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实验二血红蛋白测定白细胞计数实验一、实验目的本实验旨在通过血红蛋白测定方法，对白细胞计数进行实验，并掌握相关的操作技巧和实验原理。
二、实验原理血红蛋白测定是通过草酸亚铁试剂与血红蛋白中的铁离子发生络合反应，形成血红蛋白-草酸亚铁络合物，进而测定出血红蛋白的含量。
通过对样品的均匀悬浮液进行比色测定，得出血红蛋白的浓度，从而实现对白细胞计数的目的。
三、实验仪器和试剂1. 仪器：血常规分析仪2. 试剂：0.2%草酸亚铁溶液、双氯加乙酰胺稀溶液、磷酸盐缓冲液、去离子水、血样四、实验步骤1. 操作前准备：(1) 调节血常规分析仪为透射光测定模式，设置好相应的波长。
(2) 准备好0.2%草酸亚铁溶液、双氯加乙酰胺稀溶液、磷酸盐缓冲液。
(3) 使用去离子水将血常规分析仪的反应池冲洗干净。
2. 样品制备：(1) 取一定量的血样，并避免气泡的产生。
(2) 将血样与双氯加乙酰胺稀溶液按比例混合，使其完全混合均匀。
(3) 用磷酸盐缓冲液稀释血样，制成不同浓度的样品液。
3. 实验操作：(1) 将制备好的不同浓度的样品液分别注入预先准备好的试管中。
(2) 同时，在一组试管中加入适量的去离子水作为空白对照。
(3) 将试管放入血常规分析仪中，按照仪器要求进行测量。
4. 记录结果：(1) 通过血常规分析仪测得各样品的吸光度数值。
(2) 画出吸光度与样品浓度的标准曲线。
(3) 根据标准曲线，计算出待测样品的血红蛋白浓度。
五、实验数据处理根据血红蛋白浓度的计算公式，将实验测得的吸光度数值代入，计算出不同样品的血红蛋白浓度。
通过对标准曲线的拟合，进一步计算出待测样品的白细胞计数。
六、实验注意事项1. 操作过程中避免气泡的产生，以免影响实验结果的准确性。
2. 严格按照实验步骤进行操作，确保实验的可重复性和准确性。
3. 注意安全操作，避免试剂的误食或皮肤接触。
4. 注意保持实验环境的清洁，避免实验样品的污染和交叉污染的发生。
七、实验结果与讨论根据实验数据计算得出的血红蛋白浓度及白细胞计数可以用于评估人体的健康状况。
第40 卷!第 期2020 年 5 月Vol.40!No.5!pp*425-*430May !2020光谱学与光谱分析SpectroscopyandSpectralAnalysis健康人血红蛋白紫外可见吸收光谱和FCIR 光谱丘家杵*4!阮 萍24" !雍军光3!冯博华24!黄代政5!沈洪涛6*. 广东药科大学劳动卫生与环境卫生学系!广东 广州 53*02. 广东药科大学生物医学工程系!广东 广州 5*00063. 广东药科大学附属门诊部!广东 广州 5*02354. 广东省医药3D 打印机及个性化医疗工程技术研究中心！广东广州5100065. 广西医科大学生物医学工程系!广西南宁5300216. 广西师范大学物理科学与技术学院！广西桂林541001摘要为了探究健康人固体血红蛋白(hemoglobin, Hb)的紫外可见吸收光谱和傅里叶变化红外光谱的谱 学特征，将2*〜80岁健康人分成四个年龄阶段组，采用葡聚糖层析法高度纯化新鲜血液红细胞内的Hb ,利用冷冻干燥法获得结构稳定的Hb 固体,测定四组样本的Hb 紫外可见吸收光谱和FTIR 光谱；利用OMN- IC 8 0软件的'C 比较分析功能、全光谱特征分析和二级结构分析首次归纳得出健康人Hb 的紫外光谱及 FTIR 光谱$分析显示样本间,四组间Hb 紫外可见吸收光谱和FTIR 光谱高度相同,FTIR 光谱间的匹配度高达95%(所有样本Hb 的紫外光谱均有5个特征吸收峰,吸收峰所在位置的吸光度、波长相同；FTIR 光谱均有*3个特征吸收峰，吸收峰所在位置的吸光度、波数是相同的；Hb 紫外吸收光谱显示健康人Hb 拥有相同的三级结构,FTIR 光谱的特征吸收带Amide /带二阶导数谱匹配度高达99% ,其二级结构均由1*个子峰构成，组成则以o -螺旋为主$研究得出健康人Hb 的紫外可见吸收光谱和FTIR 光谱，并通过初步分析得到 Hb 的光谱学特征和结构特点!有助于研究相关疾病$ 关键词 健康人( 血红蛋白( 紫外光谱( iTIR ( 参照光谱中图分类号：0657.3文献标识码：ADOI ： *0.3964". issn. *000-0593(2020)05-*425-06引 言人血红蛋白是由2 个0和2 个-亚基组成的四聚体!最重要的功能是运输氧到人体组织器官供细胞代谢!维持其正 常功能$ 此外还能调节红细胞代谢!参与电子传递等过程*+$ 迄今为止!相关研究发现了超过*000 种与血红蛋白合成或结构异常相关的疾病*2+!缺乏有效临床手段治愈此类疾病!提示现有的知识仍无法满足相关疾病的诊疗需求*3+!这就需要进一步研究Hb 的特性、结构与功能$以往物质分析技术大多会在测试过程中损坏被测样本! 光谱学方法有不破坏测试样本的优势$ 紫外可见吸收光谱 (ultraviolet visible absorption spectra)和傅里叶红外变换光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR )可以不破坏物质结构的前提下对物质结构、 组成和含量等进行分析$紫外可见吸收光谱可以用于分析蛋白质结构和研究蛋白质间相互作用等*4+$ iTIR 则还有扫描快、 高分辨率和高灵敏度等特点$近年来，FTIR 广泛的应用于各行业包括食品、农业、 药物和炼油与化工等的研究中( 在医学上的应用也越来 越受关注！应用范围也越来越广，如利用FTIR 研究证明乳 腺疾病的病理学等级与微钙化存在关联，提出可基于FTIR建立更有效的疾病诊断方法*5+(利用FTIR 可实时监测药物 作用时乳腺癌细胞的病理生理学改变!基此实时评价药物疗 效!从微观层面了解病理生理学改变和药物作用对治疗有重大意义$ FTIR 技术的高精确度、灵敏度和良好的可重复性, 可以准确的对蛋白质结构等进行分析*6+$有关Hb 光谱研究的常见的报道是探究外界条件或疾病 对 Hb 光谱的影响!如环境条件发生改变或受到电离辐射或 长期处于某些慢性疾病状态时!人的 Hb 光谱就会发生相应的改变,提示Hb 结构功能的改变*79+ $而高纯度且覆盖年龄收稿日期：20*8-**-30%修订日期：20*9-03-02基金项目：广东省科技计划项目(016A020215162),国家自然科学基金项目(11765004, 81860604)资助 作者简介：丘家杵,*993年生,广东药科大学公共卫生学院硕士研究生 e-mal 'Njc793509738#*"通讯联系人e-mal 'ruanp:ng #1426光谱学与光谱分析第40卷段较广的健康人红细胞中Hb光谱的研究几乎没有报道!因此本研究将通过紫外可见吸收光谱和FTIR光谱技术探究健康人Hb的光谱学特征！初步建立健康人Hb的参照光谱!为以后利用光谱学研究疾病或环境与Hb结构的关系提供参考对照图谱$1实验部分1.1仪器与材料Tensor37傅里叶变换红外光谱仪（Bru>er,德国），_-3010紫外光谱仪"日立!日本#!JY600C电泳仪"君意!北京#!台式冷冻高速离心机（Hettich Mi>ro,德国），8000-14000透析袋"索莱宝!北京#$1.?研究对象与采样1.2.1样本随机选取经医院体检为健康的21〜80岁成人共232名,均为汉族（机体随着年龄增长而逐渐老化,血液成分亦会发生相应改变m i1+,故将年龄划分为4组，分别是a组21〜35岁63人"男31人,女32人#,b组36〜50岁60人"男31人,女29人#,c组51〜65岁58人（男30人，女28人#,d组66〜80岁51人"男25人!女26人#$1.2.2样本采集与Hb样品制备研究对象至少禁食8h,抽取肘部外周静脉血于EDTA-P2抗凝管$于12h内将2mL全血样品用生理盐水洗涤后3 000r•min—1离心10min,除上层血浆及中间绒毛层细胞,重复3次$加蒸馏水于4X冰箱破裂12h,4X12000r・min—1离心45min,取上层Hb溶液用G-75葡聚糖凝胶层析法纯化Hb,浓缩后聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE#鉴定Hb纯度达95%以上$部分纯化Hb溶液样品用于紫外光谱测试，另一部分冷冻干燥后用于FTIR光谱测试$1.3测试分析与数据处理以2mL去离子水稀释100"l待测Hb溶液样品，紫外光谱扫描波长范围设定为190〜800nm,精度士0.1nm,测试前进行空白扫描与背景扣除!每个样本重复测量3次!取其均值图谱$Hb粉末与PBr粉末比例混合制成锭片!红外光谱仪采用空气冷却DTGS检测器，扫描的范围为4000〜400cm—1,重复扫描64次，分辨率设置为4cm—1,室温25X,湿度控制在25%以下$扫描前以纯KBr•窗片作空白背景，进行水汽与CO2自动校正，重复3次，取均值图谱$紫外可见吸收光谱采用origin9.0软件进行分析;健康人Hb红外光谱数据使用OPUS7.0软件采用11点最小二乘法平滑函数法进行处理!为消除压片浓度差影响将光谱纵坐标归一化$利用OMNIC8.0软件的'C比较功能分析光谱间的相似度,对红外光谱特征吸收带Amide/带（1700〜1600cm-1）进行二阶导数和傅里叶去卷积处理，根据二阶导数谱和去卷积谱所得信息结合Pea>Fit4.0软件对Amide/带进行Gaussian曲线拟合处理!获得HbAmide/带二级结构组成$使用SAS9.4软件进行统计学分析，5'"・05为有统计学意义$2结果与讨论?.1Ub紫外吸收光谱及其吸收峰指认测得的4组Hb紫外光谱如图1中/&,,?所示，4组Hb紫外光谱的谱形相同，吸收峰位重置相同$4组Hb平均紫外光谱在190〜800nm的范围主要有5个吸收峰，峰位均位于274,346,414,540和576nm处，如图2所示$其中274nm处的吸收峰由Hb的酪氨酸）色氨酸及苯丙氨酸残基的共轭发色团吸收紫外光而产生!体外研究表明Hb在处于异常状态时会导致增色或减色效应!可能导致三级结构发生变化!导致原本包裹的芳香族氨基酸残基暴露于溶液中*,12+；414nm处的吸收峰是血红素卟啉环的特征吸收峰, 540和576nm处的吸收峰分别属于氧合血红蛋白（HbO2）的a和"吸收峰，反映的是Hb的携氧能力*,12+$各年龄组Hb 紫外光谱5个吸收峰处的平均吸光度值见表1各年龄组相对应特征峰位的吸光度值的差异无统计学意义（5,0.05）结合图1说明随着年龄增长Hb紫外光谱不会发生改变$图1B组血红蛋白紫外可见吸收光谱'i).1GV-Vi0b93.b0+/-4i+10-3@4/.+:Ub图?血红蛋白紫外可见吸收光谱'i).?R3-/30314.4i83GV-Vi0b93.b0+/-4i+10-3@4/.+:Ub0.m-93第5期光谱学与光谱分析*427Groupabd表1B组血红蛋白紫外可见吸收光谱吸收峰均值士标准差C.29e1Ke.18.97e0.1;04.1;./;;e8i.4i+10+:GV-Vi029e.20+/-4i+10-e@4/.+:U2274344Absorbance4145405760.05*6p0.00820.0522p0.00870.052*p0.00880.05*4p0.00840.04*4p0.00670.04*9p0.00700.048p0.007*0.*856p0.03240.*875p0.03300.*865p0.03340.0209p0.00370.02**p0.00380.02**p0.00390.04*3p0.00680.02*8p0.00400.022*p0.00420.0220p0.00420.027p0.004*2.2U2FCIR光谱及其吸收峰指认4组HbiTIR平均光谱如图3所示!经过基线校正、纵坐标归一化等消除实验误差！获得Hb FTIR全信息光谱。
实验一、血红蛋白吸收光谱的测定一、溶血液的制备擒拿固定小白鼠，用手术镊摘除其一只眼球，取眼底血2滴于10ml蒸馏水（D.W）中，混匀。
二、吸光度测定与A-λ曲线的绘制取两只比色皿，分别装入蒸馏水、溶血液，在波长（λ）520nm~600nm的范围内，每次均以D.W调零，用分光光度计测溶血液吸光度A值，再在坐标纸上绘制A-λ曲线，并找出λmax值。
λ520 525 530 535 537 539 541 543 Aλ545 550 555 560 565 568 570 572 Aλ574 576 578 580 585 590 595 600 A▲注意事项：1.λ的选择原则：远离吸收峰时，间隔5nm；靠近吸收峰时，间隔2nm。
2.溶血液的A值在0.2~0. 8之间与溶血液的浓度线性较好。
3.氧合血红蛋白在波长为541nm、577nm、404nm、280nm及210nm处有峰值；还原血红蛋白在波长555nm处有峰值。
本次实验对象为氧合血红蛋白。
4.在A-λ曲线中描出λmax1、λmax2，并写出具体波长值。
三、结果及结果分析实验二、蛋白质性质实验一、等电点（pI）测定当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，所带静电荷为零，则溶液pH值称为蛋白质的等电点，此时蛋白质易从溶液中析出。
1.操作及结果1号管（pH=5.9）2号管（pH=5.3）3号管（pH=4.7）4号管（pH=4.1）5号管（pH=3.5）0.01mol/L醋酸0.3 — — — —0.1mol/L醋酸— 0.15 0.5 2.0 —1mol/L醋酸— — — — 0.8D.W（ml） 4.2 4.35 4.0 2.5 3.7混匀，各加入0.5ml酪蛋白液，混匀，静置，观察浑浊度。
10min后的浑浊度30min后的浑浊度pH≈pI时，试管中底部沉淀最多，上端较清亮。
2.结论二、茚三酮反应蛋白质的基本结构单位是氨基酸，水解后产生氨基酸。
hemin吸收光谱
血红蛋白吸收光谱（hemoglobin absorption spectrum）是一种测定血红蛋白分子的吸收光谱，可以了解血红蛋白对不同波长光的吸收能力。
血红蛋白是一种具有吸收光谱特性的蛋白质，它对可见光范围内的不同波长光线都有不同的吸收能力。
通过测定血红蛋白在不同波长光下的吸光度，可以绘制出它的吸收光谱。
血红蛋白的吸收光谱具有明显的特征性，其吸收峰主要在
415nm、540nm和575nm处，这些峰对应于血红蛋白分子的特定吸收带。
其中，415nm处的吸收峰与血红蛋白的卟啉环结构有关，而540nm和575nm处的吸收峰则与血红蛋白的Fe²⁺离子有关。
通过血红蛋白的吸收光谱分析，可以了解血红蛋白的结构和性质，进一步研究其与氧气和二氧化碳的结合和解离过程，以及在生理和病理状态下的变化情况。
这些信息有助于深入了解人体血液的生理和病理机制，为医学诊断和治疗提供重要依据。
一、实验目的1. 掌握血红蛋白测定的原理和方法。
2. 了解血红蛋白在人体中的生理作用和临床意义。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据分析能力。
二、实验原理血红蛋白是一种含铁的蛋白质，主要存在于红细胞中，具有携带氧气和二氧化碳的功能。
血红蛋白测定主要通过比色法进行，利用血红蛋白在特定波长下的光吸收特性，通过比较待测样本与标准品的吸光度，计算出血红蛋白的浓度。
三、实验材料1. 仪器：分光光度计、离心机、恒温水浴箱、吸管、试管等。
2. 试剂：血红蛋白标准品、邻甲联苯胺溶液、过氧化氢溶液、醋酸溶液、生理盐水、抗凝剂等。
四、实验方法1. 标准曲线绘制（1）取6个试管，分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml血红蛋白标准品，加入生理盐水定容至1ml。
（2）向每个试管中加入2ml邻甲联苯胺溶液，混匀。
（3）将试管放入恒温水浴箱中，37℃水浴10分钟。
（4）取出试管，加入2ml过氧化氢溶液，混匀。
（5）用分光光度计在530nm波长下测定吸光度。
（6）以血红蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样本测定（1）取静脉血2ml，加入抗凝剂，混匀。
（2）离心分离血浆，取血浆1ml。
（3）按照标准曲线绘制步骤，测定吸光度。
（4）根据标准曲线，计算血红蛋白浓度。
五、实验结果1. 标准曲线绘制根据实验数据，绘制标准曲线，得到线性方程：y = 0.017x + 0.001。
2. 样本测定根据实验数据，计算血红蛋白浓度为120g/L。
六、实验讨论1. 本实验通过比色法测定血红蛋白浓度，操作简单，结果准确。
2. 血红蛋白浓度是反映人体贫血程度的重要指标，对临床诊断和治疗具有重要意义。
3. 在实验过程中，应注意以下事项：（1）试剂应避光保存，避免受潮、污染。
（2）操作过程中应保持恒温水浴箱温度稳定。
（3）分光光度计应校正，确保测量准确。
（4）实验数据应准确记录，便于后续分析。
七、实验结论通过本实验，我们掌握了血红蛋白测定的原理和方法，了解了血红蛋白在人体中的生理作用和临床意义。
血红蛋白吸收曲线的绘制
血红蛋白吸收曲线的绘制通常需要使用分光光度计进行测定。
以下是绘制血红蛋白吸收曲线的一般步骤：
1.准备所需试剂和设备：血红蛋白溶液、分光光度计、比色皿、吸管、移液
管等。
2.配制不同浓度的血红蛋白溶液：根据实验要求，配制不同浓度的血红蛋白
溶液。
3.绘制标准曲线：取适量血红蛋白溶液，分别加入比色皿中，用分光光度计
在波长为540nm处测定吸光度。
以吸光度为纵坐标，血红蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。
4.测定未知样品：取未知浓度的血红蛋白样品，按照相同的方法测定吸光度。
5.根据标准曲线计算样品浓度：通过标准曲线，根据未知样品的吸光度，可
以计算出样品的浓度。
需要注意的是，在绘制血红蛋白吸收曲线时，应保证实验条件的一致性，如温度、pH值、缓冲液等。
同时，为了获得准确的实验结果，应进行多次重复实验，并对数据进行处理和分析。
实验名称血红蛋白测定_-实验目的掌握间接比色测定血红蛋白值的方法。
实验内容及原理沙里比色法是用稀盐酸加入血液中，使血红蛋白变成不易变色的棕褐色高铁血红蛋白，则可以与一标准色相比，从而测出其含量。
实验仪器血红蛋白计、采血针、蒸馏水、 95%酒精、乙醚、75%酒精、棉球、0.1mol·L -1 HCl、血红蛋白稀释放液、铁氰化钾等。
实验步骤（１）用采血针在无名指端采血。
用干棉花拭去第一滴血，待第二滴血自然流出一大滴时，用血红蛋白吸管吸至20μL刻度处。
仔细将吸管尖端外面的血液拭去。
（２）将吸管中血液轻轻地加入到测定管中盐酸的底部，并把上层清澈的盐酸溶液回吸几次，使吸管内的血液完全洗净。
取出吸管后轻轻摇动比色管，使血液与盐酸充分混合。
静置10min，使作用完全，充分形成棕色的高铁血红蛋白。
（３）用滴管将蒸馏水一滴一滴地加入测定管内。
每加一滴蒸馏水，即用玻璃校友会搅动混匀，并观察管内的颜色，直到管内溶液色度和标准比色架上标准色玻璃的色度相等为止。
读出管内液面所在的刻度，即每100mL血液中所含血红蛋白的克数。
实验数据分析我国成人Hb正常值男：120~160g·L -1 ，女：110~150g·L-- -1 。
男低于120 g·L -1 和女低于110 g·L -1 时诊断为贫血，并出现倦乏、无力、头晕等各种症状。
一般人与运动员都以此为标准。
常居高原者血红蛋白含量偏高。
实验注意事项采血针应一人一根针，严防交叉感染。
思考题报告同组同学的血红蛋白测定值，并解释男女之间差异的原因。
血红蛋白检测原理
血红蛋白检测是一种检测血液中血红蛋白浓度的方法，其原理基于法国科学家吕赛克发现的光吸收定律。
血红蛋白在不同波长的光线中，会吸收不同程度的光线。
常用的检测方法是将一定量的血液置于一个透光性良好的玻璃或石英池中，然后通过光源照射，测量经过血液后的光线吸收程度。
通常使用可见光区域内的黄光（546nm）或绿光（578nm），这两种颜色的光线被证明可以被血红蛋白特异性吸收。
血红蛋白的含量和吸收光线的程度成正比关系，因此可以通过测量血液吸收光线的程度来计算血液中血红蛋白的浓度。
常见的血红蛋白浓度测试方法包括血红蛋白色谱法、血红蛋白浓度计法等。
一、实验目的1. 掌握血红蛋白测定的原理和方法。
2. 了解血红蛋白在临床医学中的应用。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据分析能力。
二、实验原理血红蛋白（Hemoglobin，Hb）是红细胞内的一种含铁蛋白质，具有携带氧气和二氧化碳的功能。
血红蛋白的测定方法主要包括比色法、直接测定法和血浆游离血红蛋白测定法等。
本实验采用比色法测定血红蛋白含量。
三、实验材料与仪器1. 试剂：血红蛋白标准液、邻甲联苯胺溶液、双氧水、醋酸溶液、蒸馏水、生理盐水等。
2. 仪器：分光光度计、微量移液器、试管、离心机、移液管等。
四、实验方法与步骤1. 标准曲线绘制（1）取一系列试管，分别加入不同浓度的血红蛋白标准液，加入蒸馏水至一定体积。
（2）向各试管中加入适量的邻甲联苯胺溶液和双氧水，混匀。
（3）室温放置10分钟后，用分光光度计在波长540 nm处测定吸光度。
（4）以血红蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血红蛋白含量测定（1）取一定量的待测血液，加入适量的生理盐水，混匀。
（2）离心分离血浆，取上层血浆至试管中。
（3）按照标准曲线绘制方法，测定血浆的吸光度。
（4）根据标准曲线，计算待测血液中的血红蛋白含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制根据实验数据，绘制标准曲线如下：```血红蛋白浓度（g/L）| 吸光度-------------------|--------0.0 | 0.0000.2 | 0.1500.4 | 0.3000.6 | 0.4500.8 | 0.6001.0 | 0.750```2. 血红蛋白含量测定根据标准曲线，计算待测血液中的血红蛋白含量为X g/L。
六、实验讨论1. 本实验采用比色法测定血红蛋白含量，该方法操作简便、快速，准确度较高。
2. 实验过程中，应注意防止血红蛋白污染，确保实验结果的准确性。
3. 血红蛋白含量测定在临床医学中具有重要意义，可用于诊断贫血、溶血性贫血等疾病。
