘性末端→连接,构建重组DNA。
用接头连接
+
目得基因 质粒
用同一种 限制性内切酶酶切
基因工程之
第六节 重组DNA导入受体细胞
转—重组DNA导入宿主细胞
在目得基因与载体连接成重组DNA分子以 后,下面得重要工作主要就是将其导入受体细 胞进行扩增与筛选,获得大量得重组DNA分子, 这就就是外源基因得无性繁殖,即克隆 (cloning)。
由于外源基因与载体构成得重组DNA分子 性质不同、宿主细胞不同,将重组DNA导入宿 主细胞得具体方法也不相同。
工具酶:基因工程中得工具酶主要包括用于DNA与RNA 分子得切割、连接、聚合、逆转录等相关得各种酶类。
几种重要得工具酶 限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶 逆转录酶
碱性磷酸酶 T4多聚核苷酸激酶
末端脱氧核苷酸转移酶
活性 识别特异碱基序列,切割DNA 催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯键 以DNA为模板合成DNA 以RNA为模板合成cDNA
切除5－末端磷酸 催化核酸5'-羟基磷酸化 催化3'-端合成同聚尾
DNA 连接酶(DNA ligase)能催化双链DNA片段紧靠在 一起得3‘-OH 末端与5’-P末端之间形成磷酸二酯键,使末 端连接。
E. coli DNA 连接酶
只能催化互补粘性 末端之间得连接
T4 DNA 连接酶

生物实验： dna连接与转化ppt课件

DNA的衔接与转化
1.ＤＮＡ分子的体外衔接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的挑选
一．实验目的及背景
▪ 当我们曾经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆〔或表达，转化〕质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进展的就是ＤＮＡ片段 之间的体外衔接，从而获得重组子。
▪ 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达〔如现代基因 工程药物的消费〕，还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研讨中。
质粒转化不同细菌有不同的转化效率转质粒转化不同细菌有不同的转化效率转化效率的高低与实验的成败直接相关化效率的高低与实验的成败直接相关通通常转化效率可达105107转化子常转化效率可达105107转化子获得高转化效率的关键是感受态体菌的制获得高转化效率的关键是感受态体菌的制所谓感受态所谓感受态就是细菌吸收转化因子的生就是细菌吸收转化因子的生理状态
３７℃培育１２～１６小时，察看结果。
四．结果与分析讨论
▪ １．计算转化率。 ▪ ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 ▪ 问题与讨论： ▪ １．根据本实验以为影响转化率的要素有哪
些？ ▪ ２．抗性法挑选和互补挑选原理是什么？
二、转化
▪ １．在1.5ml Eppendorf管中参与２００μl感受态细 胞和１０μl 40ng DNA溶液， 温暖混匀，于冰上３ ０分钟。
▪ ２．于４２℃水浴９０秒。 ▪ ３．冰浴２分钟。 ▪ ４．参与８００μl ＬＢ 液体培育基３７℃ ４５分
钟。 ▪ ５．取２００μl涂布于含Amp(50μg/ml)琼脂糖平皿，
▪ 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而呵斥插入失活，而 使lacZ基因不表达而构成白色菌斑。 经过颜色不同而区分重 组子和非重组子。
二、实验试剂
▪ ＬＢ培育基 ▪ 质粒ＤＮＡ〔含Amp抗生基因〕，受体菌 ▪ CaCl2 0.1M ▪ Amp

目的基因与载体连接PPT课件

为了进一步提高启动子的强度，使目的记忆高效 表达，将上述的lac启动子和trp启动子串联起来，提 高了转录速度。例如pTAC12质粒载体。
病毒载体大都含有较强的启动子，能保证插入的 外源基因有效转录和表达，且转染的效率要高于转化， 因而也长作为目的基因的表达载体。
第9页/共29页
第三节 连接前的处理
第23页/共29页
第六节 人工接头连接
人工接头（衔接物或适配子）：指人工合成的具 有一个或是个特定限制性内切酶识别和切割序列的双 股平端DNA短序列。其分子长度约为8-12bp，具有一定 碱基序列，在其序列内具有一个或多个限制性内切酶 识别位点。利用人工合成的接头可以很方便地将具有 平端的DNA片段结合到可怜载体上。
一般用连接酶将人工接头连接到外源片段的两端， 利用内切酶切割成黏性末端，最后利用连接酶连接。 此方法适用于没有所需限制酶切位点的外源片段。
第24页/共29页
1、人工接头连接平端的DNA片段（图） 2、人工接头连接黏端的DNA片段
注意：人工接头的选择要以外源片段上的限制酶 识别位点为主，要避免二者具有相同的酶切位点，都 在会给后续其它操作带来麻烦。
酸（添加同聚物造成延伸部分）。 如果把所需要的DNA片段加上低聚腺嘌呤核苷酸
（dA），而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸 （dT），那么由于二者之间能形成氢键互补，同样可
（3）、克服载体自身的环化：连接过程中，载体自 身除了环化外，还能形成串联寡聚物。
用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和牛 小肠碱性磷酸酶（CIP）处理载体，去除5’－P使之 不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。图
第18页/共29页
三、双酶切片段的定向克隆 以两种不同的限制性内切酶切割目的基因，使之

基因工程基本操作过程(目的基因和运载体结合)培训课件

（四）人工接头连接法
人工接头（DNA寡核苷酸连杆）是人工合成 的具有一个或数个特定 限制性内切酶识别和 切割序列的双股平端DNA 短序列。 由平端加 上新的酶切位点，再用限制酶切除产 生粘性 末端，而进行粘端连接。
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机会； ③加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效
作用； ④加入单价阳离子（NaCl）。
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当载体和外源DNA片段两端的酶切位点之 间，不可能 找到恰当的匹配时，解决方法：
⑴人工接头连接法：通过依次加入、连接 合成DNA接 头，再用限制酶切加以解决。
转基因动植物由于植入了新的基因，使得动
植物具有了原先没有的全新的性状，这引起了一 场农业革命。如今，转基因技术已经开始广泛应 用，如抗虫西红柿、生长迅速的鲫鱼等。

1997年世界十大科技突破之首是克隆羊的诞
生。这只叫“多利”母绵羊是第一只通过无性繁
殖产生的哺乳动物，它完全秉承了给予它细胞核
上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端的载 体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作用，并 在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合环状结构。
解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载体 DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。
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二、连接前的处理
为了将目的基因重组于载体分子之中， 需要将载体DNA和目的基因分别进行适 当处理，使其可以互相连接，形成新的 重组分子。
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8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90 秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1 －2分钟。
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生长培养基
9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃培养45分钟。
目
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的
掌握目的基因的重组连接原理及方法。
理解蓝白斑筛选鉴定的原理
熟悉重组DNA分子转化受体细胞的基本思路 和方法
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实验总设计
分---PCR分离目的基因 切 接---目的基因与载体相连 转---转入宿主细胞 筛---筛选阳性重组体
3.5μl
5μl
5μl
总体积
10μl
10μl
16℃反应30-60 分钟
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转---转入宿主细胞
感受态细胞 感受态细胞：经过电击、 CaCl2、 RuCl等化
学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成 为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
pMDTM18-T Vector
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仪器与主要试剂：
1. pMDTM18-T Vector （TaKaRa公司） 2. PCR扩增产物 3. T4 DNA连接酶 4. 10×T4DNA连接酶缓冲液
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶 中，37℃振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间
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3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟
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pMDTM18-T Vector
是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用 载体。由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆 位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识 别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3＇ 端添加“T”而成。
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实验器材
器材： 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无 菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分 光光度计,微量移液枪。
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试剂
1.LB琼脂固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无
4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞， 冰浴30分钟
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5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的 冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受 态细胞悬液。
水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至 100ml,高压灭菌。 5. 待转化质粒。
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实验步骤
1.挑取一DH5α单菌落于2.5ml LB培养液中37℃过夜培养
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6.感受态细胞分装成100μl的小份,暂且不用的贮存于70Leabharlann 可保存半年。 取其中一份进行转化。
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7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后 于冰上放置30分钟。
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反应体系
pMDTM18-T Vector连接试剂盒使用说明（TaKaRa公司）
①
②
pMDTM18-T Vector
0.5μl
0.5 μl
PCR扩增产物
4.5μl
Control Insert DNA
1μl
ddH2O Solution I
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接---目的基因与载体相连
原 理：
1. DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添 加一个或者几个A碱基的特性
2. 利用T载体3’末端的T碱基和PCR产物的A碱基 互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接
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实验原理 ---CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细 菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时 处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌 膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA 酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作 用促进细胞对DNA的吸收。
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10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固 体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分 钟
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11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。