微生物学实验复习
3、培养基的配置原则：
(1)目的要明确(根据微生物的种类、培养目的等)，如培养基可由简单的无机物组成，生产用培养基内可加入化学成
分不明确的天然物质，而分类、鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌、放线菌和真菌的最适pH分别
为：6.5～7.5、7.5～8.5和5.0～6.0。
5、细菌培养基的配制过程？
答：配制培养液→调节PH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面（搁置斜面的长度不超过试管总长的1/2）【问题与探究】
（1）培养基灭菌后，为什么需要冷却到50 ℃左右时，才能用来搁置斜面或倒平板？你用什么办法来估计培养基的温度？
【提示】琼脂的凝固点为40 ℃，温度太高易使培养皿破裂，低于40 ℃，培养基已凝固，倒不出，所以培养基灭菌后，需冷却到50 ℃左右时才能用来倒平板，可以用手触摸盛有培养基的试管，感觉试管的温度下降到刚刚不烫手时就可以进行倒平板了。
（2）为什么需要使试管口通过火焰？
【提示】通过灼烧灭菌，防止试管口的微生物污染培养基。
（3）为了能彻底灭菌，在操作过程中应注意哪些事项？
【提示】 使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先的空气排尽，注意恒温灭菌，同时要注意高压蒸汽灭菌锅的压力(100 kPa)、温度(121 ℃)和灭菌时间(20 min)。
6、无菌操作和接种技术 (1)接种
概念：在_无 菌 条件下将微生物接入 培养基____的操作过程。 工具：玻璃刮铲、接种针和接种环。
方法：穿刺接种、斜面划线接种和平板划线接种、涂抹平板等。 （2）无菌操作——微生物接种技术的关键
①培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基等，在接种之前都需要 灭菌_。 ②通常接种操作要在____酒精灯火焰__的附近进行。
【想一想】 在微生物的培养过程中为什么要进行无菌操作？ 提示：无菌操作的目的是防止受到空气中的杂菌污染。
7、微生物的分离
（1）原理：根据微生物对_营养成分、氧气、pH 等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的必需条件，或加入某些抑制剂使非目的微生物不能生长，从而达到 选择分离 微生物的目的。 (2)方法
①据菌落形态特征初步分离 ②常用方法——平板分离法
分类?????_____________
混合平板法
______________
：是常用的平板分离法，有扇形划线、 连续划线、交叉划线和方格划线等
目的：在培养基上得到目的微生物的 单个 菌落 【归纳】无菌技术的具体内容
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 (2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
(3)实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。 (4)实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触。
（5）在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。
8、平板分离法
①原理：大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落。平板分离法能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成便于移植的菌落。
②常用培养基：最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基。
③.方法：(1)涂抹平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品倒入预先准备好的琼脂平板，用无菌玻璃刮铲将样品涂布均匀，细菌菌落常仅在平板表面生长。
(2)混合平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品与溶化的琼脂混合，将
与样品混合的琼脂倒入无菌平皿，细菌菌落出现在平板表面及内部。
(3)平板划线法：有扇形划线、连续划线、方格划线等。
涂抹平板法 平板划线法
4.目的：通过采用各种平板分离法在培养基上得到目的微生物的单个菌落。
(1)灭菌后的接种环须冷却后再挑取菌种，否则会杀死菌种。
(2)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
(3)划线时用力大小要适当，防止用力过大使培养基划破。
9、菌落数目的统计方法
(1)显微镜直接计数法
①原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
②方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻
片，其上有特定的面积为1 mm2，高为0.1 mm的计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中格，每个中格再被划分成16个(或25个)小格，每个计数室都由400个小格组成。
③操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的细菌数。
④计算公式
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数。
⑤缺点：不能区分死菌与活菌。
（2）间接计数法(活菌计数法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②操作
⒈设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落
数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培
养，计算出菌落平均数。
2.为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。
(3)滤膜法
①实例：测定饮用水中大肠杆菌的数目。
②过程：将已知体积的水过滤后，将滤膜放于伊红
菌落呈现绿色，并带有金属光泽可根据培养基上绿色的菌落数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。【特别提醒】
统计菌落数目的注意事项：
①一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
③统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。
④设置对照，目的是排除实验组中无关因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
实验探究：微生物的分离 【操作与实践】
微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。 1.稀释
用1 mL 无菌吸管吸取1 mL 大肠杆菌培养液，加入到盛有9 mL 无菌水的大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1 mL 加入另一支盛有9 mL 无菌水的试管中，混合均匀，依次类推制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6系列稀释度的大肠杆菌稀释液。
2.划线或涂布
(1)平板划线分离法——在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有平行划线和连续划线两种(如图)。平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。
特别提醒
平板划线法中的注意事项 ① 取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每
次灼烧目的 如下表：
②从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(2)涂布分离法——取3个平板，底面分别用记号笔写上10－4、10－5和10－6三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1 mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃刮铲在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10 min，使菌液吸附进培养基(如图)。
特别提醒
①将玻璃刮铲末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。
②操作中一定要注意防火，不要将过热的玻璃刮铲放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
3.培养
将划线或涂布接种的平板倒置于37 ℃培养箱
中，培养16～24 h，即可长出单菌落。
【问题与探究】
1.在涂布平板操作中，如何避免杂菌污染？
【提示】(1)酒精灯与培养皿的距离要适中。
(2)接种环、玻璃刮铲不能接触任何物体。
(3)接种环要用酒精灯灼烧。
(4)将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。
2.未接种的培养基表面有菌落生长，说明了什么？
【提示】如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后有菌落生长，说明培养基灭菌失败，需要重新制备。
3.在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立菌落？
【提示】如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落特点，则说明接种操作符合要求；如果培养基上出现其他菌落，有其他杂菌混杂，可再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。