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以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。
当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。
原核表达技术流程PMD19-T载体目的基因的获取TG1感受态制备 PCR 扩增连接重组载体1转化转化细胞1抽取质粒进行电泳,PCR检测阳性邙日性）转化细胞1酶切，获取目的基因TG1感受态细胞PET-28a载体重组重组载体2重组载体2转化BL21感受态转化细胞2抽取质粒进行电泳，PCR检测阳性邙日性）转化细胞2诱导表达蛋白质提取，电泳检测呈阳性目的蛋白原核表达技术及其在相关领域的应用原核表达技术及其在相关领域的应用1基因工程及其应用原核表达载体的构建蛋白质的诱导与表达基因工程：是用分离纯化或人工合成的 DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA用以转化宿主（细菌或其它细胞），筛选出能表达重组DNA勺活细出能表达重组 DNA 筛选出能表达重组DNA勺活细加以纯化、传代、扩增，胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆，成为克隆，产生出人类所需要的基因产物或改造、的基因产物或改造、创造新的生物类型。
生物类型。
Your company slogan基因工程的应用1 •抗虫转基因植物1 •抗虫转基因植物Your company slogan 2•抗病转基因植物 2•抗病转基因植物 Your company slogan 3. The camelecow Your company slogan 其他基因工程产品抗虫害的玉米转鱼抗寒基因的番茄转基因鮭鱼Your com pan yslogan乳汁中含有人生长激素的转基因牛阿根廷）邙阿根廷）转黄瓜抗青枯病基因的甜椒Your company slogan基因工程的应用领域1. 2. 3. 4. 5. 6•蛋白质功能研究生物制药和疫苗生产疾病的基因治疗食品、化工用酶制剂抗虫、抗逆植物改良细胞代谢产物的富集Your company slogan基因工程一般流程人的细胞提取目的基因与运载体DNA拼接拼接与运载体导入细菌（含目的基因细菌含目的基因）含目的基因生产重组蛋【I Your company slogan 基因工程的操作工具核酸分子剪刀-------------------------------- 限制性核酸内切酶一•核酸分子剪刀限制性核酸内切酶识别回文序列，产生粘性或平性末端，识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同DNA片段可连接起来形成重组片段可连接起来形成重组DNA分子，故分子，末端的不同片段可连接起来形成重组分子DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。
分子克隆中平末端常用的连接方法摘要：一、引言二、分子克隆的基本概念1.克隆载体2.目的基因与载体连接3.连接后的筛选与鉴定三、平末端连接方法的优点四、平末端连接方法的常用策略1.T4 DNA连接酶催化连接2.自然连接3.低温促进连接五、平末端连接的实验操作步骤1.准备试剂和材料2.连接反应3.连接产物的转化与筛选六、连接效率的提高与优化1.选择合适的连接酶2.优化连接条件3.筛选高效连接的载体七、平末端连接在其他领域的应用八、结论与展望正文：一、引言分子克隆是基因工程中的一项关键技术，它使得研究者能够将目的基因导入到受体细胞中，实现基因的异源表达。
在分子克隆过程中，连接目的基因与载体是关键步骤之一。
平末端连接作为一种常用的连接方法，在分子克隆实验中具有广泛的应用。
二、分子克隆的基本概念1.克隆载体：克隆载体是一种人工构建的DNA分子，具有多个限制性内切酶切位点，用于携带目的基因并在受体细胞中复制。
2.目的基因与载体连接：在分子克隆实验中，首先需要将目的基因与载体进行连接，形成重组载体。
连接方式有平末端连接、黏性末端连接等。
3.连接后的筛选与鉴定：连接后的重组载体需要进行转化和筛选，以获得具有目的基因的克隆菌。
筛选方法包括抗生素筛选、颜色筛选等。
三、平末端连接方法的优点平末端连接方法具有以下优点：1.不依赖于互补的黏性末端，连接成功率较高；2.连接后的重组载体结构稳定，转化效率较高；3.操作简便，实验条件易于控制。
四、平末端连接方法的常用策略1.T4 DNA连接酶催化连接：T4 DNA连接酶是一种广泛应用于分子克隆的酶，它可以催化平末端DNA分子的连接。
连接反应一般在室温下进行，反应时间约为1-2小时。
2.自然连接：自然连接是指在没有任何外部因素作用下，DNA分子通过碱基互补配对自发连接。
自然连接的效率较低，但在某些特定条件下（如低温、高盐浓度等），连接效率可以得到提高。
3.低温促进连接：低温可以减缓DNA分子的热运动，使其更容易发生配对，从而提高连接效率。
MEGAscript RNAi Kit （High Yield Transctiption Kit for dsRNA Preparation）试剂盒合成双链RNA合成步骤1、构建目的基因载体，选取目的基因的特异性序列（约200bp~300bp），构建到T载体上，测序正确后备用。
2、使用5′端连接有T7启动子的引物PCR扩增目的基因，得到两端均连接有T7启动子序列的目的基因片段，切胶回收目的基因片段，回收的目的基因片段浓度在300ng/ul以上。
3、准备合成双链RNA<1>、向2×Wash Solution添加12毫升的100%分析纯酒精，混合均匀后室温保存。
<2>、使用前将10×T7 Reaction Buffer 和ATP、CTP、GTP、UTP四种ribonucleotide solution 涡旋震荡，使溶液混合均匀，离心后待用。
其中10×T7 Reaction Buffer使用时放置在室温条件下，切勿放在冰上，其他溶液置于冰上。
<3>、合成双联RNA的反应体系Amount Component定容到20ul 无核酸酶的纯水1~2ug 线性的模板DNA2ul 10×T7 Reaction Buffer2ul ATP Solution2ul CTP Solution2ul GTP Solution2ul UTP Solution2ul T7 Enzyme Mix将配置好的反应液轻轻混匀后短暂离心。
<4>37℃反应2~4小时。
如果线性DNA模板小于400nt，增加反应时间（最高至16小时）可以增加产物量。
37℃反应结束后，75℃孵育5分钟，产物自然冷却的过程中RNA退火形成双链，75℃孵育结束后，切勿把产物放在冰上冷却。
4、核酸酶消解DNA和单链RNAAmount Component20ul dsRNA21ul 无核酸酶的纯水5ul 10×Digestion Buffer2ul DNaseI2ul RNase37℃孵育1小时5、纯化合成的双链RNA配制dsRNA结合反应液Amount Component50ul dsRNA50ul 10×Binding Buffer150ul 无核酸酶的纯水250ul 100%乙醇将反应液轻轻混合均匀。
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
一、首先根据选用的目的载体上的酶切位点来设计引物，用带有酶切位点的引物对目的基因进行PCR扩增，回收扩增产物，将目的基因和载体分别酶切回收，然后连接转化，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒酶切鉴定就OK了1、设计引物引入酶切位点，该酶切位点必须是目的片段所没有的，PCR出目的片段，回收片段2、酶切目的片段和载体过夜，胶回收，连接转化，涂相应抗生素LB板3、挑取阳性克隆，摇菌过夜提取质粒，酶切鉴定，测序，以测序结果为准二、构建载体的时候，先用设计好的引物PCR所要的目的基因，再和T载体连接，再转化，再小抽，再双酶切，再和悬赏分：20 |解决时间：2011-5-15 22:28 |提问者：xindu19881988已经预先双酶切的目的载体连接，那么？先前的目的基因为什么不直接和目的载体相连呢？为什么还要经过T载体这一步呢？（所用引物未使用保护碱基），是什么原因呢？最佳答案理论上讲PCR产物可以直接酶切连接反应。
但是，以PCR产物酶切的时候没有办法证明双酶切是否成功、彻底（PCR产物会有ployA的存在必须切掉，但是PCR产物和酶切产物大小差别不大）。
而以T载体为媒介，双酶切T载体，跑胶检测可以很清楚的看到酶切产物，并特异回收。
四、目的：构建目的基因的真核表达载体一.PCR扩增得到目的片段1.引物的设计与合成：这里有很多血与泪的教训。
我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。
最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基），后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次送了五个克隆测序，三个是上游引物出错，两个是正确的克隆，60％的出错率。
现在想想，有几点教训：(1)尽量避免长引物的合成。
越长意味着出错的几率越大，哪家公司都这样(2)选择一家质量可靠的公司，千万别在这省钱，引物再贵也花不了多少钱，可一轮构建下来，一测序发现引物错了，不知白扔了多少钱不说，那种心情实在是难以收拾（3）一旦发现引物有问题，及时换公司，我就让他们拿回去又是纯化又是重新合成过，结果还是错，时间咱耽误不起2.Pfu酶扩增：（1）扩增效率低的问题：往往taq酶扩的很好，一换成pfu就是扩不出来。
T载体克隆连接原理、制备及载体序列T载体的定义：T载体（T-Vector）是一种高效克隆 PCR 产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。
T载体的作用原理：大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。
因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提高了PCR产物连接和克隆的效率。
T载体进行TA克隆的优势：相对于另一种非定向克隆——平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、高效、一步到位的非定向克隆法。
有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率高。
T载体的制备：：1 商业化T载体：一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72～75℃反应，进行末端的加T。
2 自制T载体：一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下：其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。
由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3’ T末端。
相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。
一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。
连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。
[3]常见T载体及序列：虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。
第1篇一、实验目的1. 掌握转基因技术的基本原理和操作流程。
2. 学习拟南芥转基因方法，包括农杆菌介导转化和基因枪法。
3. 鉴定转基因植株，并分析其遗传稳定性。
二、实验材料与试剂1. 拟南芥植株（野生型、突变型）2. 农杆菌菌株（如Agrobacterium tumefaciens C58）3. 转基因载体（含目的基因、抗生素抗性基因）4. 培养基、抗生素、除草剂等5. PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA测序仪等三、实验方法1. 目的基因克隆：根据目的基因序列设计引物，从基因库中克隆目的基因，并进行测序验证。
2. 构建转基因载体：将目的基因克隆到载体上，并插入抗生素抗性基因作为筛选标记。
3. 农杆菌转化：将转基因载体转化农杆菌，制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选：将转化介质喷洒或浸泡拟南芥植株，筛选出转基因植株。
5. PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否成功插入。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析：通过自交、回交等手段，分析转基因植株的遗传稳定性。
四、实验结果与分析1. 目的基因克隆：成功克隆目的基因，并进行测序验证。
2. 构建转基因载体：成功构建转基因载体，并插入抗生素抗性基因。
3. 农杆菌转化：成功转化农杆菌，制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选：通过喷洒或浸泡转化介质，成功筛选出转基因植株。
5. PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，成功检测到目的基因。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析：通过自交、回交等手段，分析转基因植株的遗传稳定性，结果表明转基因植株遗传稳定性良好。
五、实验讨论1. 农杆菌转化法是一种常用的植物转基因方法，具有操作简便、转化效率高等优点。
2. 在转基因过程中，抗生素抗性基因作为筛选标记，可以有效筛选出转基因植株。
3. PCR检测是鉴定转基因植株的重要手段，可以快速、准确地检测目的基因是否成功插入。
4. 遗传稳定性分析是评估转基因植株遗传特性的重要环节，有助于确保转基因植物的安全性。
PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。
载体可用EcoR V 或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，PCR产物也可不加处理。
如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。
平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。
最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。
如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。
另一类利用部分PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。
一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。
也可以用末端转移酶来完成加T反应。
载体自连、PCR产物串连可以忽略。
如果使用ddTTP，效果会更好。
这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。
一、PCR产物的TA克隆1. TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。
其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。
一. 重组质粒的构建 T质粒载体重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA 连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
二. 感受态制备原理细菌在0°C CaCl低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易2吸收外源DNA的感受态。
三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。
现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。
另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。
在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。
只有当携带α配制每升培养基,应该在950 ml去离子水中加入:胰化蛋白胨 10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.（ 100mlLB培养基加入琼脂粉为固体培养基）LCaCl2：取氯化钙固体定容至10mlAmp（100mg/ml）：溶解氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml，用μm滤膜过滤除菌.（一）.目的基因片段与载体连接器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。
试剂T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 。
操作步骤PCR产物与T载体直接连接：（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°C。
（2）取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整） 4ml 目的基因；1ml T载体； T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）；1ml 连接酶缓冲液10 x buffer ；ml dd Water ，总量10ml 体系。
（3）述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C干式恒温仪（或14°C 水中）中保温过夜（12-16h）。
（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
（二）. 大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化仪器：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器试剂： E. coli菌种，LB培养基， mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water ，LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG，X-gal。
步骤（1）在超净工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100ml LB液态培养基（不含抗菌素），37℃摇床培养过夜。
（2）取上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min 摇床培养2~3h，测定OD590为~左右（<~，细胞数<108/mL，此为关键参数！）。
（注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的LB培养液同时摇菌）（3）将1ml菌液加入到4支预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心5min。
（4）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。
（5） 4℃，5000rpm离心5min，弃上清液后，用100μL 冰冷的 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置2h，可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。
（6）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（7）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（8）加入5μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（9）轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。
（10）在超净工作台中向上述各管中分别加入300μL LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。
（11）在超净工作台中取上述转化混合液200μL，分别滴到含合适抗菌素（Amp 100ug/L）的固体LB平板培养皿中，再在平板上滴加40μL 20mg/ml X-gal，7μL 200mg/ml IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：一个不含抗生素作为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
）。
（12）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
（13）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。
（14）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。
注意白色菌斑。
（三）. 转化克隆的筛选和鉴定器材旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。
试剂LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油，L MgSO4，L Tris Cl ）。
操作步骤方法一：快速PCR筛选法（1）在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。
（2）在 PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。
dd water 16μl10×PCR buffer（不含MgCl2）μl25mM MgCl2 μlL dNTP 2μl（每种dNTP终浓度）10μmol/L Primer1 1μl（—25pmoles）10μmol/L primer2 1μl（—25pmoles）模板质粒用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗Taq酶μl（）总体积 25μl（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ）：①94℃5min ②94℃1min ③60℃1min ④72℃1min50s⑤goto②29 times ⑥72℃10min （2） PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时比对）。
观察胶上是否有预计的主要产物带。
（3）按照编号找到培养皿中的原菌斑。
根据需要进行放大培养提取其质粒（4）提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，以进一步确认。
方法二：提质粒再PCR或酶切鉴定（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。
（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。
用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。
用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。
（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。
摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。
（4）提取到的3管质粒样品可用PCR法扩增，或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插入片断（方法见有关实验）。
（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。
按照编号找到冰箱中原菌液。
根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL菌液与500mL 65%甘油混合后-80℃保存。
（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。
