重组腺病毒载体的构建

人白介素２４基因重组腺病毒载体的构建与鉴定【摘要】目的构建含有人白介素24（hIL-24）基因的重组腺病毒载体，为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究奠定实验基础。

方法采用基因工程技术将hIL-24基因的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,鉴定正确后在PAdEasy系统中进行细菌内同源重组，通过脂质体将正确重组体包裹并转染293A 细胞以包装并扩增病毒。

采用酶切及PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。

结果酶切和PCR结果证实hIL-24基因重组腺病毒载体构建成功并可在293A细胞中表达，病毒滴度达107pfu/ml。

结论成功构建了有较强感染能力的含hIL-24基因的重组腺病毒载体。

【Abstract】ObjectiveTo construct and identify the recombinant adenovirus vector of human IL-24 gene for future gene therapy of pathological scar tissue. MethodsThe human IL-24 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrack-CMV to form the transfer vector by the method of homogenous recombination in bacteria of PAdEasy system. Then the right recombinant adenovirus was transfected into 293A cells using Lipofectine 2000. The recombinant adenovirus vector was identified by restriction enzyme digestion and polymerase chain reaction (PCR). ResultsRestriction endonuclease and PCR analysis confirmed that the human IL-24 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was 107pfu/ml. ConclusionThe recombinant adenovirus vector of hIL-24 was successfully constructed with highly infection.【Key words】Human IL-24 gene; Adenovirus; Pathological scar人白介素24基因（hIL-24）是一种肿瘤抑制基因，通过多种途径抑制、诱导、细胞的生长，对肿瘤细胞有选择性杀伤作用而对正常组织几乎无毒副作用，并且具有调节免疫系统的功能，是当今人们研究的热点[1]。

重组腺病毒包装技术构建原理腺病毒包装系统采用第1代重组腺病毒包装系统制备腺病毒颗粒，该包装系统包含1个腺病毒载体和l株包装细胞株。

1)1个腺病毒载体：含有缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列的质粒。

2)l株包装细胞株：表达El基因的293细胞。

野生型腺病毒基因组是一条约36 kb的线性双链DNA (dsDNA)分子。

基因组的两个末端被称为Inverted Terminal Repeat (ITR)，末端之间含有腺病毒DNA复制所需基因。

在病毒DNA复制周期早期表达的基因，称为早期基因，主要有4个，按表达先后顺序依次是E1、E2、E3、E4。

在病毒DNA复制周期晚期表达的基因，称为晚期基因，主要有5个，按表达先后顺序依次为Ll、L2、L3、L4、L5。

为了制备出自我失活的重组腺病毒，E1基因会被删除，使重组腺病毒成为一种安全的基因运输工具。

为了增加包装能力，E3基因也同时被删除，因为E3基因产物会提高宿主的免疫反应，而且对病毒生产不重要。

缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上构建成腺病毒载体。

El基因片段被整合到293细胞基因组中，包装病毒颗粒时，Pacl消化的腺病毒载体转梁到表达E1基因的293细胞。

El基因激活了其他早期基因和晚期基因的表达，这些基因表达产物和Pacl消化的质粒DNA 组装成病毒颗粒。

腺病毒生产生产携带目的基因的重组腺病毒颗粒，过程如下图：将环形腺病毒载体通过Pacl位点酶切后获得两末端是ITR序列的线性双链DNA，再转染线性化DNA到包装细胞。

线性化双链DNA分饰两个角色，既是病毒基因组，又是病毒蛋白表达所参照的基因模板序列。

基因组与病毒蛋白组装成病毒颗粒，病毒颗粒在细胞内成熟后，使得细胞破裂，从而使病毒颗粒释放到培养液中。

然后收集细胞和培养液，反复冻融细胞和培养液的混合物，离心收集上清，获得粗病毒。

此时的粗病毒量通常不会很高，一般会将粗病毒感染更多的包装细胞，以扩增病毒量。

FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64构建的实验研究徐瑞剑王志强包头市九原区医院胸外科内蒙古包头 014060内蒙古自治区自然科学基金项目项目编号2009MS1148通讯作者：王志强Xu ruijian Wang zhiqiangDepartment of Thoracic Surgery, Jiuyuan District Hospital of Baotou, Baotou Inner Mongolia 014060实验目的：构建纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组人腺病毒载体（Ad.FnCBD64）。

实验方法：1.FnCBD64重组腺病毒粘粒载体的构建。

2.293细胞和Hela细胞的培养。

3.磷酸钙转染。

4. 筛选和扩增FnCBD64基因重组腺病毒。

5．设计公共PCR引物。

6. 鉴定Ad. FnCBD64重组腺病毒。

7. 浓缩纯化重组腺病毒。

8. 测定病毒滴度（50％组织培养感染量TCID50）。

9.体外安全性研究。

结果：成功构建了纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64。

结论：本实验成功地构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒，为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞的黏附力提供了转染载体，使应用骨髓间质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能。

运用基因转染的技术加强及改造种子细胞的功能是组织工程研究中的热点问题之一。

通过这一手段的应用，不仅能获得具备旺盛生理功能的种子细胞，而且还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白，有利于组织构建。

腺病毒载体是组织工程基因改造的常用的病毒性载体，同其他的载体体系对比，腺病毒载体是最具有潜力的载体之一，具有高效感染分裂细胞及非分裂细胞能力，制备容易、纯化和储存方便，并且滴度高、容量大[1]。

能插入大片段的目的基因，携带的外源基因不会整合在宿主染色体中，在靶细胞内以附加体形式存在，插入突变的危险极低，具有较低的遗传毒性。

TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR)，在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2]，将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。

在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高，由于脂质体的转染率较低和毒性较大，现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1，以提高转染率和降低毒性。

1材料与方法1.1质粒、菌株和细胞AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司；PBMC从人血分离；质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宫颈癌细胞）及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。

1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。

Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。

质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。

淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技XX公司。

1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如（图1）。

设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中，得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。

图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中，约24h后细胞密度达到60%～80%时，用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。

待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。

Skp2-siRNA 重组腺病毒载体构建及鉴定魏刚1,2,孙泽群2,孔霞3,黄永章3,王斌2,唐俊明3,徐少勇2*(1武汉大学第二临床学院,湖北武汉430072;湖北医药学院附属人民医院2消化内科;3临床医学研究所,湖北十堰442000)[摘要]目的:构建针对Skp2的s i R N A 腺病毒载体。

方法:合成针对Skp2的si RNA 靶D NA 序列及相应阴性对照序列,退火成DNA 双链,然后亚克隆穿梭质粒pShuttle -H 1,Pm e I 线性化后,与腺病毒骨架质粒p Adeasy -1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染AD293细胞,包装得到p Ad -Skp2-si R NA 和p Ad -Skp2-si RNA -NC 重组腺病毒。

用病毒体外感染结肠癌S W 480细胞,W estern b l ot 检测Skp2蛋白表达水平。

结果:重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能显著抑制Skp2蛋白表达。

结论:细菌内同源重组成功构建了Ad -Skp2-si RNA 重组腺病毒及阴性对照病毒。

[关键词]Skp2;s i R N A;腺病毒载体[中图法分类号]Q784[文献标识码]A[文章编号]1006-9674(2011)02-0109-04C onstruc ti on and Iden tifica t i on of R eco m b i na nt Adenoviru s Vector of si RNA T ar geti ng Skp2WE I Gang 1,2,S UN Ze -qun 2,KO NG X ia 3,HUA NG Yong -zhang 3,WAN G B i n 2,T ANG Jun -m i ng 3,XU Shao -yong 2*(1Second C linica l Col -lege ,Wuha n Universit y ,Wuha n ,H ubei 430072;2Depa rt m ent o f Ga stroen terolo gy ;3Institute of C li nica l M e d ici ne ,R en m in H os -pit a l ,Hubei Uni ver sit y o f M e d ici ne ,Shiyan ,H ubei 442000,China )Abstr ac t :Ob j e c ti ve To co nstruct an adenovirus vector express i ng s m a ll i nterfer i ng RNA(si R NA)targe ti ng to Skp2.M e t h -ods The si RNA conta i n i ng D NA sequence ta rgeti ng to Skp2and its nega ti ve control sequence were desig ned ,synthesized ,annea l ed and subclo ned i nto pShuttle -H 1conta i n i ng the green fl uorescen t protein .The li nearized shu ttl e p l as m i d by Pm e I was reco m bined with back -bo ne p AdEasy -1i n BJ5183bacteria .The reco mb i nan t p Ad -Skp2-s i R N A adenovirus partic l es were produced by transfecti on of AD293ce lls and subsequentl y i nfected colo n ic cancer S W 480ce ll s .The Skp2prote i n l ev -e ls were detected byW este rn b l ot .R e s u l ts The adenovirus vectors were ver ified by enzy m e d i gesti on and D NA sequenci ng ,the i n fecti on effic i ency of co nstructed adenovirus was hig h ,and cou l d o bvi ousl y inh i bit the expressi on of Skp2.C onc l us i on The reco mb i nant pAd -Skp2-si RNA and negati ve control bacteria lwere successfull y constructed by bacte rial ho mologo us re -co mb i nati on .K ey word s :Skp2;si R NA ;Adeno virus vector[基金项目]湖北省教育厅科研基金(200524001)。

CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开
题报告
一、研究背景和意义：
癌症是世界公认的重大疾病之一，在其中恶性黑色素瘤的死亡率也非常高。

通过疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症的方法已经成为重要的研究方向，包括恶性黑色素瘤。

而MAGE-A3和CRT是在恶性黑色素瘤中表达的抗原，且它们的表达在癌细胞和正常细胞中有明显的差异。

因而它们被认为是恶性黑色素瘤的潜在免疫治疗靶点。

二、研究内容和方案
本研究通过将MAGE-A3和CRT基因插入到腺病毒载体中，构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体，并在细胞水平表达融合蛋白。

具体步骤如下：
1. 通过RT-PCR方法从恶性黑色素瘤组织中提取MAGE-A3和CRT 基因。

2. 将MAGE-A3和CRT基因克隆到腺病毒载体中，形成CRT/MAGE-A3重组载体。

3. 利用PCR进行扩增，通过酶切和测序进行CRT/MAGE-A3重组载体的鉴定。

4. 将CRT/MAGE-A3重组载体转染到恶性黑色素瘤细胞株中，通过Western Blotting方法检测融合蛋白CRT/MAGE-A3的表达和纯度。

三、研究预期结果
1. 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体。

2. 观察到CRT/MAGE-A3的表达并在细胞中得到验证。

3. 为下一步开展体内实验打下坚实基础，为疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症奠定理论基础。

四、研究意义
本研究有望为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供新的方法和思路，也有望开展潜在的抗癌疫苗研究。

同时还有望在癌症免疫治疗的新技术方面提供一定的探索，为癌症的预防和治疗提供新的思路和方法。

人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定作者：蔡军，林国生，江洪，王腾，曾彬，罗浩，郭军，李俊，汪蕾【关键词】腺病毒科Construction and identification of human HCN4 gene recombinant adenovirus【Abstract】AIM: To construct the recombinant adenovirus of human HCN4 gene. METHODS: HCN4 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV to form the transfer vector by the methods of homogeneous recombination in bacteria and the recombinant adenovirus was then transfected into 293 cells using Lipofectamine 2000. The target gene was detected by polymerase chain reaction (PCR) and the titer and its infection rate were determined using the green fluorescent protein (GFP) expression in the shuttle plasmid. RESULTS: Restriction enzyme digestion analysis and the sequence analysis confirmed that the HCN4 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was ×1015 pfu/L. GFP was observed in thetransfected 293 cells under a fluorescent microscope. CONCLUSION: The recombinant adenovirus containing human HCN4 gene is successfully constructed by the method of homogeneous recombination in bacteria.【Keywords】 HCN gene; adenoviridae; recombination, genetic【摘要】目的：构建超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN4）重组腺病毒载体. 方法：采用基因工程技术，将HCN4 cDNA 定向克隆至穿梭载体pAdTrackCMV中，利用pAdeasy1系统进行细菌内同源重组后，脂质体转染293T细胞包装、扩增，CsC1密度梯度超速离心纯化. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定，利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因，对病毒滴度和感染效率进行监测. 结果：测序结果证明成功构建了HCN4基因重组腺病毒载体，病毒滴度达×1015pfu/L. 结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含人HCN4基因的重组腺病毒载体.【关键词】 HCN基因；腺病毒科；重组，遗传0引言起搏电流（If）在窦房结生理性起搏机制中担当重要角色，同时也是自主神经调节心脏节律的主要靶点，其编码基因为超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN）［1-4］. HCN超家族包括HCN1～HCN4型，其中HCN4占窦房结HCN总mRNA的80%［5］. 最近研究发现，在家族性或遗传性窦房结功能障碍家系中存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］. 为了进一步深入研究HCN4的通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，积极开展窦房结功能障碍的基因治疗，我们构建了表达HCN4的重组腺病毒载体.1材料和方法1．1材料腺病毒细菌内同源重组系统包括Bj5183、穿梭质粒pAdTrackCMV及腺病毒骨架质粒pAdeasy1（美国Johns Hopkins大学Dr. He TC惠赠）；293细胞系（武汉大学细胞典藏中心）；各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase A（TaKaRa公司）；转染试剂Lipofectamine 2000（Gibco BRL）；PCR产物回收纯化试剂盒（Promega公司）；质粒提取试剂盒（Hispeed Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司）；氯化铯（Sigma公司）. 其余各种试剂均为进口或国产分析纯试剂.1．2方法1．2．1穿梭载体pAdTrackCMV HCN4的构建和鉴定1．2．1．1pAdTrackCMVHCN4的构建质粒用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后回收 kb的HCN片段. 穿梭质粒pTrackCMV用HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切后回收载体骨架，T4 DNA连接酶连接载体骨架与目的基因片段得到重组质粒pTrackCMVHCN4. 转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，质粒提取试剂盒提取质粒.1．2．1．2pAdTrackCMVHCN4的酶切鉴定取 mL离心管，依次加入酶切缓冲液2 μL，内切酶HindⅢμL，内切酶XbaⅠμL, 重组质粒μL，去离子水μL，充分混匀，37℃水浴2 h，酶切后10 g/L琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带.1．2．2细菌内同源重组产生腺病毒质粒用100 mL/L的冰冷的无菌甘油制备 BJ 5183及 DH5α电穿孔感受态菌，将穿梭质粒pAdTrackCMVHCN4用PmeⅠ线性化，纯化回收酶切产物. 分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy1等浓度比混合，在2500 V, 200 Ω, 25 μF 条件下，电转化BJ5183感受态菌，卡那霉素（50 mg/L）固体LB培养基筛选，16 h后挑取10个克隆，提取质粒. PacⅠ酶切鉴定阳性克隆得到重组腺病毒质粒pAdHCN4. 重组腺病毒质粒pAdHCN4的序列测定：以质粒提取试剂盒提取的高纯度质粒为模板，双脱氧核苷酸终止法测序，以SP6Promter Primer为测序引物，采用ABI PRISM B DyeTM测序试剂盒在ABI PRISMTM377XL DNA sequncer序列分析仪上对插入片段进行序列测定.1．2．3293细胞中包装产生重组腺病毒利用HEK293细胞可稳定表达复制缺陷病毒Ad5 E1基因的特性，将重组病毒质粒包装成有完整功能的重组病毒颗粒. 转染前24 h于每个T25 cm2培养瓶中接种1×106细胞，转染时细胞密度为50%～70%. 转染当日，将4 μg pAdHCN4质粒用PacⅠ酶切线性化，用20 μL Lipofectamine 2000按说明转染293细胞，2 d后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，2 wk后收集细胞. -70℃/37℃/Vortex反复冻融4次，取1/5病毒提取上清再感染293细胞扩增，3~4 d后收集细胞，PBS重悬，反复冻融，离心收集病毒上清，保存于-80℃.1．2．4重组腺病毒大规模扩增及CsC1密度梯度超速离心纯化按照上述方法连续扩增病毒5~6轮，最后共感染了大约3×108个293细胞，3~4 d后收集病毒上清，制备CsC1低密度母液（1200 g/L）和高密度母液（1460 g/L）. 将高、低密度母液以及病毒上清加至超速离心管中，以10 000 g于4℃离心3~4 h，侧向穿刺小心吸出病毒条带，加入透析袋中透析12 h，其间更换透析缓冲液（10 mmol/L TrisHC1 pH , 1 mmol/L MgC12, 10 mL/L甘油）3次，透析完全后，用2×病毒储存液（19 mmol/L TrisHC1 pH , 100 mmol/L NaC1, 1 mL/L BSA, 50 mL/L甘油）按1∶1稀释病毒，μm滤膜过滤，分装后放-80℃保存，得到纯化好的病毒AdHCN4.1．2．5病毒滴度测定先用A值初步估算：取15 μL纯化好的病毒用 mL H2O稀释15 μL高密度CsC1母液作为空白对照，测A260 nm值，按1012/VP/A260 nm进行换算. 再以GFP法进行测定：将病毒储存液作不同比例的稀释，取500 μL稀释液加至T25 cm2培养瓶培养的293细胞中，于37℃吸附30 min换新鲜培养基继续培养36 h，在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数，按病毒滴度（pfu/mL）=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/ mL计算.1．2．6重组腺病毒的鉴定目的基因的PCR鉴定，根据HCN4 cDNA的碱基序列，设计了HCN4的寡聚核苷酸引物：正向引物： 5′GGCATGTCCGACGTCTGGCTCA3′；反向引物：5′TCACGAAGTTGGGGTCCGCATT GG3′. 提取病毒基因组DNA： 2 mL PBS 收集2种病毒感染后发生病变的293细胞，冻融4次，于4℃ 600 g 离心10 min取上清，加入200 μL蛋白酶K （5 g/L），并加入2 mL SET裂解液（10 mL/L SDS, 10 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris HCl pH ），56℃消化2 h, 3000 g离心10 min取上清，等体积的酚/氯仿抽提一次，无水乙醇沉淀，20 μL TE溶解，以上述病毒基因组DNA为模板，进行PCR: 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸90 s，共35个循环，最后于72℃延伸10 min，产物用10 g/L琼脂糖电泳进行鉴定. 2结果2．1穿梭载体pAdTrackCMVHCN4的鉴定重组质粒被切成的片段与理论预期一致，表明HCN4 cDNA序列已成功插入pAdTrackCMV 载体中，且连接正确（Fig 1）.2．2重组腺病毒质粒pAdHCN4的序列测定用一条PCR鉴定引物进行测序，测定序列结果与GenBank报道的序列完全一致（Fig 2）.2．3重组腺病毒在293细胞中包装、扩增及纯化将腺病毒质粒pAdHCN4用PacⅠ酶切线性化后转染293细胞，2~3 d后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白的表达，说明有感染力的病毒颗粒包装成功（Fig 3）. 将大规模扩增所得到的病毒液经过CsC1密度梯度超速离心的方法进行纯化，并经过透析得到可以直接用于在体实验的重组腺病毒AdHCN4.2．4病毒滴度的测定应用A值和GFP法测得AdHCN4最终的滴度为×1015pfu/L.2．5重组腺病毒AdHCN4中HCN4基因的PCR鉴定提取AdHCN4病毒基因组DNA，以HCN4基因的引物进行PCR鉴定，结果AdHCN4可见353 bp的阳性扩增条带，而AdGFP没有条带（Fig 4）.3讨论心律失常是影响人们健康威胁人们生命的疾病. 心律失常遗传基因的发现以及突变监测的进展促进了心律失常基因治疗的研究. 最近的研究结果都提示HCN4基因是具有很大潜力的基因治疗的靶基因：①在遗传性窦房结功能障碍患者存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］；②在HCN4基因敲除的鼠胚胎心脏记录不到具有4期自动除极特征的起搏细胞动作电位，胚胎不能发育成熟［8］；③胚胎心室肌细胞在早期阶段（）具有自发除极能力，晚期（）则丧失起搏能力，其机制在于HCN4表达持续性下调及If进行性减少［9］. 因此，HCN4转染的心肌细胞将过度表达If从而具备4期自动除极能力，这将可能构建建立在基因工程基础上的生物起搏器. 我们成功的构建了重组腺病毒载体AdHCN4，可以通过腺病毒载体将HCN4导入体外培养的细胞深入研究HCN4通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，也可以心肌内注射开展窦房结功能障碍的基因治疗，为今后的临床应用奠定坚实的基础.由于腺病毒载体的病毒滴度高、容量大、转导效率高、感染范围广以及稳定性好，因此被广泛应用于各种基因治疗中. He等［10］首次介绍细菌内同源重组法，此方法简便快捷，实验周期短，极大地方便了构建重组腺病毒. 目前美国Johns Hopkins Oncology Center 制备了含腺病毒核心基因组pAdEasy1的BJ5183细菌，即AdEasy1（亦称作BJAEasy或AdEasier细菌），与pAdTrack或pAdTrackCMV等穿梭质粒共同组成一个高效重组腺病毒构建系统，只需将含目的基因的穿梭质粒线性化后转化AdEasy1获得重组腺病毒质粒，再经293细胞包装、扩增便可获得所需重组腺病毒，因此选用该系统进行目的基因的修饰在时效上有很大优势.我们希望能够以腺病毒载体为介导，进一步研究HCN4基因在生理性起搏中的功能角色及其分子机制，探索HCN4基因作为基因治疗靶基因的价值，为窦房结功能障碍和重度房室传导阻滞的基因治疗提供候选基因，并为临床前研究提供实验依据. 我们在前一阶段的研究中曾通过窦房结细胞移植来修复或重建心脏优势起搏点以完全或部分代替窦房结功能［11，12］. 但由于人的胚胎心肌细胞移植受到伦理学争议，限制了其在临床上的应用. 由于建立在基因工程基础上的“生物起搏器”可以进行大规模生产，有望成为比电子起搏器更便宜、更安全、更灵敏、创伤更小、更适宜于儿童治疗的新选择，具有广阔的临床应用前景和巨大的社会经济效益.【参考文献】［1］ DiFrancesco D, Ferroni A, Mazzanti M, et al. Properties of the hyperpolarizingactivated current in cells isolated from the rabbit sinoatrial node ［J］. J Physiol, 1986;377(5):61-67.［2］ Moonsmang S, Stieber J, Zong X, et al. Cellular expression and function characterization of four hyperpolarizationactivated pacemaker channels in cardiac and neuronal tissues ［J］. Eur J Biochem, 2001; 268(3):1646-1650.［3］李翠兰，胡大一. 细胞兴奋：从起搏电流到超极化激活的环核苷酸门控通道［J］. 中国心脏起搏与心电生理杂志，2003; 17（4）：244-248.Li CL, Hu DY. Cell exciting: from If to hyperpolarizing activated channel ［J］. Chin J Card Electrophysiol, 2003;17（4）:244-248.［4］蔡军，林国生，江洪. 窦房结起搏细胞膜离子流与4期自动除极［J］. 中国心脏起搏与心电生理杂志，2004；18（4）：302-304.Cai J, Lin GS, Jiang H. Membrane current of sinus node cell and phase 4 automatical depolarzation ［J］. Chin J Card Electrophysiol, 2004；18（4）：302-304.［5］ Shi W, Wymore R, Yu H, et al. Distribution and prevalence of HCN mRNA expression in cardial tissue ［J］. Circ Res, 1999; 85: E1-E6.［6］SchulzeBahr E, Neu A, Friederich P, et al. Pacemaker channel dysfunction in patient with sinus node disease ［J］. J Clin Invest, 2003; 111: 1537-1545.［7］ Ueda K, Nakeharu K, Hayashi T, et al. Functional characterization of a traffickingdefective HCN4 mutation, D553N, associated with cardiac arrythmia ［J］. J Biol Chem, 2004; 279: 27184-27194.［8］ Stieber J, Herrmann S, Feil S, et al. The HCN4 is required for the generation of pacemaker action potentials in the embryonic heart ［J］. PNAS, 2004;100:.［9］ Yasui K, Liu W, Kada K, et al. If current andspontaneous activity in embryonic ventricular myocytes ［J］. Circ Res, 2001;88:536-542.［10］ He TC, Zhou S, Cost LT, et al. A simplified systerm for generating recombinant adenovirus ［J］. PNAS, 1998; 95: 2509-2514.［11］ Cai J, Lin GS, Jiang H, et al. Transplanted neonatal cardiomyocytes as a potential biological pacemaker in pigs with complete atrioventricular block ［J］. Transplantation, 2005;106:346-352.［12］ Lin GS, Cai J, Jiang H, et al. Biological pacemaker created by fetal cardiomyocytes transplantation ［J］. J Biomed Sci, 2005;17:402-408.。

重组腺相关病毒（AAV）载体构建技术原理腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微⼩病毒科（parvoviridae）家族的成员之⼀，是⼀类⽆法⾃主复制、⽆被膜的⼆⼗⾯体微⼩病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。

研究中采⽤的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在⾮致病的野⽣型AAV基础上改造⽽成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性⾼、宿主细胞范围⼴（对分裂细胞和⾮分裂细胞均具有感染能⼒）、扩散能⼒强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之⼀。

AAV基因组结构悬浮框：包装纯化及滴度检测--侵染细胞过程-- rAAV载体优势—rAAV⾎清型选择—应⽤案例rAAV包装纯化及滴度检测AAV包装过程中，包装质粒负责编码⽬的基因以及两个末端反向重复序列（ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作⽤），辅助质粒包含AAV包装所需的cap（编码病毒⾐壳蛋⽩）和rep（参与病毒的复制）基因，以及腺病毒Helper质粒。

三种质粒共同转染293T细胞后，AAV病毒开始复制和包装。

和元⽣物腺相关病毒的⽣产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采⽤三质粒系统在293T细胞中进⾏包装。

所获得的病毒颗粒经过超速离⼼纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进⾏滴定。

另外，我们也可以根据使⽤者要求，提供蛋⽩染⾊检测⾐壳蛋⽩的完整性以及内毒素含量等。

⼀般情况下rAAV的滴度在1012~1013VG/ml，完全可以满⾜各类整体实验的使⽤要求。

AAV包装流程图滴度检测⽅法：定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。

滴度检测原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA，外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。