腺病毒载体构建分析

TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体的构建与鉴定的开题报告1.研究背景组织金属蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）是一种重要的蛋白质, 在细胞外基质的代谢中起到关键调节作用。

TIMP-3通过抑制细胞外基质蛋白酶的活性, 可以防止血管增生、细胞迁移和肿瘤形成等多种疾病的发生。

因此, TIMP-3的研究在生物医药领域有着广泛的应用价值。

为了更有效地研究TIMP-3的功能和机制, 研究人员通常会采用基因工程方法构建TIMP-3基因的合成载体, 并进行表达和纯化。

近年来, 利用腺病毒作为载体的基因转染技术已经成为常用的基因转移方法, 因为腺病毒具有高效的基因转染能力、针对性强以及易于操作等优点。

2.研究目的本研究旨在构建一种TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体, 并通过激光共聚焦显微镜、Western blot等方法对其进行鉴定, 为后续TIMP-3的功能研究提供支持。

3.研究内容和方法3.1 构建TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体根据TIMP-3的序列, 合成TIMP-3N端结构域的cDNA, 并将其克隆到经过修饰的腺病毒载体中。

然后, 将构建好的载体转染到HEK 293FT细胞中, 并筛选出稳定的重组腺病毒载体。

3.2 鉴定TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体通过激光共聚焦显微镜观察TIMP-3N端结构域的表达情况, 并使用Western blot 方法检测TIMP-3N端结构域的蛋白表达水平和纯度。

同时, 通过对重组腺病毒载体传染其他细胞系, 检测其基因转染效率和稳定性。

4.预期结果本研究将构建出一种TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体, 并通过激光共聚焦显微镜、Western blot等方法对其进行鉴定, 验证其表达能力、纯度以及基因转染效率和稳定性等参数。

这将为后续TIMP-3的功能研究提供重要的实验支持, 具有重要的理论和应用价值。

腺病毒载体的构建和应用随着生物工程技术的不断发展，越来越多的生物医学研究领域开始趋向于基因治疗和基因编辑等方向。

这些技术的实现需要一种特殊的工具——腺病毒载体。

腺病毒（Adenovirus）是一种不包含RNA病毒的DNA病毒，其表面包裹着许多蛋白质，使其具有较好的基因导入能力。

这使得腺病毒成为一种常用的基因载体，被广泛应用于细胞遗传学、基因治疗等领域。

腺病毒的构成腺病毒包含一个大小为36 kb的线性双链DNA，这条DNA上编码了丰富的基因信息，其中大约包含40个基因左右。

腺病毒分为革兰氏正染色体和非冠状病毒两种类型，目前在研究中应用最多的是非冠状病毒型腺病毒。

腺病毒载体构建的两种方法目前有两种主要的构建腺病毒载体的方法，分别是端到端的法和质粒基因重组的法。

端到端的法端到端的法在构建腺病毒载体时需要把目标基因全长克隆进腺病毒的基因组中。

这种方法在基因克隆、重组和转染等方面比较复杂，对实验人员的操作技能要求较高。

同时，这种方法的构建产物相对来说比较容易受到细胞内DNA修饰和限制性酶的影响。

质粒基因重组的法对比之下，质粒基因重组的法相对来说较为容易，需要构建的重组质粒包括表示目标基因的转录单元以及与腺病毒DNA重组所需的旁路序列等。

通过将质粒DNA转染至腺病毒蛋白质、酶和基因表达产物等组分共同构成的细胞核中，将质粒DNA与腺病毒DNA进行重组，从而构建出目标腺病毒载体。

质粒基因重组法不仅可以有效克服端到端法受到限制性酶和DNA修饰的影响，而且富于设计灵活度，从而满足更多的实验需求。

腺病毒载体的应用腺病毒载体广泛应用于人类和动物细胞体内的基因传递、基因治疗和基因工程方面。

通过腺病毒载体可进行基因敲除、基因转录和基因转译等一系列基因编辑操作。

基因敲除基因敲除是研究腺病毒载体理解生命过程和信号转导途径的重要手段之一。

通过基因敲除的方法可以对特定基因进行敲除，从而寻找与该基因相关联的复杂的生物学催化剂。

目前腺病毒载体敲除方法尤其得到广泛应用，对于生命科学研究者来说具有重要的意义。

腺病毒体的结构和功能研究腺病毒是一类广泛存在于自然界中的病毒，其细胞寄主包括哺乳动物、鸟类、爬行动物和昆虫等各种生物。

腺病毒体的结构和功能研究一直是生物学研究的热点之一，因为深入了解腺病毒的结构和功能，可以为病毒学、基因工程和疾病治疗等领域的研究提供基础和前提。

一、腺病毒体结构的主要组成部分1. 外壳层腺病毒体的外壳层主要由两种蛋白质组成：纤维蛋白和六角蛋白。

纤维蛋白是一种长而纤细的蛋白物，具有良好的粘附能力，因此可以有效地与宿主细胞结合。

六角蛋白则是形成整个外壳层的基础构件，它们排列成六边形网络，使其具有较高的结构稳定性。

2. 蛋白质盖层和核酸外壳蛋白质盖层和核酸外壳位于外壳层的内部，是构成腺病毒体的另两个重要组成部分。

蛋白质盖层是由三种不同的蛋白质分别组成，其含量分别为30%、7%和2%。

这些蛋白质主要负责调节腺病毒的复制和感染能力。

核酸外壳则是由蛋白质盖层包围的一个空间，其中嵌入了腺病毒的基因组。

二、腺病毒体的功能及研究意义1. 作为病毒的载体腺病毒体是一种病毒载体，可以在转导的过程中将外源基因导入到宿主细胞中，从而达到进行基因治疗的目的。

因为腺病毒具有易于操控、稳定性高、容纳大量基因等优点，所以在医学研究领域中被广泛应用。

2. 感染宿主细胞腺病毒可以通过接触宿主细胞表面的受体，从而逐步感染宿主细胞。

为了实现优良的感染效果，腺病毒会根据细胞表面的特定受体选择适当的结构。

3. 克隆表达载体腺病毒在研究领域中广泛应用。

一方面用于研究蛋白质的表达、分泌与功能；另一方面，腺病毒也常用于拷贝特定目标序列（如DNA或RNA），并将这些序列导入到人工选定的宿主细胞中进行表达。

因此，腺病毒被称为是分子生物学研究和基因工程研究中一种最为常见的表达载体。

总之，腺病毒体的结构和功能的研究，是理解这种病毒如何感染和繁殖的重要途径，也是人类探索病毒与宿主相互作用的重要契机。

在未来的研究中，我们有理由相信，随着新一代高分辨率成像技术和生物化学工具的引入，对于腺病毒体结构和功能研究的深化，必将为基因治疗、疾病预防和治疗开辟更为广阔的道路。

TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR)，在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2]，将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。

在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高，由于脂质体的转染率较低和毒性较大，现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1，以提高转染率和降低毒性。

1材料与方法1.1质粒、菌株和细胞AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司；PBMC从人血分离；质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宫颈癌细胞）及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。

1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。

Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。

质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。

淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技XX公司。

1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如（图1）。

设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中，得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。

图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中，约24h后细胞密度达到60%～80%时，用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。

待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。

腺病毒载体的构建与基因治疗的研究在现代医学中，基因治疗作为一种新型的治疗手段，已经逐渐受到人们的关注。

而腺病毒载体的构建是基因治疗研究中不可避免的部分。

本文将围绕腺病毒载体的构建和基因治疗的研究展开论述。

一、腺病毒及其载体的特点腺病毒(Adenovirus)是一类非常常见的病毒，其特点是具有两种形态：圆形和20面体。

腺病毒可以感染人类、猴子、猪、牛和小鼠等动物，可能引起感染后的发热、呼吸困难等症状。

然而，腺病毒毒株相对较多，结构和生命周期也非常适合于基因搭载和转导。

因此，腺病毒载体成为一种被广泛使用的基因治疗载体。

腺病毒载体的特点是将外源基因插入到其某些基因区域内，通过腺病毒本身的生命周期，将基因表达的信使RNA传递到细胞内，实现基因治疗。

二、腺病毒载体的构建针对腺病毒载体的构建，一般可分为以下几个关键步骤：1.选择腺病毒毒株目前，已经有大量的腺病毒毒株被发现和鉴定。

选择恰当的腺病毒毒株，可以针对不同治疗疾病的目的，选择合适的载体来完成基因治疗。

2.构建质粒在选择了合适的腺病毒毒株后，需要构建质粒，以便将外源基因并入腺病毒的基因组。

质粒中除了外源基因外，还包括其他辅助基因，比如腺病毒毒衣壳外衣和细胞克隆等。

而且，对于外源基因的选择，需要考虑到其表达效率和拓扑结构等方面。

3.转染细胞和腺病毒表达质粒构建完成后，通过转染细胞并带入质粒中的外源基因，使细胞“表达”出腺病毒。

随着腺病毒的制备，将腺病毒载体大量表达出来。

三、基因治疗的研究基因治疗是一种针对遗传病和非遗传病的新型治疗方法，它通过人工调控异常基因的表达，达到基因治疗的效果。

具体来说，是针对某些致病基因的缺失或突变，通过腺病毒载体的插入溶液，传递外源基因到受体细胞中，使外源基因代替致病基因，达到基因治疗的效果。

研究表明，基因治疗可以在癌症、神经系统疾病、血液系统疾病、因人类免疫缺陷病毒感染引起的疾病、代谢性疾病等方面发挥重要作用。

四、展望尽管基因治疗在现在处于起步阶段，但在未来，随着载体、技术的不断改进和完善，它在医学领域的应用将会越来越广泛，并会为治疗一些顽疾带来新的突破。

CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开
题报告
一、研究背景和意义：
癌症是世界公认的重大疾病之一，在其中恶性黑色素瘤的死亡率也非常高。

通过疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症的方法已经成为重要的研究方向，包括恶性黑色素瘤。

而MAGE-A3和CRT是在恶性黑色素瘤中表达的抗原，且它们的表达在癌细胞和正常细胞中有明显的差异。

因而它们被认为是恶性黑色素瘤的潜在免疫治疗靶点。

二、研究内容和方案
本研究通过将MAGE-A3和CRT基因插入到腺病毒载体中，构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体，并在细胞水平表达融合蛋白。

具体步骤如下：
1. 通过RT-PCR方法从恶性黑色素瘤组织中提取MAGE-A3和CRT 基因。

2. 将MAGE-A3和CRT基因克隆到腺病毒载体中，形成CRT/MAGE-A3重组载体。

3. 利用PCR进行扩增，通过酶切和测序进行CRT/MAGE-A3重组载体的鉴定。

4. 将CRT/MAGE-A3重组载体转染到恶性黑色素瘤细胞株中，通过Western Blotting方法检测融合蛋白CRT/MAGE-A3的表达和纯度。

三、研究预期结果
1. 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体。

2. 观察到CRT/MAGE-A3的表达并在细胞中得到验证。

3. 为下一步开展体内实验打下坚实基础，为疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症奠定理论基础。

四、研究意义
本研究有望为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供新的方法和思路，也有望开展潜在的抗癌疫苗研究。

同时还有望在癌症免疫治疗的新技术方面提供一定的探索，为癌症的预防和治疗提供新的思路和方法。

腺病毒载体工艺平台介绍腺病毒载体是一种常用的基因传递工具，被广泛应用于基因治疗和基因工程研究领域。

为了应对不同研究需求和提高载体表达效率，许多研究人员和企业建立了腺病毒载体工艺平台，以帮助加速基因传递和基因治疗的研究进展。

腺病毒载体工艺平台是一种综合的研究和生产系统，主要包括以下几个方面：1. 载体构建：利用分子生物学技术，将感兴趣的基因序列插入腺病毒基因组的合适位点。

在载体构建过程中，可以根据需要选择不同的载体类型、启动子、响应元件等，以调控基因的表达水平和时机。

2. 载体包装：通过与辅助质粒（helper plasmid）共转染细胞，使细胞内形成完整的腺病毒基因组，并通过细胞内重组事件来复制和包装腺病毒颗粒。

载体包装的过程中，通常需要参考文献中的方法和优化步骤，以获得高效的包装效率。

3. 病毒扩增：将包装好的腺病毒载体接种到适宜的宿主细胞中，通过培养和扩增过程，使腺病毒繁殖并增加至足够的浓度。

扩增过程中要注意控制细胞的生长状态、感染剂量和细胞培养条件，以获得高产量和活性的腺病毒。

4. 病毒纯化：通过离心、超滤和柱层析等技术手段，从扩增培养物中纯化腺病毒颗粒。

纯化过程中，可以采用单步或多步骤的方法来去除杂质、浓缩和提纯腺病毒。

5. 固定化：对腺病毒进行固定化处理，可用于获得更稳定、可储存和长期使用的腺病毒制剂。

常用的固定化方法包括酶解固定化、化学固定化、冻干固定化等。

6. 质量检测：对纯化的腺病毒产品进行质量鉴定，包括病毒滴度测定、细胞感染测定、基因表达水平测定等。

同时，还可以进行病毒颗粒观察、基因序列测定、重组蛋白表达等验证实验。

腺病毒载体工艺平台的建立有助于提高基因治疗和基因工程研究的效率和可靠性。

通过系统、规范和高效的工艺流程，可以大幅度减少研究人员在载体构建、病毒包装和纯化等环节上的工作量，同时提高腺病毒的产量和纯度。

这为基因治疗的临床应用以及基因工程研究提供了可靠的技术支持。

腺病毒载体工艺平台是基因治疗和基因工程研究中不可或缺的一部分。

人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定作者：蔡军，林国生，江洪，王腾，曾彬，罗浩，郭军，李俊，汪蕾【关键词】腺病毒科Construction and identification of human HCN4 gene recombinant adenovirus【Abstract】AIM: To construct the recombinant adenovirus of human HCN4 gene. METHODS: HCN4 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV to form the transfer vector by the methods of homogeneous recombination in bacteria and the recombinant adenovirus was then transfected into 293 cells using Lipofectamine 2000. The target gene was detected by polymerase chain reaction (PCR) and the titer and its infection rate were determined using the green fluorescent protein (GFP) expression in the shuttle plasmid. RESULTS: Restriction enzyme digestion analysis and the sequence analysis confirmed that the HCN4 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was ×1015 pfu/L. GFP was observed in thetransfected 293 cells under a fluorescent microscope. CONCLUSION: The recombinant adenovirus containing human HCN4 gene is successfully constructed by the method of homogeneous recombination in bacteria.【Keywords】 HCN gene; adenoviridae; recombination, genetic【摘要】目的：构建超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN4）重组腺病毒载体. 方法：采用基因工程技术，将HCN4 cDNA 定向克隆至穿梭载体pAdTrackCMV中，利用pAdeasy1系统进行细菌内同源重组后，脂质体转染293T细胞包装、扩增，CsC1密度梯度超速离心纯化. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定，利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因，对病毒滴度和感染效率进行监测. 结果：测序结果证明成功构建了HCN4基因重组腺病毒载体，病毒滴度达×1015pfu/L. 结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含人HCN4基因的重组腺病毒载体.【关键词】 HCN基因；腺病毒科；重组，遗传0引言起搏电流（If）在窦房结生理性起搏机制中担当重要角色，同时也是自主神经调节心脏节律的主要靶点，其编码基因为超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN）［1-4］. HCN超家族包括HCN1～HCN4型，其中HCN4占窦房结HCN总mRNA的80%［5］. 最近研究发现，在家族性或遗传性窦房结功能障碍家系中存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］. 为了进一步深入研究HCN4的通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，积极开展窦房结功能障碍的基因治疗，我们构建了表达HCN4的重组腺病毒载体.1材料和方法1．1材料腺病毒细菌内同源重组系统包括Bj5183、穿梭质粒pAdTrackCMV及腺病毒骨架质粒pAdeasy1（美国Johns Hopkins大学Dr. He TC惠赠）；293细胞系（武汉大学细胞典藏中心）；各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase A（TaKaRa公司）；转染试剂Lipofectamine 2000（Gibco BRL）；PCR产物回收纯化试剂盒（Promega公司）；质粒提取试剂盒（Hispeed Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司）；氯化铯（Sigma公司）. 其余各种试剂均为进口或国产分析纯试剂.1．2方法1．2．1穿梭载体pAdTrackCMV HCN4的构建和鉴定1．2．1．1pAdTrackCMVHCN4的构建质粒用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后回收 kb的HCN片段. 穿梭质粒pTrackCMV用HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切后回收载体骨架，T4 DNA连接酶连接载体骨架与目的基因片段得到重组质粒pTrackCMVHCN4. 转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，质粒提取试剂盒提取质粒.1．2．1．2pAdTrackCMVHCN4的酶切鉴定取 mL离心管，依次加入酶切缓冲液2 μL，内切酶HindⅢμL，内切酶XbaⅠμL, 重组质粒μL，去离子水μL，充分混匀，37℃水浴2 h，酶切后10 g/L琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带.1．2．2细菌内同源重组产生腺病毒质粒用100 mL/L的冰冷的无菌甘油制备 BJ 5183及 DH5α电穿孔感受态菌，将穿梭质粒pAdTrackCMVHCN4用PmeⅠ线性化，纯化回收酶切产物. 分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy1等浓度比混合，在2500 V, 200 Ω, 25 μF 条件下，电转化BJ5183感受态菌，卡那霉素（50 mg/L）固体LB培养基筛选，16 h后挑取10个克隆，提取质粒. PacⅠ酶切鉴定阳性克隆得到重组腺病毒质粒pAdHCN4. 重组腺病毒质粒pAdHCN4的序列测定：以质粒提取试剂盒提取的高纯度质粒为模板，双脱氧核苷酸终止法测序，以SP6Promter Primer为测序引物，采用ABI PRISM B DyeTM测序试剂盒在ABI PRISMTM377XL DNA sequncer序列分析仪上对插入片段进行序列测定.1．2．3293细胞中包装产生重组腺病毒利用HEK293细胞可稳定表达复制缺陷病毒Ad5 E1基因的特性，将重组病毒质粒包装成有完整功能的重组病毒颗粒. 转染前24 h于每个T25 cm2培养瓶中接种1×106细胞，转染时细胞密度为50%～70%. 转染当日，将4 μg pAdHCN4质粒用PacⅠ酶切线性化，用20 μL Lipofectamine 2000按说明转染293细胞，2 d后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，2 wk后收集细胞. -70℃/37℃/Vortex反复冻融4次，取1/5病毒提取上清再感染293细胞扩增，3~4 d后收集细胞，PBS重悬，反复冻融，离心收集病毒上清，保存于-80℃.1．2．4重组腺病毒大规模扩增及CsC1密度梯度超速离心纯化按照上述方法连续扩增病毒5~6轮，最后共感染了大约3×108个293细胞，3~4 d后收集病毒上清，制备CsC1低密度母液（1200 g/L）和高密度母液（1460 g/L）. 将高、低密度母液以及病毒上清加至超速离心管中，以10 000 g于4℃离心3~4 h，侧向穿刺小心吸出病毒条带，加入透析袋中透析12 h，其间更换透析缓冲液（10 mmol/L TrisHC1 pH , 1 mmol/L MgC12, 10 mL/L甘油）3次，透析完全后，用2×病毒储存液（19 mmol/L TrisHC1 pH , 100 mmol/L NaC1, 1 mL/L BSA, 50 mL/L甘油）按1∶1稀释病毒，μm滤膜过滤，分装后放-80℃保存，得到纯化好的病毒AdHCN4.1．2．5病毒滴度测定先用A值初步估算：取15 μL纯化好的病毒用 mL H2O稀释15 μL高密度CsC1母液作为空白对照，测A260 nm值，按1012/VP/A260 nm进行换算. 再以GFP法进行测定：将病毒储存液作不同比例的稀释，取500 μL稀释液加至T25 cm2培养瓶培养的293细胞中，于37℃吸附30 min换新鲜培养基继续培养36 h，在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数，按病毒滴度（pfu/mL）=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/ mL计算.1．2．6重组腺病毒的鉴定目的基因的PCR鉴定，根据HCN4 cDNA的碱基序列，设计了HCN4的寡聚核苷酸引物：正向引物： 5′GGCATGTCCGACGTCTGGCTCA3′；反向引物：5′TCACGAAGTTGGGGTCCGCATT GG3′. 提取病毒基因组DNA： 2 mL PBS 收集2种病毒感染后发生病变的293细胞，冻融4次，于4℃ 600 g 离心10 min取上清，加入200 μL蛋白酶K （5 g/L），并加入2 mL SET裂解液（10 mL/L SDS, 10 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris HCl pH ），56℃消化2 h, 3000 g离心10 min取上清，等体积的酚/氯仿抽提一次，无水乙醇沉淀，20 μL TE溶解，以上述病毒基因组DNA为模板，进行PCR: 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸90 s，共35个循环，最后于72℃延伸10 min，产物用10 g/L琼脂糖电泳进行鉴定. 2结果2．1穿梭载体pAdTrackCMVHCN4的鉴定重组质粒被切成的片段与理论预期一致，表明HCN4 cDNA序列已成功插入pAdTrackCMV 载体中，且连接正确（Fig 1）.2．2重组腺病毒质粒pAdHCN4的序列测定用一条PCR鉴定引物进行测序，测定序列结果与GenBank报道的序列完全一致（Fig 2）.2．3重组腺病毒在293细胞中包装、扩增及纯化将腺病毒质粒pAdHCN4用PacⅠ酶切线性化后转染293细胞，2~3 d后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白的表达，说明有感染力的病毒颗粒包装成功（Fig 3）. 将大规模扩增所得到的病毒液经过CsC1密度梯度超速离心的方法进行纯化，并经过透析得到可以直接用于在体实验的重组腺病毒AdHCN4.2．4病毒滴度的测定应用A值和GFP法测得AdHCN4最终的滴度为×1015pfu/L.2．5重组腺病毒AdHCN4中HCN4基因的PCR鉴定提取AdHCN4病毒基因组DNA，以HCN4基因的引物进行PCR鉴定，结果AdHCN4可见353 bp的阳性扩增条带，而AdGFP没有条带（Fig 4）.3讨论心律失常是影响人们健康威胁人们生命的疾病. 心律失常遗传基因的发现以及突变监测的进展促进了心律失常基因治疗的研究. 最近的研究结果都提示HCN4基因是具有很大潜力的基因治疗的靶基因：①在遗传性窦房结功能障碍患者存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］；②在HCN4基因敲除的鼠胚胎心脏记录不到具有4期自动除极特征的起搏细胞动作电位，胚胎不能发育成熟［8］；③胚胎心室肌细胞在早期阶段（）具有自发除极能力，晚期（）则丧失起搏能力，其机制在于HCN4表达持续性下调及If进行性减少［9］. 因此，HCN4转染的心肌细胞将过度表达If从而具备4期自动除极能力，这将可能构建建立在基因工程基础上的生物起搏器. 我们成功的构建了重组腺病毒载体AdHCN4，可以通过腺病毒载体将HCN4导入体外培养的细胞深入研究HCN4通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，也可以心肌内注射开展窦房结功能障碍的基因治疗，为今后的临床应用奠定坚实的基础.由于腺病毒载体的病毒滴度高、容量大、转导效率高、感染范围广以及稳定性好，因此被广泛应用于各种基因治疗中. He等［10］首次介绍细菌内同源重组法，此方法简便快捷，实验周期短，极大地方便了构建重组腺病毒. 目前美国Johns Hopkins Oncology Center 制备了含腺病毒核心基因组pAdEasy1的BJ5183细菌，即AdEasy1（亦称作BJAEasy或AdEasier细菌），与pAdTrack或pAdTrackCMV等穿梭质粒共同组成一个高效重组腺病毒构建系统，只需将含目的基因的穿梭质粒线性化后转化AdEasy1获得重组腺病毒质粒，再经293细胞包装、扩增便可获得所需重组腺病毒，因此选用该系统进行目的基因的修饰在时效上有很大优势.我们希望能够以腺病毒载体为介导，进一步研究HCN4基因在生理性起搏中的功能角色及其分子机制，探索HCN4基因作为基因治疗靶基因的价值，为窦房结功能障碍和重度房室传导阻滞的基因治疗提供候选基因，并为临床前研究提供实验依据. 我们在前一阶段的研究中曾通过窦房结细胞移植来修复或重建心脏优势起搏点以完全或部分代替窦房结功能［11，12］. 但由于人的胚胎心肌细胞移植受到伦理学争议，限制了其在临床上的应用. 由于建立在基因工程基础上的“生物起搏器”可以进行大规模生产，有望成为比电子起搏器更便宜、更安全、更灵敏、创伤更小、更适宜于儿童治疗的新选择，具有广阔的临床应用前景和巨大的社会经济效益.【参考文献】［1］ DiFrancesco D, Ferroni A, Mazzanti M, et al. Properties of the hyperpolarizingactivated current in cells isolated from the rabbit sinoatrial node ［J］. J Physiol, 1986;377(5):61-67.［2］ Moonsmang S, Stieber J, Zong X, et al. Cellular expression and function characterization of four hyperpolarizationactivated pacemaker channels in cardiac and neuronal tissues ［J］. 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Ad-IRE1α腺病毒载体的构建及对软骨细胞分化与凋亡的效应研究的开题报告题目：Ad-IRE1α腺病毒载体的构建及对软骨细胞分化与凋亡的效应研究研究背景及意义：软骨组织是一种特殊的结缔组织，具有一定的韧性和弹性，在机体内具有很重要的功能，如支持身体结构、吸收冲击力、减轻摩擦等。

但软骨缺乏血管和神经的供应，且细胞数量较少，修复能力较差，因此软骨损伤的治疗一直是一个难题。

最近的研究表明，内质网应激（ER stress）与软骨细胞的分化和凋亡密切相关。

IRE1α作为内质网应激信号通路中最重要的分子之一，在细胞凋亡和分化过程中具有重要作用。

因此，研究IRE1α信号通路在软骨细胞分化和凋亡中的作用，对于开发软骨组织再生治疗策略具有重要的理论和实际意义。

本研究拟通过构建Ad-IRE1α腺病毒载体，实现IRE1α的特异性表达，进一步研究IRE1α在软骨细胞分化和凋亡中的作用，以期为软骨组织再生治疗策略的开发提供新的思路和实验依据。

研究内容及方法：1.构建Ad-IRE1α腺病毒载体。

采用腺病毒载体设计软件，设计IRE1α基因的重组腺病毒载体，采用常规的腺病毒包装技术，构建Ad-IRE1α腺病毒载体。

2.体外软骨细胞培养。

从小鼠软骨中分离并培养软骨细胞。

用不同浓度的Ad-IRE1α腺病毒感染软骨细胞，分别培养24h、48h和72h，采用Western blotting检测IRE1α的表达情况，并进一步观察IRE1α表达对软骨细胞的形态学改变和细胞增殖的影响。

3.研究IRE1α在软骨细胞分化和凋亡中的作用机制。

对不同浓度的Ad-IRE1α腺病毒感染的软骨细胞进行Alcian blue染色和碱性磷酸酶染色，检测软骨细胞分化的能力，同时采用TUNEL检测IRE1α表达对软骨细胞凋亡的影响。

预期效果：本研究将构建IRE1α基因的重组腺病毒载体，实现IRE1α的特异性表达，进一步研究IRE1α在软骨细胞分化和凋亡中的作用。