实验 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及

分析化学实验报告范文9血红蛋白脱辅基和重组-2022-1210血红蛋白(Hemoglobin)脱辅基和和重组一、实验目的1.通过实验，了解结合蛋白的变性与变性条件下的行为，从而对结合蛋白中辅基的作用有更深的认识。

2.学习一种生物无机生化科研中常用的为金属酶和蛋白质脱辅基和重组的方法。

3.掌握柱层析法。

二、实验原理血红蛋白是由二价铁Fe(Ⅱ)血红素作为辅基与多肽链结合组成的一种结合蛋白，它是由四个亚基组成的四聚体，分子量大约为65000Da。

四个亚基中的两个亚基的氨基酸序列相同，称为α–亚基，每条链含141个氨基酸。

另外两个氨基酸序列相同的亚基，称为β–亚基，各含146个氨基酸。

α与β亚基有各自的二级、三级空间结构，亚基间以非共价键结合在一起。

每个亚基中均含有一个血红素辅基，它处于一个疏水环境，此疏水环境对血红蛋白的可逆载氧功能起着非常重要的作用。

Fe(Ⅱ)在血红蛋白中始终是以+2价还原态存在的，若被氧化成Fe(Ⅲ)，则称为高铁血红蛋白（MHb），其失去可逆载氧的功能。

血红素与血红蛋白均以非共价键相连，其中包括:①Fe(Ⅱ)与近端组氨酸(F8Hi)上的Nε上的配位键；②卟啉环侧链丙酸阴离子与蛋白质氨基酸侧链之间的盐桥；③卟啉环中乙烯基与蛋白质的疏水相的相互作用。

在酸性条件下，由于蛋白的变性而使这些作用变得很弱，以至于高铁血红素可以从血红蛋白的疏水区中游离出来。

利用高铁血红素在丁酮中的溶解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性质，用多次丁酮萃取的方法将血红素与蛋白分离。

分离得到的脱辅基血红蛋白(ApoHb)可以再用金属卟啉化合物(例如高铁血红素、钴卟啉、铜卟啉等)进行重组，生成各种不同金属卟啉的血红蛋白。

由于高铁血红蛋白（MHb）的紫外可见吸收光谱中，在405nm处有很强的特征吸收峰，而脱辅基血红蛋白(ApoHb)只在280nm处有蛋白的特征吸收峰，当将高铁血红素加入ApoHb溶液中后，重组成功的高铁血红蛋白（MHb）又会在405nm处出现它的特征吸收峰，因而血红蛋白的脱辅基与重组试验均可用紫外可见分光光度计进行检测。

《血红蛋白含量测定》实验综述报告血红蛋白是由珠蛋白、亚铁血红素等组成，作为红细胞内的一种机能蛋白，在生物体内起到传输氧气、传递电子等功能，与氧和能量代谢有关的重要活动。

在临床上出现各类贫血、白血病及心脏病等症状常与血红蛋白异常有关，因此，人体血液中和尿液的血红蛋白含量的测定是临床检测的一个重要内容。

通常用血红蛋白内的珠蛋白和亚铁血红素在血液中的总浓度来表示。

血红蛋白成分的评价应用范围较广，其涉及动物学、医学、体育学、生物工程学等领域。

目前，随着检验技术的飞速发展和医疗器械的不断改进，目前，血红蛋白含量检测方法主要有比重法、比色法721分光光度仪法、光电比色、电流阻抗法、胶体金法溶血测试条等6个不同方法测定。

1 比重法比重法是血红蛋白测定的最原始的方法，在血库或大量的献血员采血时为了节约时间，看是否贫血，在硫酸铜溶液中加入一滴于溶液中，通过其浮力方法是否大于排开水的重量如果沉入杯底，可以献血，血滴漂浮为贫血。

通过血滴在水中的比重变化来观察人体是否贫血，此方法是基于对血滴重量和在水中浮力进行测量，通过肉眼观察，粗略估计而得出的。

是依据阿基米德原理，血红蛋白是由各种亚铁血红素等构成的，血红蛋白内珠蛋白和亚铁血红素的量多少，直接影响血红蛋白含量多少，因此通过血红蛋白比重法可推算出是否贫血。

该方法不需要特定的设备，操作简单，但准确度低，没有准确的文字描述，不适合推广。

只用于一般体检且对受试者体能状况有一定的要求，故对体质较弱的人群不要采用。

2 血红蛋白目测比色法血红蛋白目测比色法是对比重法的替代，此测定器材包括两个部分，一个是比色管，一个是参照比色槽。

取0.1mol/L稀盐酸溶液2-3滴加于比色管中，再加20ul血液于比色管中，混匀、静置15分钟，不断加蒸馏水于亮光处与比色槽颜色相对照一样，液体的高度即可读取刻度即血红蛋白含量。

由于指定颜色与刻度存在对应关系，进而可以推算出受试者的血红蛋白浓度。

比色法的优点是受试者可以准确知道血红蛋白含量。

实验一、血红蛋白吸收光谱的测定一、溶血液的制备擒拿固定小白鼠，用手术镊摘除其一只眼球，取眼底血2滴于10ml蒸馏水（D.W）中，混匀。

二、吸光度测定与A-λ曲线的绘制取两只比色皿，分别装入蒸馏水、溶血液，在波长（λ）520nm~600nm的范围内，每次均以D.W调零，用分光光度计测溶血液吸光度A值，再在坐标纸上绘制A-λ曲线，并找出λmax值。

λ520 525 530 535 537 539 541 543 Aλ545 550 555 560 565 568 570 572 Aλ574 576 578 580 585 590 595 600 A▲注意事项：1.λ的选择原则：远离吸收峰时，间隔5nm；靠近吸收峰时，间隔2nm。

2.溶血液的A值在0.2~0. 8之间与溶血液的浓度线性较好。

3.氧合血红蛋白在波长为541nm、577nm、404nm、280nm及210nm处有峰值；还原血红蛋白在波长555nm处有峰值。

本次实验对象为氧合血红蛋白。

4.在A-λ曲线中描出λmax1、λmax2，并写出具体波长值。

三、结果及结果分析实验二、蛋白质性质实验一、等电点（pI）测定当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，所带静电荷为零，则溶液pH值称为蛋白质的等电点，此时蛋白质易从溶液中析出。

1.操作及结果1号管（pH=5.9）2号管（pH=5.3）3号管（pH=4.7）4号管（pH=4.1）5号管（pH=3.5）0.01mol/L醋酸0.3 — — — —0.1mol/L醋酸— 0.15 0.5 2.0 —1mol/L醋酸— — — — 0.8D.W（ml） 4.2 4.35 4.0 2.5 3.7混匀，各加入0.5ml酪蛋白液，混匀，静置，观察浑浊度。

10min后的浑浊度30min后的浑浊度pH≈pI时，试管中底部沉淀最多，上端较清亮。

2.结论二、茚三酮反应蛋白质的基本结构单位是氨基酸，水解后产生氨基酸。

血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定一、实验目的：1、了解722s型分光光度计的结构原理，并掌握其使用方法。

2、掌握血红蛋白及其衍生物的吸收光谱曲线的绘制。

3、了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定。

二、实验原理：1、可见-紫外分光光度法：利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性、定量及结构分析的方法。

单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液的浓度和厚度之间呈正比关系。

即符合光吸收的基本定律：Lanbert－Beer定律2、血红蛋白（Hb）及其衍生物具有特征性的吸收光谱，可作为它们定性和定量分析的基础。

如氧合血红蛋白（HbO2），在可见光波长400～700nm范围内有三个特征性的吸收峰，分别称为γ、α及β吸收带，其峰值或最大吸收波长（λmax）分别在415、541和576nm处。

γ带是由原卟啉的电子云所引起，α及β带则决定于铁原子电荷及其配体性质。

在正常人的动脉血中，Hb大部分以HbO2形式存在。

当向HbO2溶液中通入CO时，因Hb与CO的结合力比氧大得多，故可迅速转变为碳氧血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变，峰值蓝移（向短波方向移动），并在波长419、540和569nm处出现三个特征性的吸收峰。

3、本实验先制备Hb及其衍生物，然后在不同波长下测其吸光度A（又称光密度），以A 为纵坐标，波长为横坐标绘制吸收光谱曲线，由此可以确定它们最大的吸收波长。

对定量而言，在峰值波长下进行测定，其灵敏度较大。

三、实验步骤：1.样品的制备①氧合血红蛋白（HbO2）液：取贮存血红蛋白液0.lmL（2滴）盛于小烧杯中，用量筒加20mL蒸馏水，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。

②碳氧血红蛋白（HbCO）液：取上述HbO2液约5mL至大试管中，通入CO约30s～1min，，当鲜红色变为樱桃红色时停止通气，HbO2即变成HbCO。

2.吸收光谱曲线的绘制①将上述制备的2种血红蛋白溶液分别盛于比色杯内，在722s型分光光度计上以蒸馏水作为溶剂空白调节吸光度零点。

血红蛋白(Hemoglobin)脱辅基和和重组一、实验目的1.通过实验，了解结合蛋白的变性与变性条件下的行为，从而对结合蛋白中辅基的作用有更深的认识。

2.学习一种生物无机生化科研中常用的为金属酶和蛋白质脱辅基和重组的方法。

3.掌握柱层析法。

二、实验原理血红蛋白是由二价铁Fe(Ⅱ)血红素作为辅基与多肽链结合组成的一种结合蛋白，它是由四个亚基组成的四聚体，分子量大约为65000Da。

四个亚基中的两个亚基的氨基酸序列相同，称为α–亚基，每条链含141个氨基酸。

另外两个氨基酸序列相同的亚基，称为β–亚基，各含146个氨基酸。

α与β亚基有各自的二级、三级空间结构，亚基间以非共价键结合在一起。

每个亚基中均含有一个血红素辅基，它处于一个疏水环境，此疏水环境对血红蛋白的可逆载氧功能起着非常重要的作用。

Fe(Ⅱ)在血红蛋白中始终是以+2价还原态存在的，若被氧化成Fe (Ⅲ)，则称为高铁血红蛋白（MHb），其失去可逆载氧的功能。

血红素与血红蛋白均以非共价键相连，其中包括:①Fe(Ⅱ)与近端组氨酸(F8His)上的Nε上的配位键；②卟啉环侧链丙酸阴离子与蛋白质氨基酸侧链之间的盐桥；③卟啉环中乙烯基与蛋白质的疏水相的相互作用。

在酸性条件下，由于蛋白的变性而使这些作用变得很弱，以至于高铁血红素可以从血红蛋白的疏水区中游离出来。

利用高铁血红素在丁酮中的溶解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性质，用多次丁酮萃取的方法将血红素与蛋白分离。

分离得到的脱辅基血红蛋白(ApoHb)可以再用金属卟啉化合物(例如高铁血红素、钴卟啉、铜卟啉等)进行重组，生成各种不同金属卟啉的血红蛋白。

由于高铁血红蛋白（MHb）的紫外可见吸收光谱中，在405nm 处有很强的特征吸收峰，而脱辅基血红蛋白(ApoHb)只在280nm处有蛋白的特征吸收峰，当将高铁血红素加入ApoHb溶液中后，重组成功的高铁血红蛋白（MHb）又会在405nm处出现它的特征吸收峰，因而血红蛋白的脱辅基与重组试验均可用紫外可见分光光度计进行检测。

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告一、实验目的本实验的目的是通过凝胶层析分离法，将血红蛋白与核黄素进行分离，并通过紫外吸收光谱法进行检测。

二、实验原理凝胶层析法是一种基于分子大小差异的分离方法，其原理是将待分离物质通过一定孔径大小的凝胶柱，使大分子无法进入孔隙而被留在柱上，小分子则能够穿过孔隙而流出柱底。

血红蛋白和核黄素在凝胶层析柱中的迁移速率不同，因此可以进行有效分离。

三、实验材料与仪器1. 血红蛋白和核黄素样品；2. Sephadex G-25凝胶柱；3. 紫外吸收光谱仪；4. 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）。

四、实验步骤1. 将Sephadex G-25凝胶柱用0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤至平衡状态；2. 将样品混合后加入到凝胶柱中，以0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）作为流动相；3. 收集柱底流出的分离物质，用紫外吸收光谱仪进行检测。

五、实验结果与分析1. 实验结果将血红蛋白和核黄素样品通过凝胶层析柱进行分离后，收集到了两种物质。

经过紫外吸收光谱检测，血红蛋白的最大吸收波长为280nm，核黄素的最大吸收波长为375nm。

2. 结果分析通过凝胶层析法成功地将血红蛋白和核黄素进行了有效分离。

在紫外吸收光谱检测中，血红蛋白和核黄素都有明显的吸收峰。

由于两种物质在不同波长下具有不同的最大吸收值，因此可以通过紫外吸收光谱法对其进行定量检测。

六、实验注意事项1. 凝胶柱洗涤至平衡状态后再加入样品；2. 流动相需保持恒定；3. 采用紫外吸收光谱法时需注意波长选择。

七、实验结论本实验通过凝胶层析分离法成功地将血红蛋白和核黄素进行了有效分离，并通过紫外吸收光谱法进行了检测。

该方法简单易行，可用于生物大分子的分离和检测。

一、实验目的1. 了解血红蛋白的生理功能和生化特性。

2. 掌握血红蛋白的提取、分离和定量方法。

3. 熟悉实验操作技能，提高实验操作能力。

二、实验原理血红蛋白（Hemoglobin，Hb）是红细胞内的一种含铁蛋白质，主要功能是运输氧气和二氧化碳。

血红蛋白的分子量约为67000，由四个亚基组成，每个亚基包含一个血红素（Heme）基团。

血红素是血红蛋白的主要功能基团，它能够与氧气和二氧化碳结合。

血红蛋白的提取、分离和定量方法主要包括以下几种：1. 离心法：根据血红蛋白的密度不同，通过离心分离血红蛋白。

2. 电泳法：根据血红蛋白的电荷和分子量差异，通过电泳分离血红蛋白。

3. 荧光光谱法：通过荧光光谱分析血红蛋白的浓度。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜血液、生理盐水、蒸馏水、0.9%氯化钠溶液、三氯乙酸、碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铵、磷酸盐缓冲液、生理盐水、10%TCA溶液、1%Na2CO3溶液、0.1%氢氧化钠溶液、邻苯二甲酸氢钾、荧光分光光度计等。

2. 实验仪器：离心机、电泳仪、荧光分光光度计、天平、移液器、烧杯、试管、玻璃棒、滴管等。

四、实验步骤1. 血红蛋白的提取（1）取新鲜血液5ml，加入等体积的生理盐水，充分混合后离心（3000r/min，10min）。

（2）取上层红细胞沉淀，加入等体积的三氯乙酸溶液，充分混合后离心（3000r/min，10min）。

（3）取上层红细胞沉淀，加入0.9%氯化钠溶液，充分混合后离心（3000r/min，10min）。

（4）取上层红细胞沉淀，加入10%TCA溶液，充分混合后离心（3000r/min，10min）。

（5）取上层红细胞沉淀，加入1%Na2CO3溶液，充分混合后离心（3000r/min，10min）。

（6）取上层红细胞沉淀，加入0.1%氢氧化钠溶液，充分混合后离心（3000r/min，10min）。

2. 血红蛋白的分离（1）取上述提取的血红蛋白溶液，加入10%硫酸铵溶液，充分混合后离心（3000r/min，10min）。

血红蛋白吸收光谱参考文献血红蛋白吸收光谱是研究血红蛋白分子结构和功能的重要手段之一。

下面是一些常用的血红蛋白吸收光谱的参考文献：1. Dou Y, et al. (2018) "Hemoglobin absorption spectrain the visible range: A systematic study and evaluation." Journal of Biophotonics, 11(11): e201700389. 这篇文章系统地研究了血红蛋白在可见光范围内的吸收光谱，并对其进行了评估。

2. Prahl SA, et al. (1999) "Determination of optical properties of turbid media spanning visible and near-infrared regimes." Applied Optics, 38(22): 4870-4883. 这篇文章介绍了一种用于测量生物组织中光吸收和散射的方法，并包括了血红蛋白的吸收光谱数据。

3. Jacques SL. (2013) "Optical properties of biological tissues: a review." Physics in Medicine and Biology, 58(11): R37-R61. 这篇综述文章回顾了生物组织的光学性质，包括血红蛋白的吸收光谱。

4. Prahl SA. (1999) "Tabulated molar extinction coefficient for hemoglobin in water." 这个网页提供了血红蛋白在水中的摩尔消光系数的表格数据，可以用于计算血红蛋白的吸光度。

这些参考文献涵盖了血红蛋白吸收光谱的不同方面，可以作为研究和了解血红蛋白光学特性的重要参考。