重组腺病毒载体的构建

人白介素２４基因重组腺病毒载体的构建与鉴定【摘要】目的构建含有人白介素24（hIL-24）基因的重组腺病毒载体，为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究奠定实验基础。

方法采用基因工程技术将hIL-24基因的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,鉴定正确后在PAdEasy系统中进行细菌内同源重组，通过脂质体将正确重组体包裹并转染293A 细胞以包装并扩增病毒。

采用酶切及PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。

结果酶切和PCR结果证实hIL-24基因重组腺病毒载体构建成功并可在293A细胞中表达，病毒滴度达107pfu/ml。

结论成功构建了有较强感染能力的含hIL-24基因的重组腺病毒载体。

【Abstract】ObjectiveTo construct and identify the recombinant adenovirus vector of human IL-24 gene for future gene therapy of pathological scar tissue. MethodsThe human IL-24 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrack-CMV to form the transfer vector by the method of homogenous recombination in bacteria of PAdEasy system. Then the right recombinant adenovirus was transfected into 293A cells using Lipofectine 2000. The recombinant adenovirus vector was identified by restriction enzyme digestion and polymerase chain reaction (PCR). ResultsRestriction endonuclease and PCR analysis confirmed that the human IL-24 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was 107pfu/ml. ConclusionThe recombinant adenovirus vector of hIL-24 was successfully constructed with highly infection.【Key words】Human IL-24 gene; Adenovirus; Pathological scar人白介素24基因（hIL-24）是一种肿瘤抑制基因，通过多种途径抑制、诱导、细胞的生长，对肿瘤细胞有选择性杀伤作用而对正常组织几乎无毒副作用，并且具有调节免疫系统的功能，是当今人们研究的热点[1]。

重组腺病毒包装技术构建原理腺病毒包装系统采用第1代重组腺病毒包装系统制备腺病毒颗粒，该包装系统包含1个腺病毒载体和l株包装细胞株。

1)1个腺病毒载体：含有缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列的质粒。

2)l株包装细胞株：表达El基因的293细胞。

野生型腺病毒基因组是一条约36 kb的线性双链DNA (dsDNA)分子。

基因组的两个末端被称为Inverted Terminal Repeat (ITR)，末端之间含有腺病毒DNA复制所需基因。

在病毒DNA复制周期早期表达的基因，称为早期基因，主要有4个，按表达先后顺序依次是E1、E2、E3、E4。

在病毒DNA复制周期晚期表达的基因，称为晚期基因，主要有5个，按表达先后顺序依次为Ll、L2、L3、L4、L5。

为了制备出自我失活的重组腺病毒，E1基因会被删除，使重组腺病毒成为一种安全的基因运输工具。

为了增加包装能力，E3基因也同时被删除，因为E3基因产物会提高宿主的免疫反应，而且对病毒生产不重要。

缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上构建成腺病毒载体。

El基因片段被整合到293细胞基因组中，包装病毒颗粒时，Pacl消化的腺病毒载体转梁到表达E1基因的293细胞。

El基因激活了其他早期基因和晚期基因的表达，这些基因表达产物和Pacl消化的质粒DNA 组装成病毒颗粒。

腺病毒生产生产携带目的基因的重组腺病毒颗粒，过程如下图：将环形腺病毒载体通过Pacl位点酶切后获得两末端是ITR序列的线性双链DNA，再转染线性化DNA到包装细胞。

线性化双链DNA分饰两个角色，既是病毒基因组，又是病毒蛋白表达所参照的基因模板序列。

基因组与病毒蛋白组装成病毒颗粒，病毒颗粒在细胞内成熟后，使得细胞破裂，从而使病毒颗粒释放到培养液中。

然后收集细胞和培养液，反复冻融细胞和培养液的混合物，离心收集上清，获得粗病毒。

此时的粗病毒量通常不会很高，一般会将粗病毒感染更多的包装细胞，以扩增病毒量。

FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64构建的实验研究徐瑞剑王志强包头市九原区医院胸外科内蒙古包头 014060内蒙古自治区自然科学基金项目项目编号2009MS1148通讯作者：王志强Xu ruijian Wang zhiqiangDepartment of Thoracic Surgery, Jiuyuan District Hospital of Baotou, Baotou Inner Mongolia 014060实验目的：构建纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组人腺病毒载体（Ad.FnCBD64）。

实验方法：1.FnCBD64重组腺病毒粘粒载体的构建。

2.293细胞和Hela细胞的培养。

3.磷酸钙转染。

4. 筛选和扩增FnCBD64基因重组腺病毒。

5．设计公共PCR引物。

6. 鉴定Ad. FnCBD64重组腺病毒。

7. 浓缩纯化重组腺病毒。

8. 测定病毒滴度（50％组织培养感染量TCID50）。

9.体外安全性研究。

结果：成功构建了纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64。

结论：本实验成功地构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒，为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞的黏附力提供了转染载体，使应用骨髓间质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能。

运用基因转染的技术加强及改造种子细胞的功能是组织工程研究中的热点问题之一。

通过这一手段的应用，不仅能获得具备旺盛生理功能的种子细胞，而且还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白，有利于组织构建。

腺病毒载体是组织工程基因改造的常用的病毒性载体，同其他的载体体系对比，腺病毒载体是最具有潜力的载体之一，具有高效感染分裂细胞及非分裂细胞能力，制备容易、纯化和储存方便，并且滴度高、容量大[1]。

能插入大片段的目的基因，携带的外源基因不会整合在宿主染色体中，在靶细胞内以附加体形式存在，插入突变的危险极低，具有较低的遗传毒性。

TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR)，在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2]，将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。

在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高，由于脂质体的转染率较低和毒性较大，现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1，以提高转染率和降低毒性。

1材料与方法1.1质粒、菌株和细胞AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司；PBMC从人血分离；质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宫颈癌细胞）及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。

1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。

Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。

质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。

淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技XX公司。

1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如（图1）。

设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中，得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。

图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中，约24h后细胞密度达到60%～80%时，用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。

待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。

Skp2-siRNA 重组腺病毒载体构建及鉴定魏刚1,2,孙泽群2,孔霞3,黄永章3,王斌2,唐俊明3,徐少勇2*(1武汉大学第二临床学院,湖北武汉430072;湖北医药学院附属人民医院2消化内科;3临床医学研究所,湖北十堰442000)[摘要]目的:构建针对Skp2的s i R N A 腺病毒载体。

方法:合成针对Skp2的si RNA 靶D NA 序列及相应阴性对照序列,退火成DNA 双链,然后亚克隆穿梭质粒pShuttle -H 1,Pm e I 线性化后,与腺病毒骨架质粒p Adeasy -1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染AD293细胞,包装得到p Ad -Skp2-si R NA 和p Ad -Skp2-si RNA -NC 重组腺病毒。

用病毒体外感染结肠癌S W 480细胞,W estern b l ot 检测Skp2蛋白表达水平。

结果:重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能显著抑制Skp2蛋白表达。

结论:细菌内同源重组成功构建了Ad -Skp2-si RNA 重组腺病毒及阴性对照病毒。

[关键词]Skp2;s i R N A;腺病毒载体[中图法分类号]Q784[文献标识码]A[文章编号]1006-9674(2011)02-0109-04C onstruc ti on and Iden tifica t i on of R eco m b i na nt Adenoviru s Vector of si RNA T ar geti ng Skp2WE I Gang 1,2,S UN Ze -qun 2,KO NG X ia 3,HUA NG Yong -zhang 3,WAN G B i n 2,T ANG Jun -m i ng 3,XU Shao -yong 2*(1Second C linica l Col -lege ,Wuha n Universit y ,Wuha n ,H ubei 430072;2Depa rt m ent o f Ga stroen terolo gy ;3Institute of C li nica l M e d ici ne ,R en m in H os -pit a l ,Hubei Uni ver sit y o f M e d ici ne ,Shiyan ,H ubei 442000,China )Abstr ac t :Ob j e c ti ve To co nstruct an adenovirus vector express i ng s m a ll i nterfer i ng RNA(si R NA)targe ti ng to Skp2.M e t h -ods The si RNA conta i n i ng D NA sequence ta rgeti ng to Skp2and its nega ti ve control sequence were desig ned ,synthesized ,annea l ed and subclo ned i nto pShuttle -H 1conta i n i ng the green fl uorescen t protein .The li nearized shu ttl e p l as m i d by Pm e I was reco m bined with back -bo ne p AdEasy -1i n BJ5183bacteria .The reco mb i nan t p Ad -Skp2-s i R N A adenovirus partic l es were produced by transfecti on of AD293ce lls and subsequentl y i nfected colo n ic cancer S W 480ce ll s .The Skp2prote i n l ev -e ls were detected byW este rn b l ot .R e s u l ts The adenovirus vectors were ver ified by enzy m e d i gesti on and D NA sequenci ng ,the i n fecti on effic i ency of co nstructed adenovirus was hig h ,and cou l d o bvi ousl y inh i bit the expressi on of Skp2.C onc l us i on The reco mb i nant pAd -Skp2-si RNA and negati ve control bacteria lwere successfull y constructed by bacte rial ho mologo us re -co mb i nati on .K ey word s :Skp2;si R NA ;Adeno virus vector[基金项目]湖北省教育厅科研基金(200524001)。

CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开
题报告
一、研究背景和意义：
癌症是世界公认的重大疾病之一，在其中恶性黑色素瘤的死亡率也非常高。

通过疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症的方法已经成为重要的研究方向，包括恶性黑色素瘤。

而MAGE-A3和CRT是在恶性黑色素瘤中表达的抗原，且它们的表达在癌细胞和正常细胞中有明显的差异。

因而它们被认为是恶性黑色素瘤的潜在免疫治疗靶点。

二、研究内容和方案
本研究通过将MAGE-A3和CRT基因插入到腺病毒载体中，构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体，并在细胞水平表达融合蛋白。

具体步骤如下：
1. 通过RT-PCR方法从恶性黑色素瘤组织中提取MAGE-A3和CRT 基因。

2. 将MAGE-A3和CRT基因克隆到腺病毒载体中，形成CRT/MAGE-A3重组载体。

3. 利用PCR进行扩增，通过酶切和测序进行CRT/MAGE-A3重组载体的鉴定。

4. 将CRT/MAGE-A3重组载体转染到恶性黑色素瘤细胞株中，通过Western Blotting方法检测融合蛋白CRT/MAGE-A3的表达和纯度。

三、研究预期结果
1. 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体。

2. 观察到CRT/MAGE-A3的表达并在细胞中得到验证。

3. 为下一步开展体内实验打下坚实基础，为疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症奠定理论基础。

四、研究意义
本研究有望为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供新的方法和思路，也有望开展潜在的抗癌疫苗研究。

同时还有望在癌症免疫治疗的新技术方面提供一定的探索，为癌症的预防和治疗提供新的思路和方法。