载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定

基因⼯程知识要点第⼀章1.基因⼯程:是在分⼦⽔平上进⾏的遗传操作，指将⼀种或多种⽣物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者⼈⼯合成的基因，按照⼈们的愿望进⾏严密的设计，经过体外加⼯重组，转移到另⼀种⽣物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。

2.基因⼯程的基本过程为哪些？切—接—转—增—检①获得⽬的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，⽤内切酶将外源DNA切开。

——切（同时选择运载⽬的基因的载体）②⽬的基因与载体DNA拼接：⽤DNA连接酶将含有外源基因的DNA⽚段接到载体分⼦上，形成DNA重组分⼦。

——接③重组体分⼦导⼊受体细胞：借助于细胞转化⼿段将DNA重组分⼦导⼊受体细胞中。

——转④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分⼦或使其整合到受体细胞的基因组中。

——增⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因⾼效稳定表达的基因⼯程菌或细胞。

——检3.哪些基因是真核⽣物特有的？①假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋⽩质的失活基因。

②基因家族：由功能相关的基因成套组合形成③重复序列哪些是原核⽣物特有的：插⼊序列。

哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因第⼆章1.寄主细胞控制的限制与修饰宿主控制限制——核酸限制性内切酶宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶以λ(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。

（简述寄主控制的限制与修饰现象。

⼤多数细菌的噬菌体侵染都存在着⼀些功能性障碍。

所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。

R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的⼀种是修饰的甲基转移酶——修饰另⼀种是核酸内切限制酶——限制R/M体系的作⽤：保护⾃⾝的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解；2. 简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。

（1）Ⅰ型酶基本特性①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因⼦；③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。

第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。

2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。

4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。

5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。

二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。

在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。

目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。

Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。

Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。

Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。

Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。

限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。

重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。

3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。

5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。

7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。

8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。

并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。

9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。

10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。

【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。

重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。

将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。

1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。

其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。

实验一载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定一、实验目的1.CaCl2法制备感受态细胞2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接）3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Amp r）4.质粒DNA的小量快速制备5.质粒DNA的限制性内切酶酶切6.DNA的琼脂糖凝胶电泳二、实验原理通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组的DNA分子。

受体细胞经处理后（电击或CaCl2等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程称为转化。

由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。

分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离和纯化质粒DNA。

SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH>12.6时，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。

当采用pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。

通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。

三、实验器材和试剂1.器材恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋振荡器、移液枪及枪头、1.5 ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培养管、电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。

2.试剂1)用BamH I和Xba I处理的线状pSV质粒DNA (20 ng/ul)2)用BamH I 和Xba I 处理的4.8 kb c-myc DNA 片段(20 ng/ul)3)已连接好c-myc目的片段的pSV重组质粒DNA (5 ng/ul)4)T4 DNA连接酶(5 U/ul)及10X连接酶缓冲液(Thermo公司)5)LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板(含抗生素)6)0.1 mol/L CaCl/溶液7)AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen公司产品)8)无水乙醇9)BamH I (10 ug/ul)及Xbal I (10 ug/ul) (NEB 公司产品)10)10X Buffer 4 (NEB 公司产品)11)1X TAE ( 0.04 mol/L Tris-乙酸；0.001 mol/L EDTA)12)Y DNA Hind III Markers (0.1 ug/ul) (Thermo 公司)13)6X凝胶加样缓冲液(0.25%溴酚蓝；40% (w/v)蔗糖水溶液)14)氨苄青霉素储存液(100 mg/ml)15)CelRed 核酸染料(10000X in water) (Biotium 公司产品) 四、实验步骤1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接目的基因片段(4.8 kb)，25 ng/ul 4 ul载体DNA (3.5 kb), 25 ng/ul 4 ul10X buffer 1 ulT4 DNA 连接酶(5 U/ul) 0.5 ulddH2O 0.5 ul总体积：10 ul 混匀，16℃水浴锅温浴2. CaCl 法制备感受态细胞21)取0.1 ml大肠杆菌HB101培养物，加至3 ml LB培养液中，37℃振摇约2 h,细胞长至云雾状。

重组dna的技术操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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第五、六章分子生物学研究方法练习题1一、【单项选择题】1.一般的限制性核酸内切酶II作用的特点不包括A.在对称序列处切开DNAB.DNA两链的切点常不在同一位点C.酶切后产生的DNA片段多半具有粘性末端D. DNA两链的切点常在同一位点，E.酶辨认的碱基一般为4-6个4.下列关于建立cDNA文库的叙述哪项是错误的A.从特定组织或细胞中提取mRNAB.将特定细胞的DNA用限制性核酸内切酶切割后，克隆到噬菌体或质粒中,C.用逆转录酶合成mRNA的对应单股DNAD.用DNA聚合酶，以单股DNA为模板合成双链DNA5.限制性核酸内切酶的通常识别序列是A.粘性末端B.RNA聚合酶附着点C.回文对称序列,D.多聚腺苷酸E.甲基化的“帽”结构9.基因工程的操作程序可简单地概括为A.载体和目的基因的分离、提纯与鉴定B.分、切、连、转、筛，C.将重组体导入宿主细胞，筛选出含目的基因的菌株D.将载体和目的基因接合成重组体E.限制性核酸内切酶的应用11.常用质粒有以下特征A.是线性双链DNAB.插入片段的容量比λ噬菌体DNA大C.含有抗生素抗性基因，D.含有同一限制性核酸内切酶的多个切口E.不随细菌繁殖而进行自我复制14.表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是A.大肠杆菌表达体系B.原核表达体系C.酵母表达体系D.昆虫E.哺乳类细胞表达体系，18.在分子生物学上“重组DNA技术”又称为A.酶工程B.蛋白质工程C.细胞工程D.发酵工程E.分子克隆技术22.基因组代表一个细胞或生物的A.部分遗传信息B.整套遗传信息，C.可转录基因D.非转录基因E.可表达基因25.在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A.化学合成法B.基因组文库法C.cDNA文库法D.PCRE.差异显示法27.PCR主要的酶是A.DNA连接酶B.反转录酶C.末端转移酶D.碱性磷酸酶E. Taq DNA聚合酶28.重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶A.DNA聚合酶B.RNA聚合酶C.DNA连接酶D.RNA连接酶E.限制性核酸内切酶30.最常用的筛选转化细菌是否含重组质粒的方法是A.营养互补筛选B.抗药性筛选，C.免疫化学筛选D.PCR筛选E.分子杂交筛选33.用于重组DNA的限制性核酸内切酶，识别核苷酸序列的A.正超螺旋结构B.负超螺旋结构C.α-螺旋结构D.回文结构，E.锌指结构58、基因治疗是指A．对有基因缺陷的细胞进行修复，从而使其恢复正常，达到治疗疾病的目的B．把健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的C．运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变恢复正常D．运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的93．PCR实验的特异性主要取决于A．DNA聚合酶的种类B．反应体系中模板DNA的量C．引物序列的结构和长度D．四种dNTP的浓度E．循环周期的次数94．基因剔除（knock out）的方法主要被用来研究A．基因的结构B．基因的功能C．基因的表达D．基因的调控E．基因的突变95．反义核酸作用主要是A．封闭DNA B．封闭RNAC．降解DNA D．降解DNA E．封闭核糖体的功能105. 酵母单杂交技术是分析【】的实验系统。

第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。

2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。

3. 熟悉转化实验的基本流程，包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。

4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。

二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一，其原理主要包括以下几个方面：1. 基因克隆：通过酶切、连接等操作，将目的基因与载体连接起来，构建成重组质粒。

2. 转化：将重组质粒导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制、表达。

3. 筛选：通过选择性培养基和分子生物学方法，筛选出含有目的基因的转化子。

4. 鉴定：对筛选出的转化子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。

三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。

2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。

3. 细胞：感受态细胞（如大肠杆菌DH5α）。

4. 基因组DNA：目的基因片段和载体DNA。

四、实验步骤1. 目的基因片段的制备：采用PCR技术扩增目的基因片段。

2. 载体DNA的制备：提取载体DNA，进行酶切处理。

3. 基因连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。

4. 转化：将连接产物转化感受态细胞。

5. 涂布培养：将转化后的细胞涂布在选择性培养基上，培养过夜。

6. 筛选：挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。

7. 鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。

五、实验结果与分析1. PCR检测结果：根据PCR检测结果，筛选出含有目的基因的转化子。

2. 酶切鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切，观察酶切图谱，确认重组质粒是否构建成功。

3. 序列鉴定：对酶切鉴定阳性的菌落进行测序，与目的基因序列进行比对，验证其是否正确。

六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。

2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒，并对其进行了鉴定。

目的基因与载体的连接实验报告一、实验介绍基因与载体的连接是分子生物学中非常重要的实验之一，它可以用于构建重组DNA、制备转基因生物等。

本次实验旨在通过将目的基因与载体连接，构建出一个新的DNA分子。

二、实验步骤1. 制备目的基因和载体首先需要制备所需的目的基因和载体。

目的基因可以通过PCR扩增得到，而载体则可以从商家购买或自行制备。

2. 限制性内切酶切割将目的基因和载体使用相同的限制性内切酶进行切割。

这样可以在两端形成互补序列，方便后续连接。

3. 连接反应将经过切割后的目的基因和载体按照一定比例混合，并加入T4 DNA 连接酶进行连接反应。

反应温度、时间等参数需要根据具体实验条件进行调整。

4. 转化大肠杆菌将连接好的DNA分子转化到大肠杆菌中，使其能够复制并表达出来。

这个步骤需要注意细胞状态、转化方法、培养条件等多个方面。

5. 筛选阳性克隆使用适当方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。

常用的方法包括PCR检测、酶切分析、测序等。

三、实验结果在本次实验中，我们将目的基因与载体连接，并成功转化到大肠杆菌中。

经过筛选，最终得到了多个阳性克隆。

其中，PCR检测结果显示，这些克隆中均含有目的基因，并且长度符合预期。

四、实验分析通过本次实验，我们成功地将目的基因与载体连接成一个新的DNA分子，并转化到大肠杆菌中。

这个过程涉及到多个步骤，需要注意细节和条件控制。

在筛选阳性克隆时也需要谨慎处理，以避免假阳性或假阴性结果。

五、实验总结通过本次实验，我们不仅掌握了基因与载体连接技术，还学会了转化大肠杆菌和筛选阳性克隆等操作。

这些技术在分子生物学研究中应用广泛，在未来也将为我们带来更多的科研进展和应用价值。

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要：以质粒pUC19作为载体、λDNA作为外源片段来源，限制性核酸内切酶Hin dⅢ分别对其进行单酶切，产生相同的黏性末端后用T4 DNA连接酶连接从而构建重组质粒，用CaCl2制备E.coli感受态细胞，并用热激法进行重组质粒的转化，培养并用α-互补筛选法进行筛选，最后用试剂盒提取质粒DNA进行检测。

根据在实验过程中所遇到的问题及对结果的分析，探讨关键步骤及影响转化/重组效率的相关因子，并说明实验过程中应当注意的问题。

关键词：DNA酶切连接感受态细胞转化重组子的筛选与鉴定引言：实验目的为掌握限制性核酸内切酶的分类、特性与作用原理以及对DNA进行酶切的实验技术，掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4 DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术，掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理和方法，掌握α-互补筛选法的原理，学习用试剂盒提取质粒DNA的方法，复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。

主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。

限制性核酸内切酶分为三类，Ⅰ型与Ⅲ型：识别位点与切割位点不一致，故同一种酶切产生的片段长度不同；Ⅱ型：固定的识别序列处切割，故每次都产生完全相同的片段。

影响限制性内切酶活性的因素有：DNA纯度，DNA甲基化程度，反应温度，DNA 的分子结构，缓冲液。

DNA连接酶在体内合成DNA某条链上丢失的磷酸二酯键，体外连接反应中，DNA连接酶则需要合成两个磷酸二酯键。

T4-DNA连接酶不需要PEG等就能进行平端的连接，所以实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。

影响DNA连接的因素有：温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。

一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和应用；2. 学习质粒DNA的提取、纯化方法；3. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用；4. 通过酶切鉴定，验证目的基因的插入和表达。

二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme）是一种特殊的核酸酶，能够识别特定的DNA序列并在这些序列上切割双链DNA。

根据识别序列的长度和切割方式，限制性核酸内切酶分为两类：I类酶和II类酶。

其中，II类酶在分子生物学实验中应用最为广泛，如EcoRI、BamHI、HindIII等。

酶切鉴定实验的原理是：通过将目的基因与载体连接，构建重组质粒。

然后，利用限制性核酸内切酶对重组质粒进行酶切，观察酶切后的DNA片段长度，以判断目的基因是否成功插入载体。

三、实验材料1. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、紫外分光光度计等；3. 样品：重组质粒、载体DNA、目的基因DNA等。

四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）取含有重组质粒的细菌，用碱裂解法提取质粒DNA；（2）将提取的质粒DNA进行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，得到纯化的质粒DNA。

2. 重组质粒的构建（1）取目的基因DNA和载体DNA，分别进行PCR扩增；（2）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的基因和载体DNA的大小；（3）利用DNA连接酶和T4 DNA连接酶，将目的基因连接到载体上；（4）转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。

3. 酶切鉴定（1）取重组质粒和载体DNA，分别进行酶切反应；（2）将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的DNA片段长度；（3）根据酶切结果，判断目的基因是否成功插入载体。

4. 结果分析根据琼脂糖凝胶电泳结果，比较重组质粒和载体DNA的酶切产物。

若重组质粒在目的基因插入位点附近出现新的酶切位点，则说明目的基因成功插入载体。

一、实验名称：重组DNA技术二、实验目的：1.了解掌握DNA重组技术理论基础；2.掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法；3.掌握连接产物的转化方法及操作；4.掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法；三、实验原理:1.重组DNA技术重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型的技术。

它主要包括以下几个步骤：①目的基因的获取：主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。

cDNA文库是以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。

常用于筛选编码蛋白质的结构基因。

基因组DNA文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，因此称为基因组DNA文库。

②基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。

分为克隆载体和表达载体。

克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。

表达载体：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物。

选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。

③目的基因与载体的拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。

④重组DNA分子导入受体细胞：将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞，主要有以下几种方法：a、转化：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程。

b、转染：将外源DNA导入真核细胞的过程。

c、感染：以λ噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。

一、实验目的1. 学习重组载体的构建原理和方法；2. 掌握基因克隆、酶切、连接等基本操作；3. 鉴定重组载体的构建成功与否。

二、实验原理重组载体构建是指将目的基因插入到载体中，形成具有特定功能的重组DNA分子。

实验中，通过PCR扩增目的基因，将其与载体进行酶切连接，构建重组载体。

三、实验材料1. 基因组DNA（含有目的基因）；2. 载体DNA；3. 限制性内切酶；4. DNA连接酶；5. DNA标记物；6. 转化试剂；7. 载体宿主菌（如大肠杆菌）；8. PCR试剂；9. 电泳试剂；10. 实验器材。

四、实验步骤1. 目的基因的扩增：以基因组DNA为模板，设计特异性引物，利用PCR技术扩增目的基因。

2. 载体的酶切：分别对载体DNA和目的基因进行限制性内切酶酶切，获得具有相同黏性末端的DNA片段。

3. DNA连接：将酶切后的载体DNA和目的基因进行连接，形成重组载体。

4. 转化：将连接好的重组载体转化到载体宿主菌中。

5. 重组载体的筛选与鉴定：a. 抗生素筛选：在含有抗生素的培养基上接种转化菌，观察菌落生长情况；b. PCR鉴定：提取转化菌的DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否插入载体；c. 酶切鉴定：对PCR鉴定为阳性的转化菌进行酶切，观察酶切图谱与预期结果是否一致；d. 序列分析：对酶切鉴定为阳性的转化菌进行DNA测序，验证目的基因插入载体的正确性。

五、实验结果与分析1. PCR扩增：成功扩增出目的基因片段，大小与预期一致。

2. 酶切：载体DNA和目的基因分别进行酶切，获得具有相同黏性末端的DNA片段。

3. DNA连接：连接反应成功，形成重组载体。

4. 转化：转化菌在含有抗生素的培养基上生长良好。

5. 重组载体的筛选与鉴定：a. 抗生素筛选：转化菌在含有抗生素的培养基上生长，说明已成功转化；b. PCR鉴定：PCR扩增结果显示，转化菌中含有目的基因；c. 酶切鉴定：酶切图谱与预期结果一致，证明目的基因已插入载体；d. 序列分析：DNA测序结果与预期序列一致，验证目的基因插入载体的正确性。

第1篇一、实验目的1. 学习DNA体外重组技术的原理和方法。

2. 掌握重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定技术。

3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。

二、实验原理DNA体外重组技术是指将外源DNA片段与载体DNA片段在体外进行连接，形成重组DNA分子的技术。

通过该技术，可以将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达和功能研究。

三、实验材料1. 载体：pUC19质粒2. 目的基因：基因片段3. 限制性核酸内切酶：EcoRI、BamHI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA聚合酶：Klenow片段6. 琼脂糖凝胶电泳试剂7. DNA标记物8. 转化试剂：CaCl2、SDS、乙醇9. 受体细胞：大肠杆菌DH5α四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计一对引物，引物长度一般为20-25bp，5'端添加EcoRI和BamHI酶切位点。

（2）PCR扩增：以基因片段为模板，引物为引物，进行PCR扩增。

2. 载体的酶切（1）将pUC19质粒和PCR扩增的目的基因分别用EcoRI和BamHI进行酶切。

（2）回收酶切片段：琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段。

3. DNA连接（1）将回收的目的基因片段和载体片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。

（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

4. 转化后细胞的培养与筛选（1）将转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。

（2）取适量菌液进行PCR检测，筛选出阳性克隆。

5. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA。

（2）用EcoRI和BamHI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。

（3）将酶切片段与标记物进行对比，验证重组质粒的正确性。

五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：在PCR产物中，可见一条与预期片段大小相符的条带。

2. 酶切结果：在琼脂糖凝胶电泳中，可见目的基因片段和载体片段的酶切片段。

3. 阳性克隆的鉴定：在琼脂糖凝胶电泳中，可见与预期片段大小相符的条带，证明重组质粒构建成功。