热带念珠菌对氟康唑耐药机制的初步研究

抗真菌耐药性的全球问题：流行、机制与管理黄郑雨【摘要】所有严重的真菌感染都需要适当的抗真菌治疗才能取得成功.目前只有少数几类抗真菌药物可用.单一药物耐药性和多药耐药性严重妨碍了对病人的治疗.念珠菌和曲霉的唑类药物耐药是临床上最大的挑战之一,其次是念珠菌属(尤其是光滑念珠菌)的棘白菌素耐药和多药耐药.农业衍生的耐唑烟曲霉以及多重耐药耳道白色念珠菌的出现和传播给人类健康带来了新的威胁.耐药的分子机制在不太敏感菌株中自然发生,并在敏感菌株中快速获得.耐药机制包括药物与靶标相互作用的改变,药物外排泵介导降低细胞内药物浓度,以及与生物膜相关的通透性屏障.虽然耳道念珠菌天生多药耐药,但其它菌株通常通过逐步选择耐药机制而产生多药耐药性.药物处理引起的细胞应激反应促进了细胞的适应,从而导致细胞耐药性的出现.控制耐药性的举措包括有效的抗真菌药物管理计划,快速真菌诊断,治疗药物监测和临床干预.开发更好的诊断工具和有针对性地使用抗真菌药物的策略,对于保持药物效力至关重要.【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》【年(卷),期】2018(039)005【总页数】8页(P前插1-前插2,357-362)【关键词】耐药性;流行;机制;管理【作者】黄郑雨【作者单位】西南大学药学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】R978.51 前言真菌病原体可引起危及生命的侵袭性疾病(如真菌血症、脑膜炎、肺炎)、严重的慢性疾病(如慢性肺曲霉菌病、过敏性支气管肺曲霉菌病)和复杂的慢性呼吸道疾病(如哮喘、慢性阻塞性肺病)。

这些病原体还会引起反复感染，如口腔和阴道念珠菌病。

病人的免疫抑制是罹患侵袭性真菌感染的重要原因。

这些感染常伴随高死亡率，成功的临床治疗效果需要早期诊断和有效的抗真菌治疗。

然而，抗真菌药物的选择很少，治疗侵袭性疾病的药物仅限于唑类化合物、棘白菌素、多烯类和氟胞嘧啶。

过去的十年，毒性较小药物的开发为抗真菌预防使用和疾病治疗做出了贡献，然而这反过来又导致了耐药性的增加。

念珠菌耐药机制的研究进展贺小圆;赵明峰【摘要】In recent years,the incidence and mortality of fungal infection,especially the opportunistic fungal infection have been increasing.This is mainly associated with antifungal resistance and the restricted number of available antifungal drugs.Candida species are opportunistic fungi in human body.The common antifungal resistance mechanisms include the changes of the target enzyme,the lack of target site,the drug permeability decline of fungal cell membrane,the increased expression of multi⁃drug resistance protein,the change of cholesterol synthesis bypass,the biofilm formation and so on. The latest literature reports that secreted aspartic proteinases have a role in antifungal resistance of Candida spp..In this article,the epidemiology of Candida spp.infection and its possible antifun⁃gal resistance mechanisms are reviewed briefly.%近年来，真菌感染尤其是机会性真菌感染的发生率和病死率呈不断上升的趋势，这主要与真菌耐药和抗真菌药物品种有限有关。

㊃论著㊃白念珠菌对氟康唑耐药机制的研究封小川1,2 元航1 郑莹莹1,3 白江苗1 张欠欠1(1.延安大学医学院,延安716000;2.延安市人民医院,延安716000;3.延安大学附属医院,延安716000)ʌ摘要ɔ 目的 通过研究白念珠菌对氟康唑耐药相关基因E R G 11㊁C D R 1㊁C D R 2和MD R 1的表达水平及其与耐药的关系,旨在对本地区以白念珠菌感染为主的侵袭性念珠菌病的防治提供依据㊂方法 选取延安地区两家三甲医院临床确诊的对氟康唑耐药及敏感的白念珠菌各10株,扩增其靶酶编码基因E R G 11,分析突变位点;使用荧光染料罗丹明6G 分析耐药组与敏感组菌株的外排情况;采用荧光定量P C R 检测白念珠菌外排泵编码基因的表达水平㊂结果 E R G 11扩增测序结果显示,耐药菌株C 3号虽发生了碱基位点突变,但并未引起编码氨基酸的改变,耐药菌株C 7号及敏感菌株C 12号发生了碱基位点的突变,引起编码氨基酸的改变;荧光染料罗丹明6G 检测白念珠菌外排实验结果显示,耐药菌和敏感菌无论加入葡萄糖与否外排均存在显著差异,且耐药组加入葡萄糖较未加入葡萄糖外排量明显增加,差异有统计学意义(P <0.01);R T -P C R 检测外排泵基因结果显示,C D R 1与C D R 2外排泵基因表达水平在耐药菌与敏感菌之间差异有统计学意义(P <0.05)㊂结论 研究基因表达及外排泵功能检测结果均表明,本地区白念珠菌对氟康唑的耐药机制主要与外排泵基因过度表达相关,未发现靶酶编码基因有意义的突变㊂ʌ关键词ɔ 氟康唑;耐药机制;E R G 11;C D R 1;C D R 2ʌ中图分类号ɔ R 379.4 ʌ文献标志码ɔ A ʌ文章编号ɔ 1673-3827(2023)18-0481-06S t u d y on t h e m e c h a n i s m o f f l u c o n a z o l e r e s i s t a n c e i n C a n d i d a a l b i c a n s F E N G X i a o c h u a n 1,2,Y U A N H a n g 1,Z H E N G Y i n g y i n g 1,3,B A I J i a n g m i a o 1,Z HA N G Q i a n qi a n 1(1.M e d i c a l C o l l e g e o f Y a n a n U n i v e r s i t y ,Y a n a n 716000,C h i n a ;2.Y a n a n P e o p l e s H o s p i t a l ,Y a n a n 716000,C h i n a ;3.Y a n a n U n i v e r s i t y A f f i l i a t e d H o s pi t a l ,Y a n a n 716000,C h i n a )ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o s t u d y t h e e x p r e s s i o n l e v e l s of f l u c o n a z o l e r e s i s t a n tg e n e s E R G 11,C D R 1,C D R 2,a n d MD R 1i n C a n d i d a a l b i c a n s a n d th ei r r e l a t i o n s h i p w i t h d r u g re s i s t a n c e ,a n d t o p r o v i d e a b a s i sf o r t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f i n v a -s i v e c a n d i d i a s i s m a i n l y c a u s e d b y C a n d i d a a l b i c a n s i n f e c t i o n i n t h i s r e gi o n .M e t h o d s T e n f l u c o n a z o l e r e s i s t a n t s t r a i n s a n d 10f l u c o n a z o l e s e n s i t i v e s t r a i n s w e r e s e l e c t e d f r o m e a c h h o s p i t a l i n t w o t e r t i a r y a n d f i r s t -c l a s s h o s p i t a l s i n Y a n 'a n a r e a .A m -p l i f y i n g t h e t a r g e t e n z y m e c o d i n g g e n e E R G 11,a n a l y z i n g t h e m u t a t i o n s i t e s ,f l u o r e s c e n t d y e u s i n g rh o d a m i n e 6G w e r e u s e d t o a n a l y z e t h e e f f l u x o f s t r a i n s f r o m d r u g r e s i s t a n t a n d s e n s i t i v e g r o u p s .T h e n ,f l u o r e s c e n c e qu a n t i t a t i v e P C R w a s u s e d t o d e -t e c t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e g e n e e n c o d i n g t h e e f f l u x p u m p o f C a n d i d a a l b i c a n s .R e s u l t s E R G 11a m p l i f i c a t i o n a n d s e -q u e n c i n g r e s u l t s s h o w e d t h a t a l t h o u g h t h e r e s i s t a n t s t r a i n C 3h a d a b a s e s i t e m u t a t i o n ,i t d i d n o t c a u s e c h a n g e s i n t h e c o d i n ga m i n o a c i d .T h e r e s i s t a n t s t r a i n C 7a n d t h e s e n s i t i v e s t r a i n C 12h a d ab a s e s i t e m u t a t i o n ,c a u s i n g c h a n g e s i n t h e c od i n g am i -n o a c i d ;f l u o r e s c e n t d ye r h o d a m i n e 6G w a s u s e d t o d e t e c t t h e ef f l u x o f C a n d i d a a l b i c a n s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e e f f l u x o f r e s i s t a n t i s o l a t e a n d s e n s i t i v e i s o l a t e w e r e s ig n i f i c a n t l y d i f f e r e n t wh e t h e r g l u c o s e w a s a d d e d o r n o t ,a n d t h e e f f l u x o f d r u gr e s i s t a n t i s o l a t e w i t h g l u c o s e w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t w i t h o u t g l u c o s e ,a n d t h e d i f f e r e n c e w a s s t a t i s t i c a l l y s i gn i f i -c a n t (P <0.05);t h e R T -P C R d e t e c t i o n o f e f f l u x p u m p g e n e s s h o w e d a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f C D R 1a n d C D R 2e f f l u x p u m p g e n e s b e t w e e n d r u g-r e s i s t a n t a n d s e n s i t i v e i s o l a t e (P <0.05).C o n c l u s i o n T h e r e -s u l t s o f g e n e e x p r e s s i o n a n d e f f l u x p u m p f u n c t i o n t e s t i n g i n t h i s s t u d yi n d i c a t e t h a t t h e r e s i s t a n c e m e c h a n i s m o f C a n d i d a a l -b i c a n s t o f l u c o n a z o l e i n t h i s r e g i o n w a s m a i n l y r e l a t e d t o o v e r e x p r e s s i o n o f e f f l u x p u m p g e n e s ,a n d n o s i g n i f i c a n t m u t a t i o n s w e r e f o u n d i n t h e t a r g e t e n z y m e c o d i n g ge n e s .基金项目:陕西省重点研发计划项目(2021S F -230);榆林市科技项目(C X Y -2020-064);延安大学校产学研项目(C X Y 202121)作者简介:封小川,女(汉族),硕士,主治医师.E -m a i l :x i a o c h u a n 880112@163.c o m 通信作者:张欠欠,E -m a i l :z h a n g q i a n yd @163.c o m ㊃184㊃ 中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M yc o l ,D e c e m b e r 2023,V o l 18,N o .6ʌK e y w o r d sɔf l u c o n a z o l e;d r u g r e s i s t a n c e m e c h a n i s m s;E R G11;C D R1;C D R2[C h i n J M y c o l,2023,18(6):481-486]近年来,世界范围内以白念珠菌感染为主的侵袭性念珠菌病呈上升趋势,全球S E N T R Y抗真菌监测显示,在欧洲,白念珠菌引起的感染占念珠菌属的52.5%㊁亚太地区为46.0%㊁拉丁美洲为43.9%㊁美国和加拿大为42.7%[1],我国流行病学调查显示[2-3],白念珠菌引起的感染占念珠菌属的65%,个别地区甚至大于70%,在免疫功能低下者和植入医疗设备的健康人中白念珠菌的感染率居首位,感染病死率高达68.9%[4],美国每年也会因置入导管引发的白念珠菌感染造成约10万人死亡[5]㊂美国感染病学会(I D S A)指出氟康唑是既往非粒细胞缺乏念珠菌血症患者初始治疗及I C U中高危患者侵袭性念珠菌感染预防的首选药物[6],在发展中国家,三唑类药物(如氟康唑等)是治疗侵袭性念珠菌感染尤其是白念珠菌感染的主要药物[7]㊂但随着氟康唑在临床上的长期广泛应用,致使白念珠菌对氟康唑的耐药性不断增强,据美国疾控中心(C D C)统计,在感染念珠菌患者的血液样本中,约有7%对氟康唑耐药[8]㊂全球S E N T R Y监测显示[9],白念珠菌对氟康唑的耐药率为11.9%,我国白念珠菌对氟康唑的耐药率小于6%,剂量依赖性敏感(S D D)率为4.35%[10],这势必给临床治疗白念珠菌引发的疾病过程中带来严峻考验㊂文献报道显示[11-13],白念珠菌对氟康唑耐药机制主要是靶酶编码基因E R G11的突变和外排泵编码基因过表达,但由于不同地区白念珠菌的感染及其耐药不同,其耐药机制亦不尽相同,因此,本文通过研究白念珠菌对氟康唑耐药相关基因E R G11㊁C D R1㊁C D R2和MD R1的表达水平及其与耐药的关系,探究延安地区白念珠菌对氟康唑的耐药机制,对管理目前有限的抗真菌药物,以及为患者提供精准治疗服务至关重要㊂1材料和方法1.1材料菌株收集延安市两家三甲医院送检并经鉴定为白念珠菌且对氟康唑耐药和敏感的菌株各10株,耐药菌株编号C1-C10,敏感菌株编号C11-C20㊂标准质控菌株:白念珠菌A T C C90028㊂纳入标准:①经质谱鉴定为白念珠菌;②根据美国临床实验室标准化研究所(C L S I)判断标准[14],敏感(S):M I Cɤ8μg/m L,耐药(R):M I Cȡ64μg/m L,药敏结果复核为白念珠菌对氟康唑耐药及敏感菌株;③所有操作均符合实验室操作标准㊂主要试剂和仪器 Y e a s t O n e p l a t e真菌药敏板试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)(批号:280543)㊁T a q D N A聚合酶(北京百奥莱博科技有限公司)(批号:J N0015)㊁逆转录试剂盒(广州赛国生物科技有限公司)(批号:70060000)㊁罗丹明6G(西亚化学试剂商店)(批号:20211115)㊁V I T E K M S全自动快速质谱微生物检测系统(法国梅里埃公司)㊁A B I7300型全自动荧光定量P C R 仪(美国A B I公司)㊁C y t o m i c s500流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)㊁N a n o d r o p O n e超微量分光光度计(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)㊁T a n o n3500型凝胶成像分析系统(上海天能有限公司)㊂1.2方法E R G11基因扩增并测序白念珠菌D N A的提取:菌株培养㊁离心后,提取出白念珠菌D N A,与5μL样品混合均匀后进行电泳约55m i n,应用电脑成像系统进行凝胶相片拍摄㊂以G e n B a n k公布的白念珠菌标准菌株E R G11基因序列数据为准, P C R引物设计:E R G11F:5 -A T G G C T A T T-G T T G A A A C T G T C A T T G-3 (第1~25位)㊁E R G11 R:5 -T T A A A A C A T A C A A G T T T C T C T T T T T-T C C-3 (第1560-1587位)㊂罗丹明6G在试验菌株中外排情况的测定①实验菌株经离心㊁预冷,重悬于P B S使葡萄糖耗尽,加入罗丹明6G后将试管放于冰面上,然后在菌液中加入P B S混合均匀㊁离心,用流式细胞仪进行分析记录,此时菌株的荧光强度设为外排前的起始荧光强度;②洗3次预冷P B S,将多余的罗丹明6G去除后分为两管,一管50μL菌液加入1m L P B S,另一管50μL菌液加入1m L P B S,离心加入P B S混合均匀,运用流式细胞仪分析,将未用罗丹明6G处理的菌株细胞的荧光强度作为自身荧光对照;③将摄取罗丹明6G之后的细胞荧光强度作为基底,分别减去加与不加葡萄糖外排之后的细胞㊃284㊃中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2023,V o l18,N o.6荧光强度,进行数据分析㊂白念珠菌外排泵基因表达的检测 白念珠菌外排泵基因引物序列见表1㊂表1 白念珠菌外排泵基因引物T a b .1 G e n e p r i m e r s o f C a n d i d a a l b i c a n s e f f l u x p u m p 序列名称片段片段大小18S r R N AF :5'-T CG G G G G T A T C A G T A -T T C A G T T G T C -3'83b pR :5'-T C C T T G G T A A A T G C T T T -C G C A G T A G -3'C D R 1F :5'-TG A C T C C T G C T A C C G T G T -T G -3'194b pR :5'-A C C T G G A C C A C T T G G A A -C A T -3'C D R 2F :5'-C C TG G A A G C A C A G T T G T C -C A -3'161b pR :5'-T C C C C C T T T T G C A T A G C A -C C -3'MD R 1F :5'-G G G T G C T G T T T G T G G T C C -T A -3'196b pR :5'-A C C G G T G A T G G C T C T C A A -T C -3'A C T 1F :5'-TG G A C G G T G A A G A A G T T G -C T -3'184b pR :5'-T T G G A T T G G G C T T C A T C A -C C A -3'P MA 1F :5'-A C CG T T G C C G A A T T T G C T T -C -3'194b pR :5'-G C A A T A C C A A C G G C A T C A -C C -3'白念珠菌总R N A 的提取 采用T r i z o l 法提取白念珠菌总R N A ,R T -P C R 扩增外排泵基因严格按照试剂盒说明书进行操作㊂P C R 反应条件:94ħ预变性3m i n ,94ħ变性10s ,55ħ退火20s ,72ħ延伸30s ,40个循环㊂收集荧光阈值(c yc l e t h r e s h o ld ,C t ),将核糖体基因18S r R N A 设定为内参基因,用相对定量әC t 表示(әC t =C t 目的基因-C t 18S )并进行分析,其中әC t 值越小,相对基因表达量越高,反之则越低,见图1及图2㊂1.3 统计学分析采用S P S S 25.0统计软件分析,计量资料均用 x ʃs 表示,采用t 检验,检验水准α=0.05,P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 E R G 11基因的检测结果实验菌株E R G 11基因P C R扩增的产物经纯图1 实验菌株R T -P C R 溶解曲线 图2 实验菌株R T -P C R 扩增曲线F i g.1 R T -P C R d i s s o l u t i o n c u r v e o f e x p e r i m e n t a l s t r a i n F i g.2 R T -P C R a m p l i f i c a t i o n c u r v e o f e x p e r i m e n t a l s t r a i n s 化并测序,测序结果与G e n B a n k 中的标准序列X 13296进行比对分析,发现氟康唑耐药的C 3号菌株第414位碱基发生了突变GңA ,但并未引起第118位氨基酸甘氨酸(G l y )密码子的改变;氟康唑耐药的C 7号菌株及对氟康唑敏感的C 12号菌株的第518位碱基发生了突变CңG ,引起第173位氨基酸密码子改变,致脯氨酸(P r o )变为精氨酸(A r g),见图3~6及表2㊂表2 白念珠菌E R G 11基因突变及对应氨基酸改变T a b .2 M u t a t i o n o f E R G 11g e n e a n d c o r r e s p o n d i n g am i n o a c i d c h a n ge s i n C a n d i d a a l b i c a n s 菌株编号碱基突变位点氨基酸变化C 3G 414A G 118G C 7C 518G P 173R C 12C 518GP 173R注:C 12为敏感菌株,C 3和C 7为耐药菌株㊂2.2 罗丹明6G 的外排情况结果显示,敏感株在摄取罗丹明6G 后,未加葡萄糖几乎不发生外排,加葡萄糖后略有外排,但二者比较差异无统计学意义(P >0.05);耐药株在摄取罗丹明6G 后,无论加葡萄糖与否均发生外㊃384㊃ 中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M yc o l ,D e c e m b e r 2023,V o l 18,N o .6图3白念珠菌E R G11基因扩增D N A凝胶电泳图图4耐药组白念珠菌C3碱基峰值图图5耐药组白念珠菌C7碱基峰值图图6敏感组白念珠菌C12碱基峰值图F i g.3 A m p l i f i e d D N A g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f C a n d i d a a l b i c a n s E R G11g e n e F i g.4 C3b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n d r u g r e s i s t a n c e g r o u p F i g.5 C7b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n d r u g r e s i s t a n c e g r o u p F i g.6 C12b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n s e n s i t i v e g r o u p排,加葡萄糖较未加葡萄糖的外排量增加,二者比较差异具有统计学意义(P<0.01);将耐药组株对罗丹明6G的外排与敏感组菌株对罗丹明6G的外排量进行分析,耐药组罗丹明6G的外排量明显高于敏感组,差异具有统计学意义(P<0.01),见表3和图7㊂表3白念珠菌耐药组与敏感组罗丹明6G外排实验结果比较T a b.3 C o m p a r i s o n o f r h o d a m i n e6G e f f l u x t e s t r e s u l t s b e t w e e nd r u g-re s i s t a n t g r o u p a n d s e n s i t i v e g r o u p of C a n d i d a a l b i c a n s分组耐药组(n=10)敏感组(n=10)t P未加葡萄糖外排能力5.47ʃ0.530.45ʃ0.2327.621<0.01加入葡萄糖后外排能力7.77ʃ0.80.44ʃ0.2527.526<0.01 t-11.6020.44P<0.01>0.052.3 R T-P C R测定外排泵基因表达水平统计学分析显示,耐药组和敏感组肌动蛋白相关基因A C T1和质膜H+-A T P酶编码基因P MA1的表达水平相比较,差异无统计学意义(P >0.05);耐药组C D R1和C D R2外排泵基因表达量较敏感组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),图7敏感和耐药白念珠菌罗丹明6G外排实验结果F i g.7 R e s u l t s o f r h o d a m i n e6G e f f l u x t e s t o f s e n s i t i v e a n d d r u g-r e s i s t a n t C a n d i d a a l b i c a n s见表4和图8㊂表4白念珠菌主动外排泵基因在敏感组与耐药组相对表达水平的比较(әC t值)T a b.4 C o m p a r i s o n o f r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s o f a c t i v e e f f l u x p u m p g e n e o f C a n d i d a a l b i c a n s b e t w e e n s e n s i t i v e g r o u p a n d d r u g r e s i s t a n t g r o u p外排基因耐药组(n=10)敏感组(n=10)t PC D R16.42ʃ0.905.00ʃ0.863.589<0.01 C D R27.75ʃ1.116.30ʃ1.033.040<0.01 MD R19.74ʃ0.719.05ʃ1.141.616>0.05 A C T18.15ʃ0.318.16ʃ0.42-0.030>0.05 P MA18.04ʃ0.118.07ʃ0.14-0.612>0.05㊃484㊃中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2023,V o l18,N o.6图8敏感和耐药白念珠菌外排泵基因的表达量F i g.8 E x p r e s s i o n o f e f f l u x p u m p g e n e i n s e n s i t i v e a n d d r u g-r e s i s t-a n t C a n d i d a a l b i c a n s3讨论全世界每年由念珠菌引起的深部器官感染病例40万以上,病死率超过45%[15],尤其白念珠菌的发病率㊁致死率明显上升㊂唑类药物中的氟康唑是临床早期经验治疗白念珠菌感染尤其作为高危人群预防白念珠菌感染的首选药物,使其在人体内长期处于亚治疗水平,引起耐药性增加[16],白念珠菌耐药是目前临床治疗其感染失败的一个重要原因,研究报道,E R G11基因错义突变可使氟康唑抗真菌的作用靶点去甲基化酶C Y P51的血红素表面结合位点发生变化,从而使氟康唑无法与白念珠菌有效结合而致耐药[17],而且白念珠菌细胞膜上的外排泵活力增强也是白念珠菌对氟康唑耐药的主要机制之一[18]㊂本研究中靶酶编码基因E R G11的目的基因扩增测序中虽然引起氨基酸的改变,即耐氟康唑的C7号菌株及对氟康唑敏感的C12号菌株的第518位碱基发生了突变,引起第173位氨基酸密码子改变,致P r o变为A r g,但耐药及敏感菌株中均存在,虽为错义突变,但该突变没有发生在E R G11点突变的105-165㊁266-287㊁405-488氨基酸之间的3个 热点 区域[19],也不是既往文献报道的Y123F㊁K143R㊁F449V和G464S等多个与白念珠菌对氟康唑耐药有关的突变位点[20],推测这个位点的突变在白念珠菌对氟康唑耐药机制中为无意义突变,但此也不能表明该机制在本地区白念珠菌耐药性的产生中无作用,可能与样本量较少有关,尚需扩大样本量进行进一步研究㊂罗丹明6G作为白念珠菌细胞膜上活性流出系统的底物,具有无毒㊁易检测㊁易吸收入射光的能量等优点,准确测量白念珠菌中罗丹明6G的积累浓度值有利于选择抗性菌株中C D R1㊁C D R2㊁MD R1等基因的过度表达㊂研究结果显示,加入荧光染料罗丹明6G后,耐药组罗丹明6G的外排量明显高于敏感组,说明白念珠菌对氟康唑耐药为主动外排系统所致㊂为排除实验环境(如菌株的生长环境和R N A的抽提等)对外排泵基因的检测结果的影响,耐药组和敏感组加入肌动蛋白相关基因A C T1和质膜H+-A T P酶编码基因P MA1,比较其表达水平,差异无统计学意义(P>0.05),说明实验环境对外排泵基因的检测结果没有影响㊂耐药组C D R1和C D R2外排泵基因表达量较敏感组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),由此可知影响本地区白念珠菌对氟康唑耐药机制中最为重要的是其药物外排泵基因C D R1㊁C D R2过度表达,并且耐药组耐药基因C D R1㊁C D R2相对表达量均显著高于敏感株组,与文献报道结果相似[21-22]㊂分析原因主要是,C D R1的表达受顺式作用调控元件的控制,包括一个B E E(基础表达元件)㊁一个D R E(药物敏感元件)㊁两个S R E(甾醇调控元件)和一个N R E(负调控元件),而C D R2的表达仅受D R E的控制,在这些不同的元件中,只有D R E参与必需的C D R1和C D R2的高表达和对氟康唑外排的上调相反,MD R1基因不具有D R E元件,并且MD R1启动子也不直接与氟康唑反应[21]㊂综上所述,本地区白念珠菌的耐药机制主要与外排泵基因过度表达相关,未发现靶酶编码基因有意义的突变,由于白念珠菌对氟康唑耐药现象的产生并非由于单一机制的调控,且临床很多患者存在滥用抗真菌药物的现象,导致白念珠菌对氟康唑的耐药性不断提高,而新型抗真菌药开发缓慢,改善白念珠菌对氟康唑的耐药问题迫在眉睫,因此,我们急需进一步探索白念珠菌致病机制和耐药机制,寻找新的药物治疗靶点,探索新的治疗体系,提高患者的生存率㊂参考文献[1]P F A L L E R M A,D I E K E MA D J,T U R N I D G E J D,e t a l.T w e n t y y e a r s o f t h e S E N T R Y a n t i f u n g a l s u r v e i l l a n c e p r o-g r a m:R e s u l t s f o r C a n d i d a s p e c i e s f r o m1997-2016[J].O p e n F o r u m I n f e c t D i s,2019,6(S u p p l1):S79-S94. 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3种方法检测念珠菌对氟康唑敏感性评价【摘要】目的：评价3种真菌药敏方法检测念珠菌对氟康唑敏感性的相关性，从而选择一种易于在各临床实验室开展、准确、简便的检测方法，以期更好的指导临床用药。

方法：分别用rosco纸片扩散法、液体培养基微量稀释法、atbfungus3浓度梯度法检测82株念珠菌对氟康唑的敏感性，以clsi推荐的微量肉汤稀释法作为参考方法。

结果：与液体培养基微量稀释法检测结果相比，rosco 纸片扩散法一致性为91.5%；atb浓度梯度法一致性为87.7%，均无一种方法敏感而其他2种方法为耐药或一种方法耐药而其他2种方法为敏感的严重误差。

结论：rosco纸片扩散法法对氟康唑的检测结果与clsi推荐的液体培养基微量稀释法相比符合率好，准确率高，监测的抗真菌药物种类多，更适合在临床实验室推广应用。

【关键词】念珠菌，氟康唑，真菌药物敏感试验近年来，机会性真菌感染发病率的不断上升及其耐药菌株的逐渐增多使真菌病的治疗面临着严峻的挑战。

氟康唑其作用机制是通过抑制14a脱甲基酶，使麦角固醇合成受阻，导致真菌细胞膜的完整性受损，从而发挥其抗真菌作用［1］。

但是氟康唑长期反复治疗易导致耐药菌株的出现，因此合理使用抗真菌药物和耐药性的检测具有重大意义。

但是，临床真菌药物敏感试验一直存在一些问题，如：现有的真菌药敏试验的可操作性和重复性不理想，需要进一步提高；真菌药敏折点需要改善；药敏试验的操作需要规范，并且需做好质量控制等。

因此，本研究通过比较3种不同药物敏感性方法检测念珠菌对氟康唑敏感性的相关性，从而选择一种易于在各临床实验室开展的准确、简便的检测方法，更好的指导临床用药。

材料和方法1．材料1.1实验菌株实验菌株来自广东省肇庆市皮肤病医院检验室2010年1月至2011年4月病人阴道分泌物等标本中分离出的82株念珠菌。

其中白念30株，热带15株，光滑23株，近平滑14株。

实验所用82株念珠菌的菌种构成如表1。

白色念珠菌对临床常用抗真菌药物的耐药性分析李莉;苏天璐;苗翠;张文卿【摘要】Objective To investigate the resistance of Candida albicans to common used antifungals drugs .Methods NCCLS 2003 as assessment criteria were used to test the susceptibilities to 494 strains of Candida albicans with DISC diffusion method .Results The susceptibilities test showed 494 strains of Candida albicans were highly susceptible to Amphotericin B (96. 1％ ) and Nystatin (93.9％) ,were low susceptible to Miconazole (51.9％) .The main infected organs were respiratory tract and urinary tract .Candida albicans were highly resistant to common used antifungals drugs .Conclusion The resistant of Candida albicans to common used antifungals drugs showed a ascending trend and the resistant mechanism needs to study more .%目的了解白色念珠菌对临床常用抗真菌药物的耐药性.方法按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的酵母菌纸片扩散法敏感试验指南,对临床分离的494株白色念珠菌进行抗真菌药物的敏感性测定.结果 494株白色念珠菌对两性霉素B、制霉菌素敏感性最高,分别为96.1%和93.9%,对咪康唑的敏感性最低为51.9%;念珠菌常见临床感染部位为呼吸道,其次是泌尿道.白色念珠菌对唑类抗真菌药物存在较大的耐药性.结论白色念珠菌对常用抗真菌药物的耐药性呈上升趋势,其耐药机制有待于进一步研究.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2011(015)001【总页数】3页(P126-128)【关键词】白色念珠菌;抗真菌药物;耐药机制【作者】李莉;苏天璐;苗翠;张文卿【作者单位】青岛大学医学院附属青岛市立医院,山东,青岛,266011;青岛大学医学院附属青岛市立医院,山东,青岛,266011;青岛大学医学院附属青岛市立医院,山东,青岛,266011;青岛大学医学院【正文语种】中文【中图分类】R379.4白色念珠菌是人体皮肤、粘膜的正常寄生菌,也是临床重要的条件致病性真菌。

㊃综述㊃热带念珠菌耐药机制的研究进展徐怡澜1阎澜2,3(1.海军军医大学基础医学院,上海200433;2.海军军医大学药学系军特药研究中心,上海200433;3.军事药学国家级实验教学示范中心,上海200433)ʌ关键词ɔ热带念珠菌;唑类;棘白菌素类;多烯类;耐药性ʌ中图分类号ɔ R379.4ʌ文献标志码ɔ A ʌ文章编号ɔ1673-3827(2023)18-0178-05侵袭性念珠菌病(i n v a s i v e c a n d i d i a s i s)是院内血流感染的第4大原因[1]㊂近年来由热带念珠菌(C a n d i d a t r o p i c a l i s)引起的各类疾病如侵袭性全身感染和败血症病例不断增加,在一些免疫功能低下的患者中还会导致高死亡率[2-3]㊂除白念珠菌,热带念珠菌已成为侵袭性真菌感染的一大病原真菌[4]㊂热带念珠菌是条件致病菌,在自然界广泛存在,也可寄居在人体皮肤㊁阴道㊁口腔㊁消化道等部位㊂当人体抵抗力下降或皮肤局部环境发生变化时,热带念珠菌即可大量繁殖,引起相应部位的感染乃至侵袭性感染㊂一项历时6年的回顾性调查显示,所有纳入的721例非白念珠菌血症患者中最常发现的是热带念珠菌(36.5%)感染,且热带念珠菌血症的临床表现最为严重,中位C反应蛋白水平最高(10.1m g/d L),且14d和30d死亡率最高(28.9%和44.1%)㊂热带念珠菌感染在非白念珠菌血症中表现最严重,临床结局最差[5]㊂然而令人担忧的是热带念珠菌的耐药率也不断上升,给临床治疗带来困难㊂我国侵袭性真菌耐药监测网(C H I F-N E T)2020年报告提出 中国需警惕-热带念珠菌唑类耐药 ,统计结果显示,临床常用抗真菌药物氟康唑和伏立康唑对热带念珠菌的最低抑菌浓度(M I C90)分别>256μg/m L和>8μg/m L,其中耐药分离菌的E R G11基因A395T突变占比83%㊂基金项目:国家自然科学基金资助项目(82173867);上海市科技创新行动计划国际科技合作项目(21430713000);上海市浦江人才计划(21P J D081)作者简介:徐怡澜,女(汉族),本科在读.E-m a i l:3163380792@ q q.c o m通信作者:阎澜,E-m a i l:y l a n20001228@s i n a.c o m 研究热带念珠菌耐药机制有助于改善热带念珠菌感染的临床结局,并促进抗耐药药物开发㊂目前治疗热带念珠菌的药物主要包括两性霉素B㊁棘白菌素或广谱三唑类抗真菌药㊂本文对热带念珠菌的耐药机制作一综述㊂1对唑类药物的耐药机制唑类抗真菌药物是最常见用于临床的广谱抗真菌药物,通过自身氮原子与14α-去甲基化酶中的细胞色素P450的血红素铁结合,致使麦角甾醇生物合成受阻㊁其合成前体24-甲烯二氢羊毛甾醇累积,最终导致真菌细胞膜破损㊂唑类药物成本低廉,使用广泛[6],但也导致药物滥用的情况发生,因其对病原真菌仅有抑制作用而无杀菌作用,念珠菌对于唑类药物的耐药问题日渐严重㊂1.1麦角甾醇合成通路中基因改变E R G11(也称为C Y P51)编码的羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶是念珠菌麦角甾醇合成途径中的关键酶,而麦角甾醇是保证念珠菌细胞膜稳定和流动性的重要成分㊂唑类药物与14ɑ-去甲基化酶结合,阻断羊毛甾醇转化为麦角甾醇,导致细胞膜结构功能改变,抑制真菌生长㊂E R G11基因过表达E R G11基因过度表达,导致唑类药物针对的靶酶生成增加,药物不可完全抑制靶酶活性㊂U P C2基因编码的锌族转录因子可调控E R G11基因的表达,有许多研究表明, U P C2基因的过表达和突变能促进E R G11高表达㊂P a u l等[7]通过实验诱导敏感的热带念珠菌分离株,在传代培养的不同时间点分别检测菌株U P C2表达,发现与敏感菌相比,发现与敏感菌相㊃871㊃中国真菌学杂志2023年4月第18卷第2期 C h i n J M y c o l,A p r i l2023,V o l18,N o.2Copyright©博看网. All Rights Reserved.比,诱导耐药菌U P C2表达量升高12.3倍,再经不含药物培养传代后,耐药程度降低的菌株与敏感菌相比,U P C2表达量仅升高1~2.5倍,提示U P C2基因表达量与菌株耐药性呈正相关㊂W a n g等[8]在对319株临床分离热带念珠菌研究时发现,耐氟康唑组E R G11和U P C2的m R N A表达水平显著高于敏感组;进一步对E R G11和U P C2的m R N A 表达水平进行相关性分析,表明靶酶E R G11的表达水平随着U P C2的高表达而增加㊂A r a s t e h f a r 等[9]对U P C2测序发现与对照组相比,耐氟康唑分离株的U P C2中发生Q340H和T381S突变与热带念珠菌唑类药物耐药相关㊂E R G11基因突变 E R G11基因突变导致唑类药物作用靶酶羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶的结构发生变化,致使唑类药物无法与其结合,从而产生耐药性㊂F a n等[10-12]在大多数的耐唑类的热带念珠菌分离株中发现E R G11基因A395T和C461T 突变位点,其中所有C461T突变都与A395T同时出现;进一步从功能上证实,A395T突变是唑类耐药性产生的原因,而单一突变C461T不会引起耐药性产生㊂研究还发现并验证了E R G11基因中G1390A㊁T769C和T374C错义突变可导致唑类药物M I C至少增加3倍㊂C h o i等[13]发现对氟康唑敏感性不同程度降低的热带念珠菌分离株具有L333I㊁G464S㊁K344N㊁V362M突变,这4种错义突变与耐药性有关㊂F o r a s t i e r o等[14]还发现E R G11基因G464D和Y132F错义突变与唑类耐药性相关㊂E R G3基因突变E R G3基因突变,导致麦角甾醇合成途径的旁路途径产生,绕过唑类效应的14ɑ-去甲基化酶,从而产生唑类药物耐药性㊂F o r a s t i e r o等[14]对耐药热带念珠菌E R G3基因序列的分析中发现了碱基错义突变C773T和A334G 导致S258F和S113G氨基酸取代㊂E d d o u z i等[15]发现临床分离热带念珠菌中E R G3碱基错义突变(C774T)导致S258F氨基酸改变进而导致其功能丧失,且证实了E R G11功能缺失菌通常伴随E R G3突变㊂1.2药物外排增强热带念珠菌细胞膜上与耐药性相关的外排泵有通过水解A T P获得能量进而通过细胞膜主动外排药物的A B C转运蛋白家族(由念珠菌耐药性C D R1基因编码)和不需要消耗能量的主要异化载体超家族(由MD R1基因编码)㊂C D R1及MD R1基因过表达C D R1及MD R1基因过表达导致念珠菌内药物被快速排出,从而对唑类药物产生耐药性㊂B a r c h i e s i等[16]发现氟康唑M I C的增加与MD R1和C D R1表达的增加正相关㊂F a n等[10]在3种无E R G11错义突变的耐唑类热带念珠菌分离株中,观察到C D R1和MD R1表达显著增加㊂然而,在一些研究中[14,18],实时R T-P C R定量检测并未发现C D R1和MD R1表达量变化㊂因此,MD R1和C D R1基因与热带念珠菌唑类耐药性的相关性还有待进一步研究㊂吡哆醛磷酸盐(P L P)依赖性酶表达上调吡哆醛磷酸盐依赖性天冬氨酸氨基转移酶超家族,包括O A T㊁A C O A T㊁D A P A A T和A B A T㊂天冬氨酸氨基转移酶是所有生物体内氮代谢的关键酶,参与念珠菌能量物质代谢过程,A B C膜转运蛋白通过水解A T P获得能量从而主动外排药物,因此,天冬氨酸氨基转移酶的过表达导致了真菌细胞中产生大量的A T P累积,它们被用于多药外排泵,进而将唑类药物从念珠菌细胞中转运出来㊂K a n a n i 等[19]研究表明,P L P依赖性酶耐药菌株中表达上调,提示与热带念珠菌临床分离株的耐药性有关㊂1.3线粒体呼吸酶链活性改变C Y T b基因编码的产物是线粒体呼吸链的细胞色素b㊂F a n等[10]发现在热带念珠菌C y t b基因的表达水平在耐药组中低于唑类敏感组㊂然而, J i a n g等[18]将荧光染料罗丹明123用于使用流式细胞术评估热带念珠菌的线粒体呼吸状态,发现耐药菌荧光强度高于敏感菌,提示耐唑类热带念珠菌中呼吸状态增加而非呼吸缺乏㊂另一方面,在这两组菌之间,C y t b的表达无显著差异㊂因此,线粒体呼吸酶链活性改变与热带念珠菌唑类耐药性的相关性也需要进一步研究㊂2对棘白菌素类的耐药机制β-葡聚糖是真菌细胞壁的基本成分㊂棘白菌素类家族通过抑制1,3-β-葡聚糖合酶(F K S)从而抑制1,3-β-葡聚糖的合成㊂多项研究表明,F K S 基因中的突变导致F K S p结合位点改变是棘白菌素耐药性产生的主要原因㊂K h a n等[20]筛选出临床上两种耐棘白菌素的热带念珠菌菌株,研究发现在F K S1的热点1(H S-1)区域内显示出纯合㊃971㊃中国真菌学杂志2023年4月第18卷第2期 C h i n J M y c o l,A p r i l2023,V o l18,N o.2Copyright©博看网. All Rights Reserved.S645P突变㊂X i a o等[21]从1例接受了19d米卡芬净治疗的60岁重度冠状动脉疾病和肺部感染女性患者的胸腔引流液中培养出耐棘白菌素菌株,该耐药菌株的F K S1基因H S1区域发现了导致氨基酸取代S80P的突变㊂3对多烯类药物的耐药机制两性霉素B作为多烯类的代表药物,具有抗菌谱广㊁抗念珠菌活性较高的特点㊂但是近年来也出现了耐两性霉素B的热带念珠菌菌株[22]㊂两性霉素B通过结合念珠菌细胞膜上的麦角甾醇,形成水性通道,以改变念珠菌细胞膜通透性从而使真菌死亡㊂同时,两性霉素B还可以诱导内源性活性氧(R O S)的产生,最终导致真菌细胞死亡[23]㊂3.1麦角甾醇缺乏麦角甾醇缺乏导致两性霉素B无作用靶点,进而产生耐药性㊂F o r a s t i e r o等[14]发现对两性霉素B敏感性降低的热带念珠菌菌株的细胞膜中不含麦角甾醇㊂麦角甾醇从细胞膜中耗竭会导致念珠菌其他甾醇的积累,进而维持最佳的细胞膜结构㊂此外,麦角甾醇的缺乏会激活伴侣蛋白H s p90代偿升高㊂在这种情况下,通过添加H s p90抑制剂可消除两性霉素B耐药性[24]㊂3.2线粒体活性降低两性霉素B耐药菌与R O S产生减少有关㊂除经典线粒体呼吸链外,念珠菌属还具有基于对抑制剂S H AM敏感的替代氧化酶电子转移和氧还原的替代呼吸途径㊂M e s a-A r a n g o等[25]研究发现耐药菌株的基础呼吸明显低于敏感分离株,添加呼吸链抑制剂S H AM后,耗氧下降超过90%,证明通过线粒体复合物的经典呼吸链几乎不存在㊂这证实了耐药菌株存在线粒体呼吸缺陷㊂线粒体活性是利用碳源(如甘油或乙醇)生长所必需的㊂两种抗两性霉素B菌株的生长在葡萄糖中部分受到影响,但这种缺陷在含甘油和乙醇的培养基中更为明显㊂这说明线粒体有氧呼吸减少,线粒体活性降低㊂3.3抗氧化机制的激活M e s a-A r a n g o等[25]考察了对两性霉素B的耐药性是否与R O S还原酶的增加有关,发现与敏感菌株相比,两种耐药菌株的过氧化氢酶活性升高2.0~2.5倍,提示抗氧化机制激活㊂3.4细胞壁组分变化M e s a-A r a n g o等[26]描述了两性霉素B耐药菌株呈现M k c1㊁H o g1和C e k1MA P K s的基础激活水平,而敏感株无此现象,这提示耐药菌株的细胞壁组成成分改变㊂研究发现,高β-1,3-葡聚糖成分可能抑制药物渗透作用于细胞㊂β-1,3-葡聚糖由膜上的β-1,3-葡聚糖合酶合成㊂而耐药菌株膜上麦角甾醇成分降低导致的结构功能变化,可能是改变β-1,3-葡聚糖合酶活性导致高β-1,3-葡聚糖的原因㊂但由于分子生物学工具的限制,无法确定细胞膜上的这种变化是否直接与两性霉素B的耐药性相关㊂4对5-氟胞嘧啶的耐药机制5-氟胞嘧啶可抑制真菌细胞核酸的合成㊂5-氟胞嘧啶借助胞嘧啶通透酶进入真菌细胞,再由胞嘧啶脱氢酶转变为5-氟尿嘧啶,生成5-氟尿嘧啶单磷酸盐从而抑制转录㊁D N A复制等过程㊂U r a3酶参与尿酰基磷酸(UM P)的代谢途径,而UM P是胸苷酸合成酶和UM P激酶的底物,两者都参与核酸合成㊂对5-氟胞嘧啶产生的耐药性与U R A3基因的K177E突变有关㊂K177E突变与基因上游的特定多态性微卫星标记(P MM)纯合子相关,可能在转录水平中起作用㊂这种突变导致蛋白质的三维结构改变,影响UM P对催化位点的结合亲和力,从而改变U r a3酶作用㊂目前发现对5-氟胞嘧啶的耐药机制主要是增加参与嘧啶生物合成途径(包括U R A3)的所有基因的转录,从而过度产生UM P㊂D e s n o s-O l l i v i e r等[27]所研究的14株5-氟胞嘧啶耐药分离株在I T S2区域的106号位置A 缺失,即U R A3基因529位置突变,尽管16个5-氟胞嘧啶敏感分离株中有5株同样具有该突变,当使用额外的基因型标记时,所有14个5-氟胞嘧啶耐药分离株对于选择的2个P MM(U R A3和C T14),具有相同的等位基因组合,同时,U R A3基因具有相同的错义突变,并且所研究的3个M L S T位点具有相同的二倍体序列㊂相比之下,16个5-氟胞嘧啶敏感分离株中只有1个具有突变,但该分离株在其M L S T谱和U R A3基因缺乏突变方面与5-氟胞嘧啶耐药分离株存在差异㊂5解决热带念珠菌耐药的策略由于抗真菌药物种类较少,临床应用重复率高,耐药也随之产生,因此需要合理使用,尽量避免耐药的产生㊂除了临床用药需要更加合理控制药㊃081㊃中国真菌学杂志2023年4月第18卷第2期 C h i n J M y c o l,A p r i l2023,V o l18,N o.2Copyright©博看网. All Rights Reserved.物剂量和种类,新型抗真菌药也在不断研发㊂有研究表明[28-31],油酰精氨酸乙酯㊁双氯芬酸㊁假单胞菌酸B㊁米替福辛等与唑类药物的协同作用,通过损伤热带念珠菌生物膜等手段,可以有效降低唑类耐药菌的M I C㊂有些研究在麦角甾醇生物合成途径上寻找新的靶点,芳基奎宁环衍生物以角鲨烯合成酶作为靶点[32],破坏合成途径;人工合成的新型四吲哚-4-酮衍生物[33]㊁4-苯基-4,5-二氢恶唑衍生物[34]有效抑制了14ɑ-去甲基化酶,抑制生物膜形成㊂β-1,3-葡聚糖合成抑制剂新型三萜类抗真菌药S C Y-078,同棘白菌素一样,抑制1,3-β-葡聚糖的合成,导致细胞壁合成失败[35]㊂萘夫兰醌促进了细胞内R O S水平的增加,导致D N A的氧化损伤[17]㊂有些新型药物仅仅处于试验阶段,它们在患者体内的可行性和安全性有待进一步考验,随着研究的深入,在不久的将来,这些药物有可能投入临床使用,从而改善临床上耐药性的问题㊂6小结综上所述,随着真菌感染患者中分离的热带念珠菌比例的逐年上升,热带念珠菌已成为临床上较受重视的念珠菌之一,随之而来的的耐药问题不容小觑㊂对目前几种抗菌药的耐药机制进行进一步的深入研究,并在此基础上研究对抗该过程的方法或者开辟新的路径,寻找新的靶点,将有望对抗耐药,提高目前临床治愈率㊂参考文献[1]G R A B OW S K I R,D U G A N E.D i s s e m i n a t e d c a n d i d i a s i s i n ap a t i e n t w i t h a c u t e m y e l o g e n o u s l e u k e m i a[J].C u t i s,2003,71(6):466-468.[2]MA D N E Y Y,S HA L A B Y L,E L A N A N YM,e t a l.C l i n i c a lf e a t u r e s a n d o u t c o m e o f h e p a t o s p l e n i c f u ng a l i n f e c t i o n s i nc h i ld re n w i t h h a e m a t o l o g i c a l m a l i g n a n c i e s[J].M y c o s e s,2020,63(1):30-37.[3]A N T I N O R I S,M I L A Z Z O L,S O L L I MA S,e t a l.C a n d i-d e m i a a n d i n v a s i v e c a n d i d i a s i s i n a d u l t s:A n a r r a t i v e r e v i e w[J].E u r J I n t e r n M e d,2016,34:21-28.D O I:10.1016/j.e j i m.2016.06.029.[4]Z U Z A-A L V E S D L,S I L V A-R O C H A W P,C H A V E S GM.A n u p d a t e o n C a n d i d a t r o p i c a l i s b a s e d o n b a s i c a n dc l i n i c a l a p p r o a c h e s[J].F r o n t M i c r o b i o l,2017,8:1927.D O I:10.3389/f m i c b.2017.01927.[5]K O J H,J U N G D S,L E E J Y,e t a l.P o o r p r o g n o s i s o fC a n d i d a t r o p i c a l i s a m o n g n o n-a l b i c a n s c a n d i d e m i a:a r e t r o-s p e c t i v e m u l t i c e n t e r c o h o r t s t u d y,K o r e a[J].D i a g n M i c r o-b i o l I n f ec t D i s,2019,95(2):195-200.[6]W I E D E R H O L D N P.A n t i f u n g a l r e s i s t a n c e:c u r r e n t t r e n d sa n d f u t u r e s t r a t e g i e s t o c o mb a t[J].I n f ec t D r u g R e s i s t,2017,10:249-259.D O I:10.2147/I D R.S124917. 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All Rights Reserved.。

ERG11基因与热带念珠菌唑类药物耐药关系的研究王影; 项明洁; 刘锦燕; 叶书来; 周馨【期刊名称】《《中国真菌学杂志》》【年(卷),期】2019(014)006【总页数】6页(P332-337)【关键词】热带念珠菌; 唑类药物耐药; ERG11基因【作者】王影; 项明洁; 刘锦燕; 叶书来; 周馨【作者单位】中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)检验科合肥 230036; 上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科上海 200025; 上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科上海 200020【正文语种】中文【中图分类】R379.4念珠菌(Candida spp.)是临床上真菌感染的主要致病菌。

近年来，随着器官移植、肿瘤放化疗、大剂量广谱抗生素的长期应用，糖皮质激素、免疫抑制剂的广泛应用及临床预防性或过量抗真菌药物的应用等因素[1, 2]，临床真菌感染问题日趋严重，可导致口腔、上呼吸道、阴道黏膜及全身系统性侵袭性感染(invasive fungual infection，IFI)。

其中侵袭性真菌感染预后差，病死率高，已成为一个重要的公共卫生问题[1]。

虽然在临床念珠菌的感染中白念珠菌最常见，但是由非白念珠菌(non-albicans Candida，NAC)引起的感染，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势[3]，其中，以热带念珠菌较常见[2, 4]。

研究显示，热带念珠菌已成为住院患者血流和尿路真菌感染的重要病原体[5]。

抗真菌药物中三唑类药物，尤其是氟康唑因抗菌谱广、疗效显著、生物利用度高和毒副作用低等优点，常作为临床一线用药[6, 7]，但由于唑类药物仅具有抑菌而非杀菌效果，在临床长期、反复用药过程中易导致耐药发生，使得临床治疗变得棘手[1, 8]。

热带念珠菌耐药机制至今仍不太明确，有研究报道热带念珠菌唑类药物的耐药与ERG11基因有关。

ERG11基因的编码产物14α-去甲基化酶(14α-demethylase，14-DM)为念珠菌细胞膜麦角固醇合成通路中关键酶，是唑类药物的作用靶酶[9]。

2019年4月综述DOI :10.19347/ki.2096-1413.201912077作者简介：姚存影（1991-），女，汉族，安徽阜阳人，硕士。

研究方向：恶性血液病，化疗后真菌感染。

*通讯作者：孟海涛，E-mail :menghait2004@.近年来，随着化疗、化疗及糖皮质激素的广泛应用，机会性真菌感染的发生率不断增加，念珠菌是临床上引起机会性真菌感染最常见的病原菌。

尽管白色念珠菌仍然是念珠菌血症分离出最多的念珠菌菌种，但非白色念珠菌的分离比例也逐渐增加，尤其是热带念珠菌[1-4]。

念珠菌血症中分离的热带念珠菌比例约在10%~30%,但在血液病患者热带念珠菌血症的分离率在50%左右[5-6]。

据报道，热带念珠菌的耐药率呈逐年增加趋势[7-9]。

研究显示，亚洲-太平洋地区的氟康唑敏感的热带念珠菌菌株仅为75.8%，而伏立康唑敏感菌株仅为69.3%[1]。

我国侵袭性真菌耐药监测网（CHIF-NET ）结果显示,近5年（2009年8月至2014年7月）的热带念珠菌对氟康唑和伏立康唑的耐药率分别从11.2%、10.4%增加至42.7%、39.1%；后2年唑类耐药的热带念珠菌菌株的分离率上升趋势显著；然而唑类耐药菌株分离率的上升与临床唑类使用量无关[8]。

台湾相关研究表明，热带念珠菌对氟康唑和伏立康唑敏感菌株分别为71.3%和49.2%,而对棘白菌素的耐药率均低于5%[10]。

热带念珠菌对棘白菌素类耐药率较低，PFALLER 等[11]研究发现0.9%~1.8%的热带念珠菌对棘白菌素耐药。

热带念珠菌菌株对两性霉素B 亦具有耐药性[12-13]。

热带念珠菌对临床常用的抗真菌药物耐药率高，因此常导致抗真菌治疗无效。

研究热带念珠菌对常见抗真菌药物的耐药机制不仅可以提供抗真菌治疗的预后价值，而且有助于研发新型抗真菌药物。

目前对热带念珠菌耐药机制的研究主要涉及唑类、棘白菌素和两性霉素B 。

1唑类1.1ERG11基因突变及过表达ERG11基因编码合成的14-α去甲基化酶是念珠菌细胞中的麦角固醇合成的关键酶。

热带念珠菌对唑类抗真菌药物耐药机制初步研究【摘要】目的：初步研究热带念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药机制。

方法：收集临床分离的热带念珠菌，用ATB Fungus3筛选氟康唑耐药菌株，Yeastone测定耐药株对棘白菌素类等9种抗真菌药物的敏感性。

提取耐药菌株及2株敏感菌株的基因组DNA，PCR扩增ERG11 基因并测序，实时荧光定量PCR测定ERG11基因的相对表达水平。

结果：97株热带念珠菌中共筛选出31株氟康唑耐药株，氟康唑耐药株对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、米卡芬净、卡泊芬净、阿尼芬净均100%敏感，对伊曲康唑、伏立康唑耐药率分别为74.19%、80.64%；耐药菌株主要有2个位点发生改变：A398T（ Y133F），A464T（S155F），其中54.2%耐药菌株ERG11 mRNA 高表达。

结论：热带念珠菌对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑交叉耐药，其耐药机制与ERG11位点突变和相对高表达有关。

关键字：热带念珠菌；唑类抗真菌药物；耐药；ERG11随着人口老龄化、免疫受损人群增加及介入性医疗操作的增多,侵袭性真菌病发病率不断升高,并且疾病预后不佳,已成为临床面临的重大威胁。

非白色念珠菌比例增多，而热带念珠菌是较为流行的非白色念珠菌，且热带念珠菌对唑类药物的耐药性逐年增高[1]。

热带念珠菌对唑类药物的耐药机制与ERG11 基因相关的耐药机制主要有:ERG11 基因突变和ERG11 基因过度表达[2]。

1.实验材料（1）实验菌株收集浙江大学医学院附属第一医院检验科微生物室分离的热带念珠菌97 株。

其中26株来自血液标本，29株来自尿液标本，17株来自痰标本，18株来自胆汁胸腹水等引流液，7株来自其他标本。

1.方法：（1）药敏实验：采用ATB FUNGUS 3 试条，按照说明书进行操作，筛选氟康唑耐药菌株，对氟康唑耐药菌株采用YeastOne药敏试剂盒分析其对米卡芬净、卡泊芬净、泊沙康唑、伏立康唑、阿尼芬净敏感性，判断折点参照CLSI 27-S4[5]。

念珠菌属对氟康唑的耐药性：当代视角汤雪文【摘要】白色念珠菌和新出现的非白念珠菌在许多患者人群中具有显著的临床意义.目前这些疾病的治疗指南中首选药物包括氟康唑,但是它只对念珠菌属真菌有抑制作用,且对氟康唑的固有和获得耐药性也都有报道.相关耐药机制包括增加药物的外排,改变或增加药物靶点,以及产生固醇、麦角固醇的替代生成途径.尽管在白色念珠菌中观察到的许多耐药机制在非白念珠菌种属中也有发现,但种间也存在重要和未知的差异.此外,新兴念珠菌属(包括具有全球健康威胁性的耳道假丝酵母菌)对氟康唑的耐药机制在很大程度上是未知的.为了保证抗真菌药物氟康唑的基本效用,我们必须充分认识念珠菌的耐药机制.【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》【年(卷),期】2018(039)005【总页数】5页(P435-439)【关键词】念珠菌;氟康唑耐药性;ERG11;药物外排;麦角固醇【作者】汤雪文【作者单位】西南大学药学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】R978.51 简介1.1 念珠菌感染介绍由于我们自己的医疗实践，近几十年来念珠菌感染的流行病学一直在变化。

念珠菌感染的危险因素与真菌感染的风险因素大体相似，通常是由于患者的医疗干预或健康状况而有所不同。

危险因素分为三类：促进念珠菌定殖的因素，抑制对念珠菌的免疫应答的因素，以及为念珠菌感染提供直接途径的因素。

历史上，92%～95%的念珠菌感染病例源于5种常见种类：白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(C. glabrata)、近平滑念珠菌(C. parapsilosis)、热带念珠菌(C. tropicalis)和克柔念珠菌(C. krusei)。

尽管如此，念珠菌感染的种属分布也有所变化。

过去几十年来，白念珠菌占所有念珠菌血症的50%以上。

然而，人类病原体中的非白色念珠菌(NCAC)种被发现概率越来越高，并且在一些情况下，NCAC比白色念珠菌更频繁地被分离出来。