中国5所医院念珠菌属对氟康唑和伏立康唑的耐药性监测

DOI：10.13493/j.issn.1672-7878.2020.01-036伏立康唑与氟康唑对肺部侵袭性真菌感染患者的临床疗效与安全性比较田芳*中国人民解放军联勤保障部队第九八八医院药剂科，河南焦作454000【摘要】目的：比较伏立康唑与氟康唑对肺部侵袭性真菌感染患者的临床疗效与安全性。

方法：选取2018年1月—2019年3月期间收治的肺部侵袭性真菌感染患者68例资料，按治疗方法不同将其分为氟康唑组和伏立康唑组，每组34例；氟康唑组患者给予氟康唑治疗，伏立康唑组患者给予伏立康唑治疗，比较两组患者治疗后的总有效率和不良反应发生率的差异。

结果：伏立康唑患者治疗后的总有效率（94.12%）显著高于氟康唑组（76.47%）（P＜0.05）；两组患者用药期间不良反应发生率经组间比较其差异无统计学意义（P＞0.05），但伏立康唑组患者不良反应中ALT异常发生率（14.71%）高于氟康唑组（0.00%）（P＜0.05）。

结论：采用伏立康唑治疗肺部侵袭性真菌感染患者的疗效显著优于氟康唑，但ALT异常发生率较高，临床用药时应引起高度重视。

【关键词】肺部侵袭性真菌感染；伏立康唑；氟康唑；临床疗效；安全性【中图分类号】R969.3【文献标志码】A【文章编号】1672-7878（2020）01-109-003肺部侵袭性真菌感染（invasive pulmonary fun-gal infections，以下简称IPFI）主要是由于患者肺部、气管和支气管受病原菌侵袭，导致肺部发生炎症肉芽肿，气道黏膜出现不同程度的炎症，病情严重时易威胁着患者的生命安全[1]。

尽早采用抗真菌药物治疗IPFI患者，以期及早控制其病情发展，提组织分布范围较广，在细胞内液中可达到较高浓度且半衰期较长，在酸性环境下较稳定，具有抗菌谱广的优点，不仅可杀灭革兰阳性菌、厌氧菌，而且对革兰阴性菌具有抗菌作用[6-8]。

总之，对于AECOPD患者，采用阿奇霉素与头孢唑肟联用治疗具有显著的优势，且阿奇霉素能改善AECOPD患者的肺组织形态，调节相关信号通路，通过非特异性免疫功能，影响生物膜的形成，二者起到了协同作用，有效改善了其肺功能，提高了临床疗效。

伏立康唑与氟康唑对临床常见念珠菌体外抗菌活性比较作者：曾冠宇来源：《健康必读·下旬刊》2020年第02期【摘要】目的：对比伏立康唑与氟康唑对临床常见念珠菌体外抗菌活性。

方法：选择Rosco纸片扩散法对60株念珠菌进行检测，包括其对伏立康唑与氟康唑的药敏作用。

结果：伏立康唑对白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌和其余念珠菌的体外抗菌敏感率为100%，显著高于氟康唑对白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌和其余念珠菌的体外抗菌敏感程度，P【关键词】伏立康唑;氟康唑;念珠菌;体外抗菌活性;比较【中图分类号】R978 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2020）02-03--02最近几年，我国的免疫功能降低人群数量逐步增加，促使糖皮质激素与免疫抑制剂引进临床治疗中的几率随之加大，以致于深部念珠菌的感染几率上升的发展倾向，成为影响免疫功能低下患者生活质量的重点因素[1]。

临床医学上往往使用氟康唑对此类人群进行治疗，而在念珠菌抗藥率不断上升的情况下，氟康唑的临床效果受到制约。

伏立康唑作为一种新型的抗真菌药物，可以显著增加人员自身免疫功能，为了对比伏立康唑与氟康唑对临床常见念珠菌体外抗菌活性，选择Rosco纸片扩散法对60株念珠菌进行检测，包括其对伏立康唑与氟康唑的药敏作用开展相关临床研究，现具体报道如下。

1 资料和方法1.1 一般资料1）菌株来源。

临床送检血液和尿液等标本分离出60株念珠菌，按照科玛嘉念珠菌显色法进行检测。

2）药敏纸片。

来源于Rosco公司制作的伏立康唑以及氟康唑，其中伏立康唑为每片25μg、氟康唑为每片1μg。

3）仪器和试剂。

ATB细菌鉴定仪器与细菌比浊仪器、CHR显色培养基、沙包罗氏培养基、琼脂培养基。

1.2 方法在药敏实验中，选择Rosco纸片扩散法，把分离的念珠菌通过常规方式进行接种，促使其生存在沙保氏培养基中，在37摄氏度的温度下生长一天，取出纯菌落，使用生理盐水调制0.25麦氏单位（5×105CFU/ML）克柔念珠菌0.05麦氏单位（5×105CFU/ML）[2]。

念珠菌感染菌种的分布及耐药性分析目的了解本地区2007～2008年念珠菌感染的菌种分布和耐药性情况,为临床抗真菌治疗提供依据。

方法收集本地区两家医疗机构两年间临床分离的念珠菌1462株,采用生物梅里埃ATB ID32C试条进行念珠菌菌种的分离鉴定,药敏试验采用生物梅里埃ATB-FUNGU30试条对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和两性霉素B等5种抗真菌药物进行测定。

结果1462株念珠菌中以白色念珠菌为主,检出682株(59.6%),其他依次为热带念珠菌278株(21.3%),光滑念珠菌135株(9.2%),近平滑念珠菌70株(4.8%),克柔念珠菌27株(1.8%),其他念珠菌46株(3.1%)。

念珠菌对伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、两性霉素B和伏立康唑的耐药率分别为28.9%、10.6%、3.1%、1.5%和0。

结论本地区念珠菌感染以白念珠菌为主,对伊曲康唑和氟康唑耐药性较高,对5-氟胞嘧啶、两性霉素B和伏立康唑敏感性较高。

本地区应建立真菌常规菌种鉴定及药敏试验,指导临床合理用药。

[Abstract] ObjectiveTo investigate the candida species distribution and susceptibility of Candida species to antifungal agents in Foshan city during 2007 to 2008,and provide evidence for diagnosis and treatment of fungi infection. MethodsIn a 2-year surveillance programme,1462 Candida stains were collected from two local medical institutions,Candida strains were identified by bioMérieux ATB ID32C test paper. Antifungal susceptibility of fluconazol,itraconazole,voriconazole,5-flurocytosine and amphotericin B was assessed by bioMérieux ATB-FUNGU30 test paper method. Results Among 1462 strains examined,Candida albicans accounted mainly for 59.6%(682 strains),and the other species accounted for 31.3% including,tropicalis 21.3%(278 strains),Candida glabrata 9.2%(135 strains),Candida parapsilosi 4.8%(70 strains),Candida krusei and 1.8%(27 strains)and the other Candida 3.1%(46 strains). The resistant rates to itraconazole,fluconazol,5-flurocytosine,amphotericin B and voriconazole were 28.9%,10.6%,3.1%,1.5% and 0,respectively. ConclusionThe pathogens causing fungus infection are mainly C. albicans in Foshan city,and it shows more sensitive to 5-flurocytosine,amphotericin B and voriconazole compared with itraconazole and fluconazol. The Fungi and Fungal pathogens routine strain identification and susceptibility test in this region should be established,guiding clinical rational drug use.[Key words]Candida; Resistance; Antifungal agents近年来,大量广谱抗生素、激素、免疫抑制剂的应用及各种介入性治疗技术的开展,尤其是随经济社会发展,越来越多医院投入使用密闭式中央空调,使真菌成为院内感染的一大病原菌,种类不多的抗真菌药反复使用后诱发越来越严重的耐药现象。

耐药菌株对唑类交叉耐药性随着抗真菌药的临床应用，耐药菌株逐渐产生。

近年来相关对真菌药物耐受的念珠菌报道增多，已引起医学界和药学界广泛注重，很多学者对此实行了深入探讨和研究。

一、念珠菌对唑类药物的耐药现象（一）耐药菌株的增多与传播：HIV感染、器官移植、恶性肿瘤患者，因为免疫功能低下或抑制，易伴发条件致病性感染特别是真菌感染，%～80%艾滋病患者有一种或几种真菌感染。

唑类药物广泛用于临床治疗和预防，因为长期反复和大剂量应用，耐药菌株和发生率日趋升高。

据报道法国Pasteur医院和其它几个研究中心1994年分离自艾滋病患者的念珠菌株10%对氟康唑耐药1。

而新近的统计资料显示，在艾滋病患者口咽感染念珠菌中，33％以上是耐药菌株，对氟康唑的最小抑菌浓度（MIC）＞12.5μg/ml（敏感菌株MIC值一般＜4μg/ml）2。

Dromer等报道在10对已保持性关系专一并稳定1年以上的HIV阳性伴念珠菌感染的患者中，有13例口咽分离的感染菌株对氟康唑耐药。

从未用过唑类药物的5例患者，其性伴感染的念珠菌株却均对氟康唑有耐药性。

进一步通过DNA限制性片段长度多态分析（RFLP）发现，这些感染菌株具有很近的种系关系，上述10对性伴中有6对的分离菌具有一个以上的相同克隆片段，所以可认为耐药菌株能够通过性伴传播3。

（二）耐药菌株对唑类药物具有交叉耐药性：HexiaoGang对分离自HIV感染者的212株白念珠菌（以下简称白念）研究发现，多数菌株对氟康唑敏感，MIC值＜2μg/ml,这些菌株对伊曲康唑的MIC50及MIC90值也相对应较低,范围在0.05μg～0.1μg/ml之间。

另有61株对氟康唑敏感性较差，其MIC值为4μg～62μg/ml,MIC50及MIC90值分别是8μg/ml、64μg/ml；同时测得伊曲康唑对这些菌株的MIC50和MIC90值分别是0.2μg/ml和0.4μg/ml。

由此可见，这些菌株不但对氟康唑不敏感，对伊曲康唑的MIC50和MIC90值也相对应增高了约4倍。

抗菌药物使用和管理培训考核试题及答案一、单项选择题：（35题，每小题2分，共70分）1、抗菌药物使用强度控制指标应根据医院实际情况相适应，2022年我院抗菌药物强度控制全院目标是:（）A. 每百人天40DDDs以下(正确答案)B. 每百人天37DDDs以下C. 每百人天30DDDs以下D. 每百人天20DDDs以下2、以下关于抗菌药物使用强度解释错误的是:（）A、DDD指的是:用于主要治疗目的的成人的药物平均日剂量。

B、DDDs，即DDD数，以药品的总用药量除以相应的DDD值求得该药的DDDs。

C、DDD作为测量单位，避免了不同药物一次用量不同、一日用药次数不同而无法比较的问题，可以较好地反映出药物的使用频度。

D、DDD指标越低越好。

(正确答案)3、患者，女，35岁，因肺部感染伴下消化道出血，该病人的抗感染治疗不宜选用下列哪种药物（）A.左氧氟沙星B.亚胺培南西司他丁C.哌拉西林他唑巴坦D.头孢哌酮舒巴坦(正确答案)E.万古霉素4、患者，女，67岁，长期留置导尿管，近期有低热，尿培养:白色念珠菌，对氟康唑、伏立康唑、氟胞嘧啶、两性霉素B、卡泊芬净敏感，肌酐74umol/L，诊断为泌尿系感染，首选的药物是（）A.氟胞嘧啶B.氟康唑(正确答案)C.卡泊芬净D.伏立康唑E.泊沙康唑5、重度肾功能减退时，不须调整给药剂量的药物为（）A.孢哌酮舒巴坦B.左氧氟沙星C.利奈唑胺(正确答案)D.亚胺培南E.氟康唑6、患儿女，1个月，诊断化脓性脑膜炎，脑脊液培养无乳链球菌，患儿对青霉素过敏，表现为皮疹，以下哪种药物可用于该患儿（）A.阿莫西林B.头孢他啶C.万古霉素(正确答案)D.氨曲南E.阿奇霉素7、抗铜绿假单胞菌感染时，下列有效药物是（）A.头孢氨苄B.青霉素GC.羟氨苄青霉素D.头孢他啶(正确答案)G C.羟氨苄青霉素 D.头孢他啶G C.羟氨苄青霉素 D.头孢他啶 E.头孢呋新8、抗铜绿假单胞菌感染时，下列无效药物是（）A.羧苄青霉素B.头孢哌酮C.头孢呋新(正确答案)D.庆大霉素E.第三代头孢菌素9、青霉素G是治疗下列病原体所致感染的主要药物（）A.溶血性链球菌B.螺旋体C.白喉杆菌D.以上三种都是(正确答案)E.A和B10、临床治疗暴发型流行性脑脊髓膜炎病人，应首选下列哪类药?（）A.磺胺嘧啶(正确答案)B.青霉素GC.头孢氨苄D.头孢呋新G C.头孢氨苄 D.头孢呋新G C.头孢氨苄 D.头孢呋新 E.复方新诺明11、下列能口服的青霉类药物是（）A.青霉素GB.氨苄青霉素C.羟苄青霉素(正确答案)D.羧苄青霉素G B.氨苄青霉素 C.羟苄青霉素 D.羧苄青霉素G B.氨苄青霉素 C.羟苄青霉素 D.羧苄青霉素 E.以上都不是12、下列不能口服的头孢菌素类药物是（）A.头孢氨苄B.头饱拉定C.头孢羟氨苄D.头孢哌酮(正确答案)E.以上都不是13、替加环素对下列（）菌无效A.肺炎克雷伯杆菌B.大肠埃希菌C.铜绿假单胞菌(正确答案)D.鲍曼不动杆菌E.非典型病原体14、碳青霉烯类MIC在（）时不宜选用A.>6mg/LB.>8mg/L(正确答案)C.>4mg/LD..>2mg/L15、抗菌药物的选择及其合理使用是控制和治疗院内感染的关键和重要措施。

㊃论著㊃白念珠菌对氟康唑耐药机制的研究封小川1,2 元航1 郑莹莹1,3 白江苗1 张欠欠1(1.延安大学医学院,延安716000;2.延安市人民医院,延安716000;3.延安大学附属医院,延安716000)ʌ摘要ɔ 目的 通过研究白念珠菌对氟康唑耐药相关基因E R G 11㊁C D R 1㊁C D R 2和MD R 1的表达水平及其与耐药的关系,旨在对本地区以白念珠菌感染为主的侵袭性念珠菌病的防治提供依据㊂方法 选取延安地区两家三甲医院临床确诊的对氟康唑耐药及敏感的白念珠菌各10株,扩增其靶酶编码基因E R G 11,分析突变位点;使用荧光染料罗丹明6G 分析耐药组与敏感组菌株的外排情况;采用荧光定量P C R 检测白念珠菌外排泵编码基因的表达水平㊂结果 E R G 11扩增测序结果显示,耐药菌株C 3号虽发生了碱基位点突变,但并未引起编码氨基酸的改变,耐药菌株C 7号及敏感菌株C 12号发生了碱基位点的突变,引起编码氨基酸的改变;荧光染料罗丹明6G 检测白念珠菌外排实验结果显示,耐药菌和敏感菌无论加入葡萄糖与否外排均存在显著差异,且耐药组加入葡萄糖较未加入葡萄糖外排量明显增加,差异有统计学意义(P <0.01);R T -P C R 检测外排泵基因结果显示,C D R 1与C D R 2外排泵基因表达水平在耐药菌与敏感菌之间差异有统计学意义(P <0.05)㊂结论 研究基因表达及外排泵功能检测结果均表明,本地区白念珠菌对氟康唑的耐药机制主要与外排泵基因过度表达相关,未发现靶酶编码基因有意义的突变㊂ʌ关键词ɔ 氟康唑;耐药机制;E R G 11;C D R 1;C D R 2ʌ中图分类号ɔ R 379.4 ʌ文献标志码ɔ A ʌ文章编号ɔ 1673-3827(2023)18-0481-06S t u d y on t h e m e c h a n i s m o f f l u c o n a z o l e r e s i s t a n c e i n C a n d i d a a l b i c a n s F E N G X i a o c h u a n 1,2,Y U A N H a n g 1,Z H E N G Y i n g y i n g 1,3,B A I J i a n g m i a o 1,Z HA N G Q i a n qi a n 1(1.M e d i c a l C o l l e g e o f Y a n a n U n i v e r s i t y ,Y a n a n 716000,C h i n a ;2.Y a n a n P e o p l e s H o s p i t a l ,Y a n a n 716000,C h i n a ;3.Y a n a n U n i v e r s i t y A f f i l i a t e d H o s pi t a l ,Y a n a n 716000,C h i n a )ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o s t u d y t h e e x p r e s s i o n l e v e l s of f l u c o n a z o l e r e s i s t a n tg e n e s E R G 11,C D R 1,C D R 2,a n d MD R 1i n C a n d i d a a l b i c a n s a n d th ei r r e l a t i o n s h i p w i t h d r u g re s i s t a n c e ,a n d t o p r o v i d e a b a s i sf o r t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f i n v a -s i v e c a n d i d i a s i s m a i n l y c a u s e d b y C a n d i d a a l b i c a n s i n f e c t i o n i n t h i s r e gi o n .M e t h o d s T e n f l u c o n a z o l e r e s i s t a n t s t r a i n s a n d 10f l u c o n a z o l e s e n s i t i v e s t r a i n s w e r e s e l e c t e d f r o m e a c h h o s p i t a l i n t w o t e r t i a r y a n d f i r s t -c l a s s h o s p i t a l s i n Y a n 'a n a r e a .A m -p l i f y i n g t h e t a r g e t e n z y m e c o d i n g g e n e E R G 11,a n a l y z i n g t h e m u t a t i o n s i t e s ,f l u o r e s c e n t d y e u s i n g rh o d a m i n e 6G w e r e u s e d t o a n a l y z e t h e e f f l u x o f s t r a i n s f r o m d r u g r e s i s t a n t a n d s e n s i t i v e g r o u p s .T h e n ,f l u o r e s c e n c e qu a n t i t a t i v e P C R w a s u s e d t o d e -t e c t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e g e n e e n c o d i n g t h e e f f l u x p u m p o f C a n d i d a a l b i c a n s .R e s u l t s E R G 11a m p l i f i c a t i o n a n d s e -q u e n c i n g r e s u l t s s h o w e d t h a t a l t h o u g h t h e r e s i s t a n t s t r a i n C 3h a d a b a s e s i t e m u t a t i o n ,i t d i d n o t c a u s e c h a n g e s i n t h e c o d i n ga m i n o a c i d .T h e r e s i s t a n t s t r a i n C 7a n d t h e s e n s i t i v e s t r a i n C 12h a d ab a s e s i t e m u t a t i o n ,c a u s i n g c h a n g e s i n t h e c od i n g am i -n o a c i d ;f l u o r e s c e n t d ye r h o d a m i n e 6G w a s u s e d t o d e t e c t t h e ef f l u x o f C a n d i d a a l b i c a n s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e e f f l u x o f r e s i s t a n t i s o l a t e a n d s e n s i t i v e i s o l a t e w e r e s ig n i f i c a n t l y d i f f e r e n t wh e t h e r g l u c o s e w a s a d d e d o r n o t ,a n d t h e e f f l u x o f d r u gr e s i s t a n t i s o l a t e w i t h g l u c o s e w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t w i t h o u t g l u c o s e ,a n d t h e d i f f e r e n c e w a s s t a t i s t i c a l l y s i gn i f i -c a n t (P <0.05);t h e R T -P C R d e t e c t i o n o f e f f l u x p u m p g e n e s s h o w e d a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f C D R 1a n d C D R 2e f f l u x p u m p g e n e s b e t w e e n d r u g-r e s i s t a n t a n d s e n s i t i v e i s o l a t e (P <0.05).C o n c l u s i o n T h e r e -s u l t s o f g e n e e x p r e s s i o n a n d e f f l u x p u m p f u n c t i o n t e s t i n g i n t h i s s t u d yi n d i c a t e t h a t t h e r e s i s t a n c e m e c h a n i s m o f C a n d i d a a l -b i c a n s t o f l u c o n a z o l e i n t h i s r e g i o n w a s m a i n l y r e l a t e d t o o v e r e x p r e s s i o n o f e f f l u x p u m p g e n e s ,a n d n o s i g n i f i c a n t m u t a t i o n s w e r e f o u n d i n t h e t a r g e t e n z y m e c o d i n g ge n e s .基金项目:陕西省重点研发计划项目(2021S F -230);榆林市科技项目(C X Y -2020-064);延安大学校产学研项目(C X Y 202121)作者简介:封小川,女(汉族),硕士,主治医师.E -m a i l :x i a o c h u a n 880112@163.c o m 通信作者:张欠欠,E -m a i l :z h a n g q i a n yd @163.c o m ㊃184㊃ 中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M yc o l ,D e c e m b e r 2023,V o l 18,N o .6ʌK e y w o r d sɔf l u c o n a z o l e;d r u g r e s i s t a n c e m e c h a n i s m s;E R G11;C D R1;C D R2[C h i n J M y c o l,2023,18(6):481-486]近年来,世界范围内以白念珠菌感染为主的侵袭性念珠菌病呈上升趋势,全球S E N T R Y抗真菌监测显示,在欧洲,白念珠菌引起的感染占念珠菌属的52.5%㊁亚太地区为46.0%㊁拉丁美洲为43.9%㊁美国和加拿大为42.7%[1],我国流行病学调查显示[2-3],白念珠菌引起的感染占念珠菌属的65%,个别地区甚至大于70%,在免疫功能低下者和植入医疗设备的健康人中白念珠菌的感染率居首位,感染病死率高达68.9%[4],美国每年也会因置入导管引发的白念珠菌感染造成约10万人死亡[5]㊂美国感染病学会(I D S A)指出氟康唑是既往非粒细胞缺乏念珠菌血症患者初始治疗及I C U中高危患者侵袭性念珠菌感染预防的首选药物[6],在发展中国家,三唑类药物(如氟康唑等)是治疗侵袭性念珠菌感染尤其是白念珠菌感染的主要药物[7]㊂但随着氟康唑在临床上的长期广泛应用,致使白念珠菌对氟康唑的耐药性不断增强,据美国疾控中心(C D C)统计,在感染念珠菌患者的血液样本中,约有7%对氟康唑耐药[8]㊂全球S E N T R Y监测显示[9],白念珠菌对氟康唑的耐药率为11.9%,我国白念珠菌对氟康唑的耐药率小于6%,剂量依赖性敏感(S D D)率为4.35%[10],这势必给临床治疗白念珠菌引发的疾病过程中带来严峻考验㊂文献报道显示[11-13],白念珠菌对氟康唑耐药机制主要是靶酶编码基因E R G11的突变和外排泵编码基因过表达,但由于不同地区白念珠菌的感染及其耐药不同,其耐药机制亦不尽相同,因此,本文通过研究白念珠菌对氟康唑耐药相关基因E R G11㊁C D R1㊁C D R2和MD R1的表达水平及其与耐药的关系,探究延安地区白念珠菌对氟康唑的耐药机制,对管理目前有限的抗真菌药物,以及为患者提供精准治疗服务至关重要㊂1材料和方法1.1材料菌株收集延安市两家三甲医院送检并经鉴定为白念珠菌且对氟康唑耐药和敏感的菌株各10株,耐药菌株编号C1-C10,敏感菌株编号C11-C20㊂标准质控菌株:白念珠菌A T C C90028㊂纳入标准:①经质谱鉴定为白念珠菌;②根据美国临床实验室标准化研究所(C L S I)判断标准[14],敏感(S):M I Cɤ8μg/m L,耐药(R):M I Cȡ64μg/m L,药敏结果复核为白念珠菌对氟康唑耐药及敏感菌株;③所有操作均符合实验室操作标准㊂主要试剂和仪器 Y e a s t O n e p l a t e真菌药敏板试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)(批号:280543)㊁T a q D N A聚合酶(北京百奥莱博科技有限公司)(批号:J N0015)㊁逆转录试剂盒(广州赛国生物科技有限公司)(批号:70060000)㊁罗丹明6G(西亚化学试剂商店)(批号:20211115)㊁V I T E K M S全自动快速质谱微生物检测系统(法国梅里埃公司)㊁A B I7300型全自动荧光定量P C R 仪(美国A B I公司)㊁C y t o m i c s500流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)㊁N a n o d r o p O n e超微量分光光度计(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)㊁T a n o n3500型凝胶成像分析系统(上海天能有限公司)㊂1.2方法E R G11基因扩增并测序白念珠菌D N A的提取:菌株培养㊁离心后,提取出白念珠菌D N A,与5μL样品混合均匀后进行电泳约55m i n,应用电脑成像系统进行凝胶相片拍摄㊂以G e n B a n k公布的白念珠菌标准菌株E R G11基因序列数据为准, P C R引物设计:E R G11F:5 -A T G G C T A T T-G T T G A A A C T G T C A T T G-3 (第1~25位)㊁E R G11 R:5 -T T A A A A C A T A C A A G T T T C T C T T T T T-T C C-3 (第1560-1587位)㊂罗丹明6G在试验菌株中外排情况的测定①实验菌株经离心㊁预冷,重悬于P B S使葡萄糖耗尽,加入罗丹明6G后将试管放于冰面上,然后在菌液中加入P B S混合均匀㊁离心,用流式细胞仪进行分析记录,此时菌株的荧光强度设为外排前的起始荧光强度;②洗3次预冷P B S,将多余的罗丹明6G去除后分为两管,一管50μL菌液加入1m L P B S,另一管50μL菌液加入1m L P B S,离心加入P B S混合均匀,运用流式细胞仪分析,将未用罗丹明6G处理的菌株细胞的荧光强度作为自身荧光对照;③将摄取罗丹明6G之后的细胞荧光强度作为基底,分别减去加与不加葡萄糖外排之后的细胞㊃284㊃中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2023,V o l18,N o.6荧光强度,进行数据分析㊂白念珠菌外排泵基因表达的检测 白念珠菌外排泵基因引物序列见表1㊂表1 白念珠菌外排泵基因引物T a b .1 G e n e p r i m e r s o f C a n d i d a a l b i c a n s e f f l u x p u m p 序列名称片段片段大小18S r R N AF :5'-T CG G G G G T A T C A G T A -T T C A G T T G T C -3'83b pR :5'-T C C T T G G T A A A T G C T T T -C G C A G T A G -3'C D R 1F :5'-TG A C T C C T G C T A C C G T G T -T G -3'194b pR :5'-A C C T G G A C C A C T T G G A A -C A T -3'C D R 2F :5'-C C TG G A A G C A C A G T T G T C -C A -3'161b pR :5'-T C C C C C T T T T G C A T A G C A -C C -3'MD R 1F :5'-G G G T G C T G T T T G T G G T C C -T A -3'196b pR :5'-A C C G G T G A T G G C T C T C A A -T C -3'A C T 1F :5'-TG G A C G G T G A A G A A G T T G -C T -3'184b pR :5'-T T G G A T T G G G C T T C A T C A -C C A -3'P MA 1F :5'-A C CG T T G C C G A A T T T G C T T -C -3'194b pR :5'-G C A A T A C C A A C G G C A T C A -C C -3'白念珠菌总R N A 的提取 采用T r i z o l 法提取白念珠菌总R N A ,R T -P C R 扩增外排泵基因严格按照试剂盒说明书进行操作㊂P C R 反应条件:94ħ预变性3m i n ,94ħ变性10s ,55ħ退火20s ,72ħ延伸30s ,40个循环㊂收集荧光阈值(c yc l e t h r e s h o ld ,C t ),将核糖体基因18S r R N A 设定为内参基因,用相对定量әC t 表示(әC t =C t 目的基因-C t 18S )并进行分析,其中әC t 值越小,相对基因表达量越高,反之则越低,见图1及图2㊂1.3 统计学分析采用S P S S 25.0统计软件分析,计量资料均用 x ʃs 表示,采用t 检验,检验水准α=0.05,P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 E R G 11基因的检测结果实验菌株E R G 11基因P C R扩增的产物经纯图1 实验菌株R T -P C R 溶解曲线 图2 实验菌株R T -P C R 扩增曲线F i g.1 R T -P C R d i s s o l u t i o n c u r v e o f e x p e r i m e n t a l s t r a i n F i g.2 R T -P C R a m p l i f i c a t i o n c u r v e o f e x p e r i m e n t a l s t r a i n s 化并测序,测序结果与G e n B a n k 中的标准序列X 13296进行比对分析,发现氟康唑耐药的C 3号菌株第414位碱基发生了突变GңA ,但并未引起第118位氨基酸甘氨酸(G l y )密码子的改变;氟康唑耐药的C 7号菌株及对氟康唑敏感的C 12号菌株的第518位碱基发生了突变CңG ,引起第173位氨基酸密码子改变,致脯氨酸(P r o )变为精氨酸(A r g),见图3~6及表2㊂表2 白念珠菌E R G 11基因突变及对应氨基酸改变T a b .2 M u t a t i o n o f E R G 11g e n e a n d c o r r e s p o n d i n g am i n o a c i d c h a n ge s i n C a n d i d a a l b i c a n s 菌株编号碱基突变位点氨基酸变化C 3G 414A G 118G C 7C 518G P 173R C 12C 518GP 173R注:C 12为敏感菌株,C 3和C 7为耐药菌株㊂2.2 罗丹明6G 的外排情况结果显示,敏感株在摄取罗丹明6G 后,未加葡萄糖几乎不发生外排,加葡萄糖后略有外排,但二者比较差异无统计学意义(P >0.05);耐药株在摄取罗丹明6G 后,无论加葡萄糖与否均发生外㊃384㊃ 中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M yc o l ,D e c e m b e r 2023,V o l 18,N o .6图3白念珠菌E R G11基因扩增D N A凝胶电泳图图4耐药组白念珠菌C3碱基峰值图图5耐药组白念珠菌C7碱基峰值图图6敏感组白念珠菌C12碱基峰值图F i g.3 A m p l i f i e d D N A g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f C a n d i d a a l b i c a n s E R G11g e n e F i g.4 C3b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n d r u g r e s i s t a n c e g r o u p F i g.5 C7b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n d r u g r e s i s t a n c e g r o u p F i g.6 C12b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n s e n s i t i v e g r o u p排,加葡萄糖较未加葡萄糖的外排量增加,二者比较差异具有统计学意义(P<0.01);将耐药组株对罗丹明6G的外排与敏感组菌株对罗丹明6G的外排量进行分析,耐药组罗丹明6G的外排量明显高于敏感组,差异具有统计学意义(P<0.01),见表3和图7㊂表3白念珠菌耐药组与敏感组罗丹明6G外排实验结果比较T a b.3 C o m p a r i s o n o f r h o d a m i n e6G e f f l u x t e s t r e s u l t s b e t w e e nd r u g-re s i s t a n t g r o u p a n d s e n s i t i v e g r o u p of C a n d i d a a l b i c a n s分组耐药组(n=10)敏感组(n=10)t P未加葡萄糖外排能力5.47ʃ0.530.45ʃ0.2327.621<0.01加入葡萄糖后外排能力7.77ʃ0.80.44ʃ0.2527.526<0.01 t-11.6020.44P<0.01>0.052.3 R T-P C R测定外排泵基因表达水平统计学分析显示,耐药组和敏感组肌动蛋白相关基因A C T1和质膜H+-A T P酶编码基因P MA1的表达水平相比较,差异无统计学意义(P >0.05);耐药组C D R1和C D R2外排泵基因表达量较敏感组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),图7敏感和耐药白念珠菌罗丹明6G外排实验结果F i g.7 R e s u l t s o f r h o d a m i n e6G e f f l u x t e s t o f s e n s i t i v e a n d d r u g-r e s i s t a n t C a n d i d a a l b i c a n s见表4和图8㊂表4白念珠菌主动外排泵基因在敏感组与耐药组相对表达水平的比较(әC t值)T a b.4 C o m p a r i s o n o f r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s o f a c t i v e e f f l u x p u m p g e n e o f C a n d i d a a l b i c a n s b e t w e e n s e n s i t i v e g r o u p a n d d r u g r e s i s t a n t g r o u p外排基因耐药组(n=10)敏感组(n=10)t PC D R16.42ʃ0.905.00ʃ0.863.589<0.01 C D R27.75ʃ1.116.30ʃ1.033.040<0.01 MD R19.74ʃ0.719.05ʃ1.141.616>0.05 A C T18.15ʃ0.318.16ʃ0.42-0.030>0.05 P MA18.04ʃ0.118.07ʃ0.14-0.612>0.05㊃484㊃中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2023,V o l18,N o.6图8敏感和耐药白念珠菌外排泵基因的表达量F i g.8 E x p r e s s i o n o f e f f l u x p u m p g e n e i n s e n s i t i v e a n d d r u g-r e s i s t-a n t C a n d i d a a l b i c a n s3讨论全世界每年由念珠菌引起的深部器官感染病例40万以上,病死率超过45%[15],尤其白念珠菌的发病率㊁致死率明显上升㊂唑类药物中的氟康唑是临床早期经验治疗白念珠菌感染尤其作为高危人群预防白念珠菌感染的首选药物,使其在人体内长期处于亚治疗水平,引起耐药性增加[16],白念珠菌耐药是目前临床治疗其感染失败的一个重要原因,研究报道,E R G11基因错义突变可使氟康唑抗真菌的作用靶点去甲基化酶C Y P51的血红素表面结合位点发生变化,从而使氟康唑无法与白念珠菌有效结合而致耐药[17],而且白念珠菌细胞膜上的外排泵活力增强也是白念珠菌对氟康唑耐药的主要机制之一[18]㊂本研究中靶酶编码基因E R G11的目的基因扩增测序中虽然引起氨基酸的改变,即耐氟康唑的C7号菌株及对氟康唑敏感的C12号菌株的第518位碱基发生了突变,引起第173位氨基酸密码子改变,致P r o变为A r g,但耐药及敏感菌株中均存在,虽为错义突变,但该突变没有发生在E R G11点突变的105-165㊁266-287㊁405-488氨基酸之间的3个 热点 区域[19],也不是既往文献报道的Y123F㊁K143R㊁F449V和G464S等多个与白念珠菌对氟康唑耐药有关的突变位点[20],推测这个位点的突变在白念珠菌对氟康唑耐药机制中为无意义突变,但此也不能表明该机制在本地区白念珠菌耐药性的产生中无作用,可能与样本量较少有关,尚需扩大样本量进行进一步研究㊂罗丹明6G作为白念珠菌细胞膜上活性流出系统的底物,具有无毒㊁易检测㊁易吸收入射光的能量等优点,准确测量白念珠菌中罗丹明6G的积累浓度值有利于选择抗性菌株中C D R1㊁C D R2㊁MD R1等基因的过度表达㊂研究结果显示,加入荧光染料罗丹明6G后,耐药组罗丹明6G的外排量明显高于敏感组,说明白念珠菌对氟康唑耐药为主动外排系统所致㊂为排除实验环境(如菌株的生长环境和R N A的抽提等)对外排泵基因的检测结果的影响,耐药组和敏感组加入肌动蛋白相关基因A C T1和质膜H+-A T P酶编码基因P MA1,比较其表达水平,差异无统计学意义(P>0.05),说明实验环境对外排泵基因的检测结果没有影响㊂耐药组C D R1和C D R2外排泵基因表达量较敏感组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),由此可知影响本地区白念珠菌对氟康唑耐药机制中最为重要的是其药物外排泵基因C D R1㊁C D R2过度表达,并且耐药组耐药基因C D R1㊁C D R2相对表达量均显著高于敏感株组,与文献报道结果相似[21-22]㊂分析原因主要是,C D R1的表达受顺式作用调控元件的控制,包括一个B E E(基础表达元件)㊁一个D R E(药物敏感元件)㊁两个S R E(甾醇调控元件)和一个N R E(负调控元件),而C D R2的表达仅受D R E的控制,在这些不同的元件中,只有D R E参与必需的C D R1和C D R2的高表达和对氟康唑外排的上调相反,MD R1基因不具有D R E元件,并且MD R1启动子也不直接与氟康唑反应[21]㊂综上所述,本地区白念珠菌的耐药机制主要与外排泵基因过度表达相关,未发现靶酶编码基因有意义的突变,由于白念珠菌对氟康唑耐药现象的产生并非由于单一机制的调控,且临床很多患者存在滥用抗真菌药物的现象,导致白念珠菌对氟康唑的耐药性不断提高,而新型抗真菌药开发缓慢,改善白念珠菌对氟康唑的耐药问题迫在眉睫,因此,我们急需进一步探索白念珠菌致病机制和耐药机制,寻找新的药物治疗靶点,探索新的治疗体系,提高患者的生存率㊂参考文献[1]P F A L L E R M A,D I E K E MA D J,T U R N I D G E J D,e t a l.T w e n t y y e a r s o f t h e S E N T R Y a n t i f u n g a l s u r v e i l l a n c e p r o-g r a m:R e s u l t s f o r C a n d i d a s p e c i e s f r o m1997-2016[J].O p e n F o r u m I n f e c t D i s,2019,6(S u p p l1):S79-S94. 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热带念珠菌对唑类抗真菌药物耐药机制初步研究【摘要】目的：初步研究热带念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药机制。

方法：收集临床分离的热带念珠菌，用ATB Fungus3筛选氟康唑耐药菌株，Yeastone测定耐药株对棘白菌素类等9种抗真菌药物的敏感性。

提取耐药菌株及2株敏感菌株的基因组DNA，PCR扩增ERG11 基因并测序，实时荧光定量PCR测定ERG11基因的相对表达水平。

结果：97株热带念珠菌中共筛选出31株氟康唑耐药株，氟康唑耐药株对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、米卡芬净、卡泊芬净、阿尼芬净均100%敏感，对伊曲康唑、伏立康唑耐药率分别为74.19%、80.64%；耐药菌株主要有2个位点发生改变：A398T（ Y133F），A464T（S155F），其中54.2%耐药菌株ERG11 mRNA 高表达。

结论：热带念珠菌对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑交叉耐药，其耐药机制与ERG11位点突变和相对高表达有关。

关键字：热带念珠菌；唑类抗真菌药物；耐药；ERG11随着人口老龄化、免疫受损人群增加及介入性医疗操作的增多,侵袭性真菌病发病率不断升高,并且疾病预后不佳,已成为临床面临的重大威胁。

非白色念珠菌比例增多，而热带念珠菌是较为流行的非白色念珠菌，且热带念珠菌对唑类药物的耐药性逐年增高[1]。

热带念珠菌对唑类药物的耐药机制与ERG11 基因相关的耐药机制主要有:ERG11 基因突变和ERG11 基因过度表达[2]。

1.实验材料（1）实验菌株收集浙江大学医学院附属第一医院检验科微生物室分离的热带念珠菌97 株。

其中26株来自血液标本，29株来自尿液标本，17株来自痰标本，18株来自胆汁胸腹水等引流液，7株来自其他标本。

1.方法：（1）药敏实验：采用ATB FUNGUS 3 试条，按照说明书进行操作，筛选氟康唑耐药菌株，对氟康唑耐药菌株采用YeastOne药敏试剂盒分析其对米卡芬净、卡泊芬净、泊沙康唑、伏立康唑、阿尼芬净敏感性，判断折点参照CLSI 27-S4[5]。

Etest方法与微量肉汤稀释法检测念珠菌属对唑类抗真菌药物的敏感性评价张丽;王贺;肖盟;徐英春【摘要】目的比较分析Etest法检测临床常见念珠菌对氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑敏感性与微量肉汤稀释法的一致率.方法针对220株临床常见的5种念珠菌,分别采用CLSI M27微量肉汤稀释法和Etest法进行药物敏感性检测.分别统计Etest法与微量肉汤稀释法检测三种唑类药物的基本一致率(EA)和分类一致率(CA).结果 Etest方法和微量肉汤稀释法的EA分别为氟康唑(96.8％)、伏立康唑(97.3％)和伊曲康唑(81.8％).对于氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑,白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌中两种检测方法的CA分别为96.2％,97.5％和-;92.5％,82.5％和97.5％;92.5％,97.5％和-;97.5％,-和70％;-,100％和90％.结论 Etest法检测念珠菌对唑类药物敏感性与微量肉汤稀释法一致率较高,是念珠菌唑类药物敏感性测定简便并且准确性较高的检测方法,推荐在真菌实验室常规使用.【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2019(034)004【总页数】4页(P67-70)【关键词】念珠菌;Etest;微量肉汤稀释法;唑类药物【作者】张丽;王贺;肖盟;徐英春【作者单位】中国医学科学院北京协和医院检验科,北京 100730;侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室,北京 100730;侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室,北京 100730;中国医学科学院北京协和医院检验科,北京100730;侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室,北京 100730;中国医学科学院北京协和医院检验科,北京 100730;侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室,北京 100730【正文语种】中文【中图分类】R379.4;R446.5近年来念珠菌感染的发病率逐渐增加，成为引起院内感染的重要致病菌[1-2]。

侵袭性念珠菌病诊治疗策略复旦大学附属华山医院抗生素研究所（200040）李光辉念珠菌属(Candida species)是机会真菌或条件致病真菌中最常见者，其所致疾病在侵袭性真菌病(Invasive fungal disease,IFD)中占首位。

念珠菌病可累及人体皮肤、粘膜及各内脏器官。

侵袭性念珠菌病更可危及生命，其中念珠菌血流感染(BSI)占医院获得BSI中的第4位，其粗病死率可高达39.2%(ICU 47.1%)。

念珠菌病，尤其是侵袭性念珠菌病的早期诊断常很困难，导致延误及早正确的抗真菌治疗，并影响患者预后。

由于念珠菌属是人体内最大的真菌正常菌群，在与外界相通的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等器官中广泛存在，采自这些部位的标本极易检出念珠菌，而临床上往往将痰液、尿液、粪便等临床标本中检出念珠菌属作为诊断念珠菌病的依据，导致抗真菌药的不合理的过度应用，因而早期正确诊断念珠菌病是当前面临的重要议题。

念珠菌病的病原治疗、经验治疗、预防性治疗的规范化则是目前面临的又一重要议题。

一、流行病学在侵袭性真菌病(IFD)中念珠菌是最常见的机会真菌。

在ICU患者、实体器官移植和造血干细胞移植受者的IFD中念珠菌属所致者占42%，在医院获得BSI中念珠菌占病原菌的9%。

侵袭性念珠菌病对患者的预后影响显著，美国报道侵袭性念珠菌病的死亡率为0.4/100000/年(1)，也有报道其归因病死率成人为15%-25%，新生儿和儿童为10%-15%。

侵袭性念珠菌病可使入住ICU和住院时间分别增加12.7日和15.5日，并增加了医疗费用。

发生侵袭性念珠菌病的主要危险因素包括念珠菌定植、接受广谱抗菌药治疗、使用中央静脉导管、全胃肠外营养、胃肠道或心脏外科手术、住院时间延长、入住ICU、烧伤、早产、中性粒细胞减少、糖皮质激素应用、HIV感染、糖尿病。

在念珠菌病中以白念珠菌所致者为主，近年来在临床分离的念珠菌中，白念珠菌所占比例呈下降趋势。