腺病毒载体构建

腺病毒与基因传递载体的构建与应用腺病毒（Adenovirus）是一种以双链DNA为基础的病毒，主要感染哺乳动物，包括人类。

由于具有较高的感染率和传播速度，在临床治疗和基因治疗等领域，被用作基因载体。

这篇文章将会介绍腺病毒作为基因传递载体的构建和应用。

一、腺病毒作为基因传递载体的构建腺病毒是一个十分复杂的病毒，其基因组由约36 kb的双链DNA组成。

它的基因组被分为两个方向，一个方向编码早期基因（E1A、E1B、E2、E3和E4），另一个方向编码晚期基因（L1-L5）。

早期基因编码的转录产物参与了病毒DNA的复制和转录，晚期基因主要编码病毒颗粒结构和组装所需的蛋白质。

基于这个理论框架，可以利用腺病毒基因组进行基因传递。

首先，必须构建一个适当的腺病毒载体（Adenoviral vector），其基本构造是一个缺少大部分基因组的腺病毒。

在此基础上，将感兴趣的DNA片段插入到腺病毒基因组里。

这需要掌握两种方法：重组技术和确认策略。

以重组技术为例，首先要得到一个带有感兴趣DNA片段的载体核酸。

这个DNA完整地包含了带有专门的重组序列的保护酶切位点，使其能够在目标腺病毒基因组上的互补位点诱导重组。

在这个操作后，形成了一个新的腺病毒基因组，其中包括感兴趣的DNA片段。

然后，改造后的基因组可以转染到腺病毒感染容器中，进行繁殖和扩增。

这一步骤可以提高已经构建的腺病毒载体的数量。

其次，需要构建一种辅助病毒（Adenoviral helper）来帮助前述的重组病毒形成成熟的病毒颗粒。

在这个方法中，辅助病毒中没有任何有价值的基因，因此它不能复制自己。

相反，它确保引入的重组病毒可以在感染容器中成功地产生新的病毒颗粒。

通过这样的步骤，可以构建出一种有效的载体，并用于下一步的实验设计。

二、腺病毒作为基因传递载体的应用腺病毒作为基因传递载体可以应用于基因治疗、疫苗研究、基因注入和细胞治疗等领域。

下面分别介绍一下相关应用的基本技术。

腺病毒载体的构建和应用随着生物工程技术的不断发展，越来越多的生物医学研究领域开始趋向于基因治疗和基因编辑等方向。

这些技术的实现需要一种特殊的工具——腺病毒载体。

腺病毒（Adenovirus）是一种不包含RNA病毒的DNA病毒，其表面包裹着许多蛋白质，使其具有较好的基因导入能力。

这使得腺病毒成为一种常用的基因载体，被广泛应用于细胞遗传学、基因治疗等领域。

腺病毒的构成腺病毒包含一个大小为36 kb的线性双链DNA，这条DNA上编码了丰富的基因信息，其中大约包含40个基因左右。

腺病毒分为革兰氏正染色体和非冠状病毒两种类型，目前在研究中应用最多的是非冠状病毒型腺病毒。

腺病毒载体构建的两种方法目前有两种主要的构建腺病毒载体的方法，分别是端到端的法和质粒基因重组的法。

端到端的法端到端的法在构建腺病毒载体时需要把目标基因全长克隆进腺病毒的基因组中。

这种方法在基因克隆、重组和转染等方面比较复杂，对实验人员的操作技能要求较高。

同时，这种方法的构建产物相对来说比较容易受到细胞内DNA修饰和限制性酶的影响。

质粒基因重组的法对比之下，质粒基因重组的法相对来说较为容易，需要构建的重组质粒包括表示目标基因的转录单元以及与腺病毒DNA重组所需的旁路序列等。

通过将质粒DNA转染至腺病毒蛋白质、酶和基因表达产物等组分共同构成的细胞核中，将质粒DNA与腺病毒DNA进行重组，从而构建出目标腺病毒载体。

质粒基因重组法不仅可以有效克服端到端法受到限制性酶和DNA修饰的影响，而且富于设计灵活度，从而满足更多的实验需求。

腺病毒载体的应用腺病毒载体广泛应用于人类和动物细胞体内的基因传递、基因治疗和基因工程方面。

通过腺病毒载体可进行基因敲除、基因转录和基因转译等一系列基因编辑操作。

基因敲除基因敲除是研究腺病毒载体理解生命过程和信号转导途径的重要手段之一。

通过基因敲除的方法可以对特定基因进行敲除，从而寻找与该基因相关联的复杂的生物学催化剂。

目前腺病毒载体敲除方法尤其得到广泛应用，对于生命科学研究者来说具有重要的意义。

TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR)，在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2]，将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。

在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高，由于脂质体的转染率较低和毒性较大，现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1，以提高转染率和降低毒性。

1材料与方法1.1质粒、菌株和细胞AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司；PBMC从人血分离；质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宫颈癌细胞）及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。

1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。

Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。

质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。

淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技XX公司。

1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如（图1）。

设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中，得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。

图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中，约24h后细胞密度达到60%～80%时，用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。

待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。

CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开
题报告
一、研究背景和意义：
癌症是世界公认的重大疾病之一，在其中恶性黑色素瘤的死亡率也非常高。

通过疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症的方法已经成为重要的研究方向，包括恶性黑色素瘤。

而MAGE-A3和CRT是在恶性黑色素瘤中表达的抗原，且它们的表达在癌细胞和正常细胞中有明显的差异。

因而它们被认为是恶性黑色素瘤的潜在免疫治疗靶点。

二、研究内容和方案
本研究通过将MAGE-A3和CRT基因插入到腺病毒载体中，构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体，并在细胞水平表达融合蛋白。

具体步骤如下：
1. 通过RT-PCR方法从恶性黑色素瘤组织中提取MAGE-A3和CRT 基因。

2. 将MAGE-A3和CRT基因克隆到腺病毒载体中，形成CRT/MAGE-A3重组载体。

3. 利用PCR进行扩增，通过酶切和测序进行CRT/MAGE-A3重组载体的鉴定。

4. 将CRT/MAGE-A3重组载体转染到恶性黑色素瘤细胞株中，通过Western Blotting方法检测融合蛋白CRT/MAGE-A3的表达和纯度。

三、研究预期结果
1. 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体。

2. 观察到CRT/MAGE-A3的表达并在细胞中得到验证。

3. 为下一步开展体内实验打下坚实基础，为疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症奠定理论基础。

四、研究意义
本研究有望为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供新的方法和思路，也有望开展潜在的抗癌疫苗研究。

同时还有望在癌症免疫治疗的新技术方面提供一定的探索，为癌症的预防和治疗提供新的思路和方法。

腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒（Adenovirus）是一类非常常见的病毒，它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。

在基因工程领域，腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。

通过对腺病毒进行适当的改造，可以将外源基因有效地传递到目标细胞中，并实现基因的高表达。

本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。

2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤：2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型，其中最常用的是腺病毒2（Ad2）和腺病毒5（Ad5）。

选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。

2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。

质粒载体通常由多个部分组成，包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。

通过合成或PCR扩增等方法，可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。

2.3 建立包装细胞系在构建过程中，需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。

这些细胞系通常包括两种类型的细胞：一种是质粒携带者，将质粒转染进细胞内；另一种是包装细胞，它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。

2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中，使其进入细胞内。

转染的方法可以采用常规的化学方法，如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。

2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后，通过转染和转座等过程，腺病毒基因组会产生复制和转录。

最终，腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒，从而完成腺病毒载体的构建。

3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。

以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍：•基因治疗：腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。

通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中，可以恢复或增强正常基因的功能，从而治疗相关疾病。

•疫苗开发：腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。

腺病毒载体构建与包装
腺病毒是一种双链DNA病毒，长约36kb，衣壳呈规则的20面体结构。

由于腺病毒具有宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、高滴度制备、外源基因装载容量大等优点，重组腺病毒载体已广泛地被应用于基础研究和临床试验中。

盎然生物提供的腺病毒系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架，在克隆、包装、扩增等方面做了改进和优化，达到了克隆阳性率更高、质量更可靠、包装稳定、产毒迅速、滴度高等效果。

所包装的腺病毒已成功应用于信号转导，基因转位，Co-IP，动物实验，干细胞研究等科研实验。

系统优势
(1) 包装容量大-包装容量可以达到6 kb；
(2) 宿主范围广-可以广泛感染分裂和非分裂的哺乳动物细胞；
(3) 病毒滴度高-病毒活性滴度可达到1 x 10^11 pfu/ml；
(4) 病毒可扩增-包装好的病毒可以在293a细胞系中进行扩增.
腺病毒包装腺病毒表达载体
腺病毒包装
详见“服务——病毒”栏目。

腺病毒表达载体
shRNA、miRNA、重组蛋白的腺病毒表达载体。

腺病毒质粒载体的构建及表达调控机制研究第一章引言腺病毒是一种广泛应用于基因治疗和基因表达的载体，由于其病毒自身不具有致病性，可以更安全地应用于临床治疗和药物研发。

腺病毒载体的构建和表达调控机制的研究是基因治疗和药物研发领域的热点问题。

本文将从腺病毒质粒载体的构建方法、载体的表达调控机制、及应用前景等方面进行探讨。

第二章腺病毒质粒载体的构建方法腺病毒的质粒载体构建需要遵循一定的规律和原则，以确保载体的高效性和稳定性。

现将常用的腺病毒质粒载体构建方法进行简要介绍：2.1 插入式构建法插入式构建法是最常用的构建方法之一，其基本原理是将外源基因片段插入到腺病毒质粒载体中，再通过体外转染等方法将整个质粒导入到细胞内进行转染。

插入式构建法具有构建简便、转染效能高、适用性强等优点。

但由于插入的外源基因片段较长且载体承载能力有限，仅适用于小分子基因的插入。

2.2 重组式质粒构建法重组式质粒构建法是从腺病毒DNA中特异性截取相应序列，并将其与外源基因片段重组形成新的质粒载体。

重组式质粒构建法具有高效性、稳定性等优点，能够承载大分子基因片段的插入。

但构建难度较大，需要较为专业的技术支持。

2.3 克隆式质粒构建法克隆式质粒构建法是将腺病毒基因组进行克隆，这种方法能够在保持病毒活性的前提下获得高效的转染效果和稳定性。

克隆式质粒构建法适用于需要经常进行高效转染以及灭活性病毒的构建，但需要高超的实验技能和完善的实验设备。

第三章腺病毒质粒载体的表达调控机制腺病毒质粒载体的表达调控机制是基因治疗和药物研发领域的重要问题之一。

本章将从内在调节和外部控制两个方面进行介绍。

3.1 内在调节内在调节是指在腺病毒质粒载体表达阶段，利用载体本身的启动子、基因调节元件等进行调节。

常用的内在调节方法有以下几种：3.1.1 CMV启动子调节CMV启动子是最常见的内在调节方法之一，其具有高效性、稳定性等优点。

CMV启动子能够在典型的哺乳动物细胞中发挥优异的表达效果，并能够适应细胞类型、转染条件等变化。

作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒学研究所病毒形态研究室#综述#腺病毒载体构建原理与方法的研究进展何金生王健伟洪涛由于腺病毒(Adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐,成为当今使用最多的病毒载体之一。

为了取得更满意的效果,人们在腺病毒载体构建与改进方面,做了大量工作。

本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下。

1腺病毒载体的构建原理腺病毒的基因组为线形双链DNA,长度约为36kb,被包装在一个二十面体的蛋白质外壳内,可分为编码区和非编码区。

编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种,前者有E1、E2、E3、E4四个区,编码病毒的调节蛋白,后者有L1、L2、L3、L4、L5五个区,编码病毒的结构蛋白。

非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。

除E3区外,其余的编码区及顺式作用元件均为病毒复制所必需。

第1代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和P或E3两个区而获得,其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的293细胞中完成。

其主要优点为:在体外有很高的繁殖滴度(1011~1012PFU P ml);易感的宿主细胞范围广,既能感染增殖细胞,又能感染非增殖细胞;病毒基因组存在于细胞染色体外,避免了因整合引起的细胞突变。

但由于病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列。

在293细胞中繁殖时,通过重组,可重新获得E1区,出现复制型腺病毒(Replication-competent Ads, RCAs),这使得第1代腺病毒载体的应用受到限制112。

此外,由于发现在多种转化及原代的细胞内存在具有Ela样活性(Ela-like activity)的物质,因而E1区缺失的腺病毒载体在这些细胞内,仍能进行Ela非依赖性的腺病毒DNA复制,并从头合成病毒的早期和晚期蛋白,激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫,使载体在体内的持续时间以及再次应用均受到极大影响122。

重组腺相关病毒（AAV）载体构建技术原理腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微⼩病毒科（parvoviridae）家族的成员之⼀，是⼀类⽆法⾃主复制、⽆被膜的⼆⼗⾯体微⼩病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。

研究中采⽤的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在⾮致病的野⽣型AAV基础上改造⽽成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性⾼、宿主细胞范围⼴（对分裂细胞和⾮分裂细胞均具有感染能⼒）、扩散能⼒强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之⼀。

AAV基因组结构悬浮框：包装纯化及滴度检测--侵染细胞过程-- rAAV载体优势—rAAV⾎清型选择—应⽤案例rAAV包装纯化及滴度检测AAV包装过程中，包装质粒负责编码⽬的基因以及两个末端反向重复序列（ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作⽤），辅助质粒包含AAV包装所需的cap（编码病毒⾐壳蛋⽩）和rep（参与病毒的复制）基因，以及腺病毒Helper质粒。

三种质粒共同转染293T细胞后，AAV病毒开始复制和包装。

和元⽣物腺相关病毒的⽣产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采⽤三质粒系统在293T细胞中进⾏包装。

所获得的病毒颗粒经过超速离⼼纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进⾏滴定。

另外，我们也可以根据使⽤者要求，提供蛋⽩染⾊检测⾐壳蛋⽩的完整性以及内毒素含量等。

⼀般情况下rAAV的滴度在1012~1013VG/ml，完全可以满⾜各类整体实验的使⽤要求。

AAV包装流程图滴度检测⽅法：定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。

滴度检测原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA，外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。