高效液相色谱法样品预处理的自动化和衍生化的进展

作者简介：尤斯涵，研究方向：网络药理学；Ｅ ｍａｉｌ：４７８０３２００８＠ｑｑ．ｃｏｍ通讯作者：郭春燕，教授，硕士生导师；研究方向：体内药物分析和靶向药物分析；Ｅ ｍａｉｌ：ｇｕｏｃｈｙ０３１１＠１６３．ｃｏｍ生物样品的预处理技术研究进展尤斯涵　殷宏艳　杨宋蕊　刘鑫淼　郭春燕河北北方学院药学院，河北省神经药理学重点实验室，张家口，０７５０００，中国【摘要】　基于生物样品具有药物种类繁多、理化性质各异、生物介质组分复杂的特点，生物样品的预处理产生了多种技术和方法。

基于以上背景，该文综述了近年来在体内药物分子中生物样品的预处理方法，以期为不同生物样品的预处理提供参考。

【关键词】　生物样品；预处理；体内药物分析【中图分类号】　Ｒ９６３ 【文献标识码】　Ａ 犇犗犐：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５ １３９６．２０２３．０５．０１０犃犱狏犪狀犮犲犻狀犘狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋犜犲犮犺狀犻狇狌犲狊犳狅狉犅犻狅犾狅犵犻犮犪犾犛犪犿狆犾犲狊ＹＯＵＳｉ ｈａｎ，ＹＩＮＨｏｎｇ ｙａｎ，ＹＡＮＧＳｏｎｇ ｒｕｉ，ＬＩＵＸｉｎ ｍｉａｏ，ＧＵＯＣｈｕｎ ｙａｎＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＨｅｂｅｉＮｏｒｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＨｅｂｅｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｚｈａｎｇｊｉａｋ ｏｕ，０７５０００，Ｃｈｉｎａ【犃犅犛犜犚犃犆犜】　Ｄｕｅｔｏｔｈｅｄｉｖｅｒｓｅｔｙｐｅｓｏｆｄｒｕｇｓ，ｄｉｖｅｒｓｅｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄｃｏｍｐｌｅｘｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｄｉａｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ，ｖａｒｉｏｕｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｈａｖｅｅｍｅｒｇｅｄｆｏｒｔｈｅｐｒｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｂｏｖｅｂａｃｋ ｇｒｏｕｎｄ，ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｐｒｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｉｎｖｉｖｏｄｒｕｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｗｉｔｈｔｈｅａｉｍｏｆｐｒｏｖｉｄｉｎｇｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｐｒｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ．【犓犈犢犠犗犚犇犛】　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ；ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ｉｎｖｉｖｏｄｒｕｇａｎａｌｙｓｉｓ 体内药物分析主要指利用现代分析仪器及方法对人或动物血样、尿样及组织等生物样品中的药物进行定性、定量分析。

高效液相色谱法中样品预处理与柱温控制的优化方法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种用于分离和分析化合物的常见技术。

然而，样品的预处理和柱温控制是影响分析结果的重要因素。

本文将讨论如何优化样品预处理和柱温控制方法，以提高HPLC的效率和准确性。

一、样品预处理的优化方法样品预处理是HPLC分析的首要步骤，旨在去除干扰物和浓缩目标分析物。

以下是几种常见的样品预处理优化方法：1. 萃取方法：对于固态样品，可以使用溶剂萃取或固相微萃取等方法。

选择合适的萃取方法可以提高分析物的浓度和纯度。

2. 过滤方法：使用微孔膜过滤器或固相萃取柱进行样品过滤，可以去除大颗粒和杂质，避免堵塞HPLC柱和仪器。

3. 衍生化方法：某些化合物在HPLC中难以分离和检测，可以使用化学衍生化方法将其转化为易于分析的衍生化物。

4. 离心浓缩法：对于稀溶液样品，可以通过离心浓缩法浓缩样品，提高分析物的浓度。

优化样品预处理方法可以提高样品的纯度和浓度，减少干扰物对分析物的影响，从而提高HPLC的分析准确性和灵敏度。

二、柱温控制的优化方法柱温控制是HPLC分析中的重要因素之一。

温度的变化可以影响色谱分离的选择性和速度。

以下是柱温控制的几种常见优化方法：1. 温度梯度方法：在柱温控制中使用温度梯度，可以提高分析物的分离度和分析速度。

通过逐渐增加或减少温度，可以优化分离效果。

2. 柱温控制参数的优化：调整柱温控制参数，比如温度斜率和保温时间，可以提高色谱分离的选择性和稳定性。

不同的分析物可能需要不同的柱温参数。

3. 列外循环冷却方法：使用列外循环冷却装置，可以在样品进入柱前将其冷却，避免柱内峰形变形和色谱峰的分散。

4. 优化冷却介质：选择合适的冷却介质，如冷却液或气体，可以提高柱温控制的效果。

需考虑介质的冷却速度、温度稳定性和对仪器的影响等因素。

通过优化柱温控制方法，可以提高分析物的分离度和分析速度，减少色谱峰的峰形变形，提高HPLC的分析效率和准确性。

高效液相色谱法应用论文【摘要】目的：探究高效液相色谱法在药物分析中的实际应用。

方法：研究高效液相色谱法在药物分析中的特点及其在药物成分中的测定。

结果：高效液相色谱法在药物分析中的应用范围较广泛，取得了良好的效果。

结论：高效液相色谱法拥有灵敏度高、专属性强等优势特征，在药物分析领域内具有广阔的应用发展前景。

【关键词】高效液相色谱法；药物分析；应用；分离；药物成分高效液相色谱法是一种发展于上世纪70年代的快速、高效分析分离技术【1】。

该方法通常以液体溶剂充当流动相，并密切结合气相色谱法和液相色谱法分析分离的基本原理，具有见效快、高灵敏度、速度快等优势特征。

相较于气相色谱法，液相色谱法仅试剂制作成溶液即可，而忽略了气化过程，所以，并不受到试剂挥发作用的影响和制约。

该方法也用作分析分离沸点高、热稳定性能低、相对分子质量较大的有机物。

本文主要研究高效液相色谱法在药物分析中的特点及其在药物成分中的测定。

1高效液相色谱法在药物分析中的应用1.1抗生素分析抗生素通常是由微生物及其他办法所产生的一种化学物质，在高度稀释的条件下依然具备抑制及消灭微生物的基本功能。

对抗生素进行分析、分离及定量检测是药物分析中难度较大的领域，较普遍用到的办法为化学方法、分光光度法及微生物法等，然而，这三类方法的弊端在于耗费时间较长、专一性欠佳【2】。

目前运用在临床中的一类酯类抗生素——阿奇霉素具备较广泛的抗菌谱，有助于抑制流感嗜血杆菌、黏膜炎莫拉菌及肺炎链球菌等。

在酸性条件下，阿奇霉素的平稳性仍然较高，具备生物应用程度高、半衰期长及吸收性优良的特征。

据科学检测，PH值对分离阿奇霉素的影响较大，在PH11左右的环境中拥有较显著的分离效果。

高效液相色谱法具有分析时长较少、流动相耗费少及质谱联用的特征，在阿奇霉素的检测领域有着可靠的应用优势，通常所选的检测波长为215nm，在<5min 的时间段内即可使阿奇霉素完成基线分离，有效地节省了分析时间。

柱前衍生-反相高效液相色谱法1.引言1.1 概述概述部分的内容可以介绍柱前衍生-反相高效液相色谱法的背景和意义。

下面是一个概述的范例：正如我们所知，液相色谱法是一种常用的分离和检测分析技术，在化学、药学、环境科学等领域具有广泛的应用。

然而，传统的液相色谱法在某些情况下可能面临一些挑战，如分离效果不理想、分析时间较长等。

为了克服这些问题，柱前衍生-反相高效液相色谱法被提出并逐渐受到关注。

柱前衍生是指在样品处理中，在样品中引入适当的衍生试剂，通过与目标分析物发生化学反应，使其在色谱分析中具有更好的分离性能和检测灵敏度。

反相高效液相色谱法是基于分离样品中不同化学性质的分子在反相色谱柱上的亲水作用，达到分离和定量分析的目的。

柱前衍生-反相高效液相色谱法不仅可以提高色谱分析的分离效果，还能够提高检测灵敏度和减少分析时间。

这对于复杂样品的分析具有重要意义，例如药物代谢产物、环境污染物等。

通过引入适当的衍生试剂，可以有效地改善样品的分离性能，同时提高对目标分析物的响应，从而实现快速、灵敏的定量分析。

本文将对柱前衍生-反相高效液相色谱法的原理、方法和应用进行详细介绍。

首先，我们将阐述柱前衍生的基本原理和常用的衍生试剂。

然后，重点介绍反相高效液相色谱法的步骤和关键参数。

最后，我们将通过实例和应用案例来阐述柱前衍生-反相高效液相色谱法在药物分析、环境监测等领域的应用前景。

通过本文的阅读，读者将能够全面了解柱前衍生-反相高效液相色谱法的原理和实践，为他们的研究和实验工作提供参考和指导。

文章结构部分应包括以下内容：本文主要分为三个部分，即引言、正文和结论。

具体结构如下：1. 引言1.1 概述本部分将简要介绍柱前衍生-反相高效液相色谱法的研究背景和意义。

首先，说明柱前衍生技术在分析化学领域的重要性，该技术可以通过将样品与特定试剂反应生成易于分析的化合物，从而提高液相色谱分析的敏感性和选择性。

其次，介绍反相高效液相色谱法在分析化学中的广泛应用，包括药物分析、环境监测和食品安全等领域。

高效液相色谱法在药物分析中的研究进展摘要：高效液相色谱法作为药物分析的常规方法应用广泛，本文对其在药物含量测定及药代动力学研究上的应用进行综述。

关键词：高效液相色谱法；药物分析；研究；进展高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatogra phy，HPLC）是一项柱色谱分离技术，因分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广、组分易回收、样品处理较简单等特点已广泛应用于各种药物及其制剂的分析测定。

随着与质谱、核磁共振波谱等的联用技术的发展，HPLC的应用将愈加广泛[1]。

一、高效液相色谱法作为药物分析的常规方法在药物分析中的应用高效液相色谱法作为药物分析中的最主要的分析方法，常被作为常规分析和检验方法[2]。

近年来这个方面的研究较多，陈英红等通过对人参糖肽注射液中多糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化，采用高效液相色谱法进行组成糖分析，建立了人参糖肽注射液特征图谱。

该方法操作简便，分离度高，重复性及稳定性良好，可有效控制人参糖肽注射液的质量，同时可作为酸性杂多糖的测定方法。

陈金泉等建立抗艾滋病药物更昔洛韦、阿昔洛韦、喷昔洛韦和伐昔洛韦的HPLC快速检测方法。

采用同一色谱体系实现对四种药物的分析，该检测方法快速、简便，准确。

这些研究充分利用了高效液相色谱操作简单，灵敏度高，回收率高的特点。

二、高效液相色谱在药物分析测定中的研究进展高效液相色谱法是一种集分离和测定为一体的分析方法，其作为药物分析中药物鉴别、杂质检查及含量测定的重要方法。

（一）在鉴别中的应用。

HPLC用于药物鉴别时，一般规定按供试品含量测定项下的高效液相色谱条件进行实验。

要求供试品和对照品色谱峰的保留时间一致。

在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性的参数。

如头抱拉定、头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。

（二）在有关物质检查中的应用。

高效液相色谱样品预处理步骤1. 样品准备在准备高效液相色谱样品时，需要确保样品的稳定性，防止样品在分析过程中发生变化。

因此，在样品准备过程中需要注意以下几点：（1）选择合适的样品存储容器，避免样品被污染或发生变化；（2）确保样品在分析前达到室温，以避免样品在注射到色谱柱时产生气泡；（3）注射适量的样品，以避免色谱柱被过度磨损或样品过载。

2. 样品过滤在进行高效液相色谱分析前，需要将样品通过过滤器进行过滤，以去除样品中的固体杂质或悬浮物，从而防止其对色谱柱的堵塞或损坏。

通常使用的过滤器有不同规格的筛网或滤膜。

3. 样品衍生化在一些情况下，需要对样品进行衍生化处理，以便更好地进行高效液相色谱分析。

衍生化处理可以将样品中的某些化合物转化为更易分析的形式，例如将某些极性化合物转化为非极性化合物，使其更适合用有机溶剂进行洗脱。

4. 样品稀释在某些情况下，需要将样品进行稀释，以便更好地进行高效液相色谱分析。

过浓的样品可能会导致色谱峰过宽或重叠，影响分析结果的准确性。

通常使用的的是溶剂或水进行稀释。

5. 样品进样在进行高效液相色谱分析时，需要将样品通过进样针注入到色谱柱中。

在进行进样时，需要注意以下几点：（1）注射适量的样品，以避免色谱柱被过度磨损或样品过载；（2）确保进样针的清洁和干燥，以避免对分析结果产生干扰。

6. 样品分离在将样品注入到色谱柱后，需要对其进行分离。

通常使用的的是高压泵将流动相通过色谱柱，将样品中的各个化合物进行分离。

在进行分离时，需要注意以下几点：（1）选择合适的流动相，以便将样品中的各个化合物进行分离；（2）调整流动相的流速和比例，以便获得更好的分离效果。

7. 检测器检测在分离后的各个化合物通过色谱柱流出时，需要使用检测器进行检测。

常见的检测器有紫外可见光检测器、电导检测器、荧光检测器等。

检测器可以提供样品的信号，并记录下各个化合物的在色谱图中的保留时间。

8. 数据处理在检测器检测完成后，需要对数据进行处理。

衍生化试剂很多,简单的说:它能帮你将不能分析的样品通过衍生化试剂反应转化为可分析的化合物.衍生化试剂比如有:烷基化试剂、硅烷化试剂、酰化试剂类、荧光衍生化试剂、紫外衍生化试剂、苯甲酰氯为衍生化试剂、羟基衍生化试剂、手性衍生化试剂、氨基衍生化试剂、气相色谱和液相色谱中常用的柱前衍生化方法、、固相化学衍生化法.高效液相色谱法有甲醛与2，4－二硝基苯肼（DNPH）反应生成腙，衍生化产物醛腙用有机溶剂萃取富集后，在一定温度下蒸发、浓缩，再以甲醇或乙腈溶解或稀释，最后进行色谱测定。

衍生化使用色谱分离原理检测化学成分，当被检测目标成分的理化性质（如沸点、极性、吸光性）不便分离检测时，经常采用衍生化技术，改变其理化性状，达到可以使用色谱仪检测的目的。

化学衍生法指借助化学反应将待测组份接上某种特定基团，从而改善其检测灵敏度和分离效果的方法。

利用化学衍生反应达到改变化合物特性的目的，使其更适合于特定分析的过程，在仪器分析中被广泛应用。

气相色谱中应用化学衍生反应是为了增加样品的挥发度或提高检测灵敏度，而高效液相色谱的化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂(通称化学衍生试剂或标记试剂)与样品组份进行化学反应，反应的产物有利于色谱检测或分离。

一般化学衍生法主要有以下几个目的：提高样品检测的灵敏度；改善样品混合物的分离度；适合于进一步做结构鉴定，如质谱、红外或核磁共振等。

进行化学衍生反应应该满足如下要求：对反应条件要求不苛刻，且能迅速、定量地进行；对样品中的某个组份只生成一种衍生物，反应副产物及过量的衍生试剂不于扰被测样品的分离和检测；化学衍生试剂方便易得，通用性好[3 7]。

衍生化常用的反应有酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、环化和离子化等。

虽然气相色谱已有许多衍生化方法，但它有一个致命的缺点是不能用于热不稳定化合物。

此外，对于一些有复杂基质的实际样品，除分离上的困难外，还容易污染进样器和损坏柱子。

衍生化反应从是否形成共价键来说，可分为两种：标记和非标记反应。

高效液相色谱-质谱联用技术在代谢组学中的应用进展摘要：代谢组学是对一个生物系统的细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定性定量分析, 从而定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学。

而高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）作为代谢组学中一种重要的分离检测方法，在代谢组学中有着方方面面的应用。

本文介绍代谢组学中的高效液相色谱-质谱联用技术，并从药物分析、生理病理代谢、临床诊断标志物和细胞鉴定等方面介绍高效色谱-质谱联用技术在代谢组学中的应用。

关键词：高效液相色谱-质谱联用技术；代谢组学代谢组学的研究目的就是从尿液、血浆、血清、唾液和胆汁等生物体终端样本中检测代谢物，或跟踪代谢水平整体的动态变化，提取“组学”信息，以此来反映生物体在外源刺激作用下的体内生物学过程变化情况。

代谢组学研究的基本流程包括样品采集、预处理、代谢组分析、数据分析以及研究结果的解释与应用等。

1.检测工具其中的样品采集分离与分析离不开分离检测工具。

常用的分离检测工具包括色谱(Chromatography)、质谱(Mass Spectrometry，MS)、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)等。

【1】1.1核磁共振（NMR）NMR快速、选择性好,其样品处理简单且不造成破坏,只要含氢的代谢物都可以被检测,即可以对所有的分析对象达到无歧视分析。

对样品无损伤且重复性好,能够广泛应用于药物工业和病人的尿、血样分析。

样本制备简单且易自动化。

但是复杂混合物的NMR谱的解析非常困难。

对全面的代谢谱图分析, NMR最大的缺陷是灵敏度相对较低, 从而使得它不适合分析大量的低浓度代谢物。

【2】所需硬件投资也比较大1.2色谱（Chromatography）气相色谱(Gas Chromatography，GC)广泛用于微量、痕量组分的分析。

但是，气相色谱受组分挥发性和热稳定性的限制，需对样品进行衍生化处理。

氨基酸分析检测方法的研究进展一、本文概述氨基酸作为生命活动的基本组成单位，其检测分析在生命科学、医学、食品科学、农业科学等领域中具有至关重要的作用。

氨基酸分析检测方法的研究进展不仅关乎理论科学的发展，更直接影响到实践应用中的质量控制、疾病诊断、营养评估等多个方面。

本文旨在综述近年来氨基酸分析检测方法的研究进展，包括传统方法的优化以及新兴技术的开发和应用，以期为推动氨基酸分析领域的持续进步提供参考。

我们将首先回顾氨基酸分析的传统方法，如色谱法、电泳法等，分析它们的优缺点及适用范围。

随后，将重点关注新兴技术在氨基酸分析中的应用，如质谱技术、光谱技术、生物传感器等，探讨这些技术在提高检测灵敏度、准确性和效率方面的优势。

我们还将讨论氨基酸分析在各个领域中的实际应用案例，以及面临的挑战和未来的发展趋势。

通过本文的综述，我们期望能够为读者提供一个全面而深入的视角，了解氨基酸分析检测方法的最新研究进展，以及这些方法在实际应用中的潜力和局限性。

我们也希望借此机会激发更多科研工作者对氨基酸分析领域的兴趣和热情，共同推动该领域的创新和发展。

二、传统氨基酸分析检测方法传统氨基酸分析检测方法主要包括色谱法、电泳法、化学分析法等。

这些方法在过去的几十年中得到了广泛的应用，为氨基酸的分析检测提供了重要的手段。

色谱法是最常用的氨基酸分析方法之一，其中主要包括离子交换色谱、氨基酸专用高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）等。

离子交换色谱基于氨基酸在离子交换剂上的吸附和解吸附作用，可以对氨基酸进行定性和定量分析。

HPLC具有高分辨率和高灵敏度，是分析复杂样品中氨基酸的有效方法。

GC则通过与衍生化试剂反应，将氨基酸转化为挥发性衍生物后进行分析。

电泳法是一种基于氨基酸在电场作用下的迁移速度差异进行分离的方法。

其中，薄层电泳和毛细管电泳是常用的电泳技术。

薄层电泳通过将氨基酸在支持介质上进行分离，可以用于简单样品的分析。

毛细管电泳则具有更高的分辨率和灵敏度，适用于复杂样品的分析。

高效液相色谱仪分析样品时常见的预处理方法高效液相色谱仪分析样品的预处理方法有过滤、离心、加速溶剂萃取、超临界流体萃取、固相萃取、固相微萃取、液相微萃取和衍生化等。

一、过滤常用的滤膜材质有纤维素、聚四氟乙烯和聚酰胺。

其中聚酰胺应用最广，是亲水材料，适合水溶液的过滤，不被HPLC常用溶剂所腐蚀，不含添加剂。

加速溶剂萃取1、原理：加速溶剂萃取是在提高温度（50～200℃）和压力（10.3～20.6MPa）下，用溶剂萃取固体或半固体样品。

2、特点：与传统萃取方式相比，加速溶剂萃取具有溶剂用量少、快速、对不同基体可用相同的萃取条件、萃取效率高、选择性好、使用方便、安全性好和自动化程度高等特点。

二、超临界流体萃取超临界流体萃取是利用超临界流体对物质的特殊溶解性能原理而建立的萃取方法。

超临界二氧化碳作为常用的萃取剂已被广泛应用于天然药物中非极性和弱极性有效成分的提取。

三、固相萃取1、原理：固相萃取是通过采用选择性吸附和选择性洗脱对样品进行富集、分离和净化，可以将其近似地看作一种简单的液固色谱过程。

2、固相萃取方法：（1）使液体样品溶液通过吸附剂，保留其中被测物质，然后选用适当强度溶剂冲去杂质，再用少量溶剂迅速洗脱被测物质，从而达到快速分离净化和浓缩的目的。

（2）可选择性吸附干扰杂质，让被测物质流出。

（3）可同时吸附杂质和被测物质，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。

四、固相微萃取1、原理：固相微萃取是基于涂敷在纤维上的高分子涂层或吸附剂和样品之间的吸附－解吸平衡原理，集采样、萃取、浓缩和进样于一体的无溶剂的样品微萃取方法。

2、常用固相微萃取方法：（1）直接固相微萃取：适用于气体基质和干净的水基质。

（2）顶空固相微萃取：适用于任何基质，尤其是直接固相微萃取无法处理的脏水、油脂、血液、污泥和土壤等。

（3）膜固相微萃取：通过选择性高分子渗透膜将样品与萃取头分离，进行间接萃取。

渗透膜的作用是使萃取头不被基质污染，提高萃取的选择性。