4h后:20℃,pH6.0,DO为60%,5~6.5h。
终点控制:OD值达9.0±1.0,5℃冷却水快速降
温至15℃以下。
检测:发酵液杂菌检查
4.菌体收集
连续流离心机:冷却的发酵液,16000 r/min 离心收集。 菌体保存:-20℃冰柜,不超过12个月。 检测:干扰素含量、菌体蛋白含量等。
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1990,rhuIFNγ-1b;1993,rhuIFNβ-1b;
2001-2002:PEG化IFN,PEG-Intron, Pegasys
表达产物:无糖基化,N-met,无活性包涵体
工艺特点:发酵过程,随后变性、复性过程。
3、干扰素生产工艺路线(4)
动物无限细胞系培养生产工艺:
第一步:干扰素α-2b基因的克隆 P73 图2-13
pBR322质粒
诱生的白细胞
提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱获得寡A的mRNA
pBR322质粒DNA的PstI酶 蔗糖密度梯度离心提取12s的 mRNA 切割加上dA或dC 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾
退火获的杂交质粒
转化大肠杆菌
干扰素教学
2、重组干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性(rhuIFNα) 慢性乙型、丙型、丁型肝炎;疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性(rhuIFNα) ������ 毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇
金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤(rhuIFNγ) 多发性硬化症rhuIFNβ
cDNA,PCR,基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。
1、基因工程假单胞杆菌菌种建立
第二步:表达载体构建 IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体