反转录聚合酶链式反应

核酸检测有哪些检测方法
核酸检测是一种常用的病原体检测方法，用于检测某个生物体内的特定DNA或RNA序列。

常见的核酸检测方法包括以下几种：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种常用的核酸扩增技术，通过多次循环进行DNA序列的扩增，以检测特定的DNA或RNA序列。

2. RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）：RT-PCR结合了逆转录和PCR技术，可以将RNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，用于检测RNA病原体的存在。

3. qPCR（实时荧光定量PCR）：qPCR是一种PCR的变体，可以在扩增过程中实时检测PCR反应产生的荧光信号，以定量检测目标核酸的数量。

4. LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）：LAMP是一种在等温条件下进行核酸扩增的方法，可以快速、简便地检测特定序列的DNA或RNA。

5. 点杂交检测：通过固相杂交的方式，将特定的DNA或RNA序列与荧光标记或放射性标记结合，形成杂交产物后进行检测。

6. 基因芯片技术：利用基因芯片上的数千、数百万个特定探针，检测目标核酸序列的存在与否。

7. 测序技术：通过DNA或RNA的测序来检测其中的碱基序列，了解特定序列的存在与否。

以上是常见的核酸检测方法，每种方法都有其适用的场景和优缺点，医学实验室和疾病防控部门会根据具体需求选择适合的方法进行核酸检测。

PCR及RT-PCR概述一、目的掌握聚合酶链式反应(PCR) 及逆转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)的基本方法二、原理PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。

在由Taq DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，使用两段寡核苷酸作为反应的引物。

一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA 两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧。

反应时它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达106倍。

RNA的多聚酶链式反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcrip－tion, RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。

RNA扩增包括两个步骤：①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；②加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。

在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录，cDNA的PCR与一般PCR条件一样。

由于引物的高度选择性，细胞总RNA无需进行分级分离，即可直接用于RNA的PCR。

但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。

逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。

逆转录pcr，或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。

在rt-pcr 中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。

由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。

原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。

rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。

rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。

（检测基因表达的方法，参见northern blot法。

）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。

为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。

实时pcr实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。

real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。

一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。

real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。

逆转录聚合酶链式反应名词解释嘿，朋友！你知道逆转录聚合酶链式反应吗？这名字听起来是不是
特别高大上，让人有点摸不着头脑？其实啊，它就像是一个神奇的魔
法工具，能帮我们解开好多生物谜题呢！
比如说，我们想知道某个病毒在人体内到底有多活跃，或者研究一
种特殊基因在细胞里的表达情况，这时候逆转录聚合酶链式反应就派
上大用场啦！
它到底是咋工作的呢？简单来说，就是先把 RNA 逆转录成 DNA ，这就好比把一本外文的书翻译成我们熟悉的中文。

然后再通过聚合酶
链式反应，像复制工厂一样大量复制这些 DNA 。

这不就跟我们复印文
件一样，一下子就能得到好多好多的“副本”嘛！
想象一下，我们身体里的细胞就像一个巨大的城市，基因就是城市
里的居民。

逆转录聚合酶链式反应就像是一个超级侦探，能够精确地
找到我们想要了解的“居民”，然后把关于他们的信息大量地收集起来。

再比如说，科学家们研究癌症的时候，通过这个反应就能清楚地知
道哪些基因出了问题，从而找到治疗的办法。

这难道不神奇吗？
总之，逆转录聚合酶链式反应就是生物研究领域里的一把利剑，帮
助我们不断探索生命的奥秘！我觉得它真的太重要啦，你说呢？。

real-time rt-pcr的原理
实时反转录聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）的原理基于实时荧光定量PCR技术，结合了逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个技术。

首先，通过逆转录将RNA转录成cDNA。

这个过程由逆转录酶和引物完成，
引物与目标RNA序列的特异性序列互补。

当引物与目标RNA序列结合时，逆转录酶开始参与反应，通过循环变化的温度条件，使RNA序列转录成互补的DNA（cDNA）。

然后，这个cDNA作为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系中含有荧光探针和
引物，引物与cDNA的特异性序列互补。

当引物与cDNA序列结合时，通过循环变化的温度条件，使DNA片段扩增。

在PCR扩增过程中，荧光信号发生器被激活，荧光信号开始释放。

荧光信号的释放与DNA片段的扩增相关联，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA片段的扩增情况。

通过比较荧光信号的强度与标准曲线，可以确定初始样品中目标RNA的量。

总之，实时反转录聚合酶链式反应是一种高灵敏度、高特异性的RNA检测技术，广泛应用于基因表达分析、病毒检测和基因突变研究等领域。

RTPCRTPCR - RT-PCR简介反转录·聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-P CR）是将RNA的反转录（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA 产物。

无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。

只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Olig o（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行。

在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。

cDNA的合成首先在反转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。

在一步法RT-PCR中，在同时为反转录和PCR优化的条件下，反转录和PCR在一直观众顺次进行。

1、反转录酶的选择两种方法1、Money 鼠白血病病毒反转录酶有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37°。

2、AMV反转录酶有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适温度为42°。

2、合成cDNA引物的选择用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。

对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

一步法RT-PCR引物的选择：1. 随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA。

适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA 的反转录反应。

定义（英文全称：Polymerase Chain Reaction），性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。

到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。

编辑本段技术原理复制成同样的两分子挎贝。

在 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。

扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

编辑本段反应五要素 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)编辑本段PCR反应条件的选择 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。

3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。

延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

编辑本段酶及其浓度2.0mmol/L为宜。

Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

逆转录-聚合酶链反应逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR 使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

一、反转录酶的选择1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA 模板合成较长cDNA。

二、合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。