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猪SCD1和SCD5双基因敲除细胞系的构建及其对脂肪沉积的影响方钱海;郭帅;任红艳;白文哲;高斯;刘雯雯;陈洪波;张立苹【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2024(32)4【摘要】脂肪沉积及脂肪酸组成对猪肉品质具有决定性影响,硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)对脂肪酸组成及代谢具有重要的调控作用。
目前SCD1和SCD5是包括人类(Homo sapiens)在内的多种脊椎动物中仅有的两种SCD亚型,为明确SCD1和SCD5对猪(Sus scrofa)脂肪酸种类与组成的影响及其作用机制,本研究利用单single guide RNA(sgRNA)和双sgRNA相结合介导的CRISPR/Cas9技术对SCD1及SCD5基因进行定点敲除,筛选获得纯合缺失单克隆细胞系,对其进行脂肪酸含量的检测分析,并检测双基因缺失对脂肪沉积和脂质代谢的影响。
结果显示,SCD1及SCD5双基因编辑效率超过70%;SCD1及SCD5双基因缺失降低了其介导的限速反应产物棕榈油酸(C16∶1)和油酸(C18∶1)的相对含量;同时,细胞中多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的含量显著提高。
SCD1和SCD5的缺失还影响了芥酸(C22∶1n9)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,DPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)、二十碳五稀酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和亚油酸(C18∶2n6)等脂肪酸的含量;SCD1和SCD5整体缺失后甘油三酯的含量显著降低,影响了脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、酰基辅酶A合成酶3(acyl-CoA synthetase long-chain family member 3,ACSL3)等与脂肪酸和脂质代谢相关蛋白的表达。
EPO使用中的常见问题中国医学科学院北京协和医院李学旺上世纪在CRF治疗中的里程碑性的事件为维持性血液透析、同种异体肾脏移植和EPO的临床应用。
EPO的临床应用改善了CRF患者的贫血状况、提高了患者的生活质量、改善了患者的心血管疾病的患病率和死亡率、延长了患者的存活时间。
然而，EPO使用中有许多问题尚未解决，诸如何时开始使用EPO，EPO 的剂量、EPO治疗的最适靶目标值、铁剂的使用，EPO使用对肾功能的影响、EPO的低反应性与EPO抵抗等。
关于早期使用EPO问题贫血是CRF的主要合并症，当CKD患者Cr>2mg/dl或GFR<60ml/min时就会发生贫血,随着GFR的继续下降,贫血的发生率和严重程度也会增加。
贫血会导致左心室向心性肥厚以及左心室扩张、左心室舒张末期容量指数（LVEDD）的增加。
文献报告Hb每下降1g/dl则会使LVEDD增加8ml/m2。
贫血纠正后对已肥厚或扩张的左心室的治疗作用各家报告不一。
一般认为早期治疗可部分使肥厚的左心室退缩，Radermacher等报告18例ESRD患者在纠正贫血后LVH退缩18%；同一中心的报告也证实11例有明确的LVH在纠正贫血后出现非依赖于血压控制的LVH逆转。
而对于扩张的左心室治疗效果却不明显。
因此EPO的使用应在贫血没有造成器质性器官损害之前就开始。
遗憾的是这样的机会在临床上往往扑捉不到。
美国的研究显示只有不到40%的CKD患者在进入ESRD之前使用了EPO，有60%的HD患者Hb低于11g//dl。
而使用EPO之前Hb小于11.4g/dl 时,45%的患者已出现了LVH。
为此在出现LVH之前就使用EPO的目的很难达到。
一般认为，当Hb<10-11g/dl就应使用EPO治疗。
EPO与肾功能恶化许多学者研究了EPO使用后肾功能的改变。
早期的动物实验研究认为EPO 使用后肾功能变坏，但是此研究中实验动物的血压没有得到控制，为此，肾功能的恶化实际上是由于高血压所致。
基因敲除ACE2细胞系ACE2血管紧张素转换酶2（一种血管紧张素转换酶（二肽羧肽酶家族的ACE 样核酸外切酶）主要在心脏，肾脏和睾丸的血管内皮细胞中表达。
羧肽酶血管紧张素转换酶2（ACE2）将八肽血管紧张素（Ang）-II水解为七肽Ang-（1-7），对血糖具有重要的保护作用。
ACE2基因敲除小鼠对葡萄糖的反应是耐量降低和胰岛素分泌受损。
相反，为胰腺提供ACE2基因治疗可以改善db / db小鼠血糖和原代细胞功能，这是肥胖症诱发的糖尿病常见的遗传模型。
TALEN的RNA转染产生了远距离的Ace2基因敲除小鼠，表明结肠炎让人联想到病理生理学和炎症血管紧张素I转换酶2（ACE2）是维持肠道稳态的关键因素。
体内稳态障碍会导致结肠发炎（结肠炎），从而导致危及生命的虚弱甚至癌症。
动物模型是解读此类人类疾病背后的病理学和筛选假设的治疗靶点或范例的有价值的替代方法。
但是，疾病模型的开发可能很耗时并且需要技术，这可能会影响其应用价值。
在这项研究中，我们直接将体外转录的编码转录激活子样效应子核酸酶（TALENs）的mRNA注入远交昆明小鼠受精卵的细胞质中，从而遗传破坏了小鼠Ace2基因。
因此，诱导体细胞突变的效率为57％，其中39％为移码突变。
而且，所有修饰在种系传递过程中均稳定转移。
在Ace2基因敲除技术，系雄性小鼠（Ace2- / y）中，研究人员观察到严重的化学诱导性结肠炎，其特征在于体重减轻，腹泻和结肠长度缩短。
从组织学上讲，Ace2突变会引起白细胞浸润并严重破坏肠粘膜屏障。
此外，研究人员发现，Ace2- / y小鼠结肠组织中炎性细胞因子的表达增加。
总体而言，数据显示通过合体注射TALEN mRNA，可以在杂种小鼠模型中实现高靶向效率和遗传性。
另外，所得的Ace2-// y小鼠表现出让人联想到结肠炎的表型特征，并且研究人员期望这种小鼠在肠道微生物组或粪便移植的研究中可能具有价值。
ACE2/血管紧张素（1-7）/ Ma轴在骨肉瘤细胞U-2 OS和MNNG-HOS中的表达和功能肾素-血管紧张素系统（RAS）通过其经典的血管紧张素转换酶（ACE）/血管紧张素II /1型受体（AT1R）轴转移与各种实体瘤的增殖作用。
血管紧张素转化酶2研究进展张瑜娟;杨维维;荣超;张源淑【摘要】血管紧张素转化酶2(ACE2)是2000年发现的肾素-血管紧张素系统(RAS)的新成员.作为RAS系统的关键酶,ACE2与ACE的作用相反,它主要是通过降解血管紧张素Ⅱ生成7肽的血管紧张素Ang(1-7)而发挥机体保护功能.研究发现,ACE2不仅可以起到保护心脏、肾脏、肝脏、肠道等器官的作用,而且广泛参与肌肉、脂肪等组织的生理病理过程.此外,还与氨基酸、葡萄糖等物质的代谢过程密切相关.论文就ACE2多样性的生物功能做一综述.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2016(037)001【总页数】5页(P72-76)【关键词】血管紧张素转化酶2;肾素-血管紧张素系统;抗损伤【作者】张瑜娟;杨维维;荣超;张源淑【作者单位】南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室,江苏南京210095;南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室,江苏南京210095;南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室,江苏南京210095;南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室,江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】Q55血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是2000年发现的与ACE具有较高同源性的多效单羧肽酶。
其主要功能是直接水解血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)生成血管紧张素1-7[angiotensin (1-7)，Ang(1-7]。
Ang(1-7)通过与Mas 受体结合而发挥拮抗Ang Ⅱ、扩张血管、抗纤维化、抗增殖、抑制炎症、抗凋亡、调节水电解质平衡等生物学效应[1]。
因此，ACE2的发现打破了肾素-血管紧张素系统( renin-angiotensin system，RAS)代谢通路中ACE-Ang Ⅱ-AT1轴起主要生物效应的传统观点。
即在RAS代谢通路中，ACE2-Ang(1-7)-Mas轴与ACE-Ang Ⅱ-AT1轴起着对抗平衡作用。
血管紧张素转换酶2与心血管疾病杨俊平;方五旺【摘要】肾素-血管紧张素系统(RAS)是与心血管系统疾病密切相关的一个重要环节.RAS调整着心脏、血管和肾脏的生理功能的平衡,对机体血压、血流以及内环境的调节具有重要意义.作为RAS系统中又一关键调节因子的血管紧张素转换酶2(ACE2)近年来备受关注,ACE2与心血管系统相关疾病的研究也有了突破性的进展,为心血管疾病的治疗提供了新的途径;现将缺血性心肌病、原发性高血压、心率失常等疾病与ACE2基因表达的相关内容作一综述.%Renin-angiotensin system (RAS)is involved in the disease of cardiovascular system , which plays a very important effect on blood pressure,blood flow,and the environment within the body ,and has an important balance regulation role of physiological function in heart,blood vessels and kidneys. In recentyears ,angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) as another key regulatory factors in the RAS system has made great progress with the related diseases of the cardiovascular system ,which also provides a new approach for the treatment of cardiovascular disease. This review summarizes gene expression of ACE 2 and its relationship with ischemic cardiomyopathy , hypertension and cardiac arrhythmias.【期刊名称】《安徽医药》【年(卷),期】2013(017)005【总页数】3页(P861-863)【关键词】血管紧张素转换酶2;基因学;缺血性心肌病;原发性高血压;心率失常【作者】杨俊平;方五旺【作者单位】安徽省芜湖市第二人民医院心内科,安徽,芜湖,241000【正文语种】中文肾素—血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)是人体重要的循环调节系统，通过对心脏，血管和肾脏的调节以维持机体生理功能的平衡。
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程通常包括以下步骤：
1. 确定目标基因：选择需要敲除的目标基因。
2. 基因敲除设计：设计合适的靶向序列，该序列将在基因敲除过程中与目标基因发生特异性的DNA双链断裂。
3. CRISPR-Cas9系统构建：构建CRISPR-Cas9系统，其中包
括Cas9核酸酶和相应的靶向RNA（sgRNA）。
4. 细胞系培养：培养适合的细胞系，如细胞株或原代细胞。
5. 转染：将CRISPR-Cas9系统转染到细胞中，可以使用化学
转染、电转染或病毒载体转染等方法。
6. 筛选敲除细胞：在转染后的细胞中，通过添加选择性抗生素或使用基因标记物等方法，筛选出含有目标基因敲除的细胞。
7. 制备克隆：将筛选出的细胞进行单细胞克隆，并培养扩增。
8. 确定敲除效果：通过PCR、Western blot、流式细胞术或其
他适合的实验方法检测敲除细胞的基因表达水平和蛋白质表达。
9. 验证敲除细胞的功能：通过细胞功能实验，如细胞增殖、凋亡、迁移等实验，验证目标基因敲除对细胞功能的影响。
注意：以上流程是一般化的基因敲除细胞系构建流程，具体步
骤和条件可能因实验目的、细胞类型、基因敲除方法等而有所不同。
细胞基因敲除｜基因敲除细胞系服务本实验室为上海⾼校专业科研室，现提供基因敲除细胞系服务，提供医学实验技术，整体实验外包⼀站式服务。
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effectornucleases)的靶向基因敲除技术，这种崭新的分⼦⽣物学⼯具现已应⽤于细胞、酵母、斑马鱼与⼤⿏等各类研究对象。
构建以筛选基因新霉素（Neo）取代剔除基因的⼀个或多个外显⼦的质粒，转⼊ES细胞，获得正确发⽣同源重组的ES克隆。
ES细胞进⾏囊胚注射，获得部分ES来源的嵌合⿏，嵌合⿏与野⽣型⼩⿏交配，最终获得来源于重组ES细胞的杂合⼦⼩⿏。
杂合⼦⼩⿏⼀条染⾊体上的靶基因exon被Neo基因所取代，杂合⼦交配获得⽬的基因失活的纯合⼦⼩⿏。
TALEN靶向敲除技术TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases）靶向基因敲除技术是⼀种崭新的分⼦⽣物学⼯具。
研究发现，植物细菌Xanthomonas sp.的TAL蛋⽩的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。
利⽤TAL的序列模块，可组装识别任意DNA序列的模块化蛋⽩和重组核酸酶，在特定位点打断⽬的基因DNA序列，进⽽在该位点进⾏DNA操作，如Knock-out、Knock-in或点突变。
该技术克服了ZFN⽅法不能识别任意⽬标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，从⽽使基因敲除变得更加简单⽅便。
⽬前已成功的应⽤到细胞、酵母、植物、斑马鱼、⼩⿏、⼤⿏等模式⽣物中，⼤⼤缩减项⽬的研究周期。
⼆、技术特点1、⽆基因序列、细胞、物种限制，⼏乎可敲除任意基因。
2、实验设计简单准确、实验周期短、成本低。
3、毒性低、脱靶情况少；成功率⼏乎可达100%。
4、TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。
5、可识别任意⽬标基因序列，且不受上下游序列影响，与ZFN有同等或更好的活性。
血管紧张素转化酶2种新的肾素血管紧张素系统的重要调节剂肾素血管紧张素系统是一复杂的调节系统，在维持血压稳定，水盐平衡中起重要作用。
血管紧张素转化酶（ACE）是肾素2血管紧张素系统的一重要调节酶。
最近，人ACE的同类物2血管紧张素转化酶2 （ACE2）的发现，因其对肾素2血管紧张素系统的作用，成为心血管研究的一个方向。
其特异的功能及作用底物特点显示ACE2对激活的肾素2血管紧张素系统起负调控作用。
本文就ACE2的结构、功能、与心血管、肾脏系统的关系进行综述。
1．血管紧张素转化酶2的结构和功能ACE2是第一个被认识的ACE 同源物，于2000年，首先从人心力衰竭互补脱氧核糖核酸（cDNA）文库和人淋巴瘤cDNA文库中克隆出来。
ACE2与ACE有相当多的相似性，它也是Ⅰ型结构的锌依赖性膜金属蛋白酶，分子量为120kD（≈ 1.2 ×105u），与ACE在N末端催化区有42%同源性。
ACE2 基因组序列分析显示其基因含有18个外显子，定位于X染色体的XP22 位点，ACE2含有805 个氨基酸，在C末端有一疏水区，可能是一个膜锚定（anchor），在细胞外表面有催化区。
ACE2只有一个活性酶位点，属一种羧肽酶类，能降解10肽的血管紧张素Ⅰ的C末端胱氨酸残基，形成Ang1-9，Ang1-9 也可以在ACE 的作用下生成为Ang1-7。
Ang1-9的功能目前还不是很清楚。
ACE2也能降解血管紧张素Ⅱ为有生物活性的肽Ang1-7。
实际上，在体外研究发现，ACE2催化血管紧张素Ⅱ的效率是催化血管紧张素Ⅰ的400倍，表明ACE2的主要作用是使血管紧张素Ⅱ转化为Ang1-7。
作为心脏保护肽的Ang1-7有血管扩张作用，抗生长，抗增殖和促进凋亡的作用。
2．血管紧张素转化酶2的组织分布与ACE相比，ACE2的分布较局限，在人体，ACE2主要分布于心脏、肾脏、睾丸、内皮细胞，血管平滑肌中分布较少。
在肾脏，ACE2分布于近端肾小管上皮细胞，最近发现ACE2也分布于胃肠道、脑和肺。
基因敲除ACE2细胞系
ACE2血管紧张素转换酶2（一种血管紧张素转换酶（二肽羧肽酶家族的ACE 样核酸外切酶）主要在心脏，肾脏和睾丸的血管内皮细胞中表达。
羧肽酶血管紧张素转换酶2（ACE2）将八肽血管紧张素（Ang）-II水解为七肽Ang-（1-7），对血糖具有重要的保护作用。
ACE2基因敲除小鼠对葡萄糖的反应是耐量降低和胰岛素分泌受损。
相反，为胰腺提供ACE2基因治疗可以改善db / db小鼠血糖和原代细胞功能，这是肥胖症诱发的糖尿病常见的遗传模型。
TALEN的RNA转染产生了远距离的Ace2基因敲除小鼠，表明结肠炎让人联想到病理生理学和炎症
血管紧张素I转换酶2（ACE2）是维持肠道稳态的关键因素。
体内稳态障碍会导致结肠发炎（结肠炎），从而导致危及生命的虚弱甚至癌症。
动物模型是解读此类人类疾病背后的病理学和筛选假设的治疗靶点或范例的有价值的替代方法。
但是，疾病模型的开发可能很耗时并且需要技术，这可能会影响其应用价值。
在这项研究中，我们直接将体外转录的编码转录激活子样效应子核酸酶（TALENs）的mRNA注入远交昆明小鼠受精卵的细胞质中，从而遗传破坏了小鼠Ace2基因。
因此，诱导体细胞突变的效率为57％，其中39％为移码突变。
而且，所有修饰在种系传递过程中均稳定转移。
在Ace2基因敲除技术，系雄性小鼠（Ace2- / y）中，研究人员观察到严重的化学诱导性结肠炎，其特征在于体重减轻，腹泻和结肠长度缩短。
从组织学上讲，Ace2突变会引起白细胞浸润并严重破坏肠粘膜屏障。
此外，研究人员发现，Ace2- / y小鼠结肠组织中炎性细胞因子的表
达增加。
总体而言，数据显示通过合体注射TALEN mRNA，可以在杂种小鼠模型中实现高靶向效率和遗传性。
另外，所得的Ace2-// y小鼠表现出让人联想到结肠炎的表型特征，并且研究人员期望这种小鼠在肠道微生物组或粪便移植的研究中可能具有价值。
ACE2/血管紧张素（1-7）/ Ma轴在骨肉瘤细胞U-2 OS和MNNG-HOS中的表达和功能
肾素-血管紧张素系统（RAS）通过其经典的血管紧张素转换酶（ACE）/血管紧张素II /1型受体（AT1R）轴转移与各种实体瘤的增殖作用。
在骨肉瘤的小鼠模型中，AT1R阻滞剂可以减少肿瘤体积，并减少肝和肺转移。
替代性ACE2 / Ang （1-7）/ Ma轴在骨肉瘤中的表达和功能仍有待研究。
在这项研究中，分析了替换RAS轴的基本成分和白介素（IL）-1β刺激的表达，并研究了Mas对U-2 OS 和MNNG-HOS骨肉瘤细胞增殖和/或迁移的影响。
研究聚合酶链反应显示这两个细胞系均表达Ang（1-7）肽酶ACE2，中性内肽酶24.11，脯氨酰-内肽酶和Ang（1-7）。
身体Mas。
IL-1β诱导Mas mRNA和蛋白的表达，这与增殖和迁移的减少有关。
相反，小的干扰RNA介导的Mas表达的敲低导致细胞增殖增加。
总之，骨肉瘤细胞表达ACE2 / Ang（1-7）/ Mas轴的功能活性替代。
通过减少生长并预防癌症转移，该轴的诱导和增强可能对骨肉瘤的治疗有益。
这些作用可以通过直接施用Mas激动剂来实现，也可以通过ACE抑制剂或AT1R 拮抗剂阻断经典的AngII RAS轴来间接实现。
血管紧张素II通过p38丝裂原激活的蛋白激酶和细胞外信号调节激酶1/2信号传导调节神经元中的ACE和ACE2
脑ANG II在调节交感功能和体内平衡中起重要作用。
ANG II的产生和降解在很大程度上分别通过血管紧张素转化酶（ACE）和ACE2进行。
在疾病状态，例如高血压和慢性心力衰竭中，ACE的中央表达上调，而ACE2在中央交感神经元中减少。
在这项研究中，研究人员确定了神经元细胞培养物中ACE和ACE2对ANG II的反应及其后续信号传导机制的表达。
小鼠儿茶酚胺能神经元细胞系（CATH.a）用ANG II（30、100和300 nM）处理24小时，并通过蛋白质印迹分析确定蛋白表达。
ANG II诱导了CATH.a神经元中ACE的剂量依赖性显着增加以及ACE2 mRNA和蛋白表达的降低。
在给予ANG II或ERK1 / 2抑制剂U-0126（10μM）之前30分钟，用p38 MAPK抑制剂SB-203580（10μM）对细胞进行预处理，从而消除了这种作用。
这些数据表明，ANG II通过ANG II 1型受体，p38 MAPK和ERK1 / 2信号通路增加ACE并减弱神经元中ACE2的表达。
由Ubigene开发的CRISPR-U™（基于CRISPR / Cas9技术）在双链断裂方面比普通CRISPR / Cas9更有效，而CRISPR-U™可以大大提高同源重组的效率，轻松实现敲除（KO），体外和体内的点突变（PM）和敲入（KI）。
借助CRISPR-U，Ubigene已成功编辑了100多个细胞系上的基因。
Reference
Liu, C., Xiao, L., Li, F. et al. Generation of outbred Ace2 knockout mice by RNA transfection of TALENs displaying colitis reminiscent pathophysiology and inflammation. Transgenic Res 24, 433–446 (2015).
Ender SA, Dallmer A, Lässig F, Lendeckel U, Wolke C. Expression and function of the ACE2/angiotensin(1-7)/Mas axis in osteosarcoma cell lines U-2 OS and MNNG-HOS. Mol Med Rep. 2014;10(2):804-810. doi:10.3892/mmr.2014.2266
Xiao L, Haack KK, Zucker IH. Angiotensin II regulates ACE and ACE2 in neurons through p38 mitogen-activated protein kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling. Am J Physiol Cell Physiol. 2013;304(11):C1073-C1079. doi:10.1152/ajpcell.00364.2012。
基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。
首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。
第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。
第三，可用于稳定的重组蛋白生产。
一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。
根据科研需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。
方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。
方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。
方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。
注明| 文章是源井生物原创，转载请注明。
