干扰素

培养：30℃，pH7.0。
控制：级联调节通气量和搅拌转速
溶解氧（DO）为 30%，3～4h，OD>4.0。 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。
3．发酵罐培养
接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。
控制：级联调节通气量和搅拌转速。 前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。
其他：热原，内毒素等
干扰素的剂型
• 冻干粉针剂 临床上早期使用的、世界上应用最广的 一类干扰素制剂, 同时它的生产工艺也最为稳
• 注射剂( 水针剂) 临床最为常用, 主要用于病毒感 染性疾病和肿瘤的治疗 • 栓剂 在临床上被用来治疗由人类疱疹病毒和乳头 瘤病毒感染引起的宫颈糜烂。
• 干扰素滴眼剂 病毒性角膜炎 • 喷雾剂 可以用来治疗某些病毒性皮肤病; 同时它可 以喷入鼻腔或口腔, 用来预防和治疗某些呼吸系统 疾病, 如感冒、口唇疱疹、SARS等.
3、干扰素生产工艺路线（3）
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺：
上市产品：重组人干扰素rhuIFN ������ 1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；
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1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；
2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys
复习
• 1. 基因工程药物制备的一般过程。 • 2. 利用基因工程技术生产药品的优点有哪些？
• 3. 获得目的基因常用的三种方法是（
（ ）和（ ）。
）、
作业
1、表达载体必须具备的条件有哪些？
2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？ 1、质粒不稳定分为哪两类? 2、如何解决质粒不稳定性？
• 对由基因重组技术所获得的蛋白质药物产 品进行鉴定时，常做哪些项目分析？
表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体
工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
3、干扰素生产工艺路线（4）
动物无限细胞系培养生产工艺：
中华仓鼠卵母细胞
上市产品：rhuIFNβ-1a ������ 1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)
表达产物：166 aa糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格
3、干扰素生产工艺路线（5）
宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida）
上市产品：IFN α-2b/安福隆
表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分
子结构和生物活性
工艺特点：
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发酵周期短：几个小时
无需变性、复性过程，获得有活性产品
3.1 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏
2、菌种库的建立与保藏
品质控制（QC）：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 菌种检查合格后，方可投产。
3.2 干扰素的发酵工艺过程
1．摇瓶培养
取保存工作种子批菌种，室温融化
摇瓶培养：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h
检测：OD值和发酵液杂菌检查。
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2．种子罐培养
接种：接入50L种子罐，接种量10%。
1、基因工程假单胞杆菌菌种建立
2、菌种库的建立与保藏
1、基因工程菌菌种建立
第一步：干扰素α-2b基因的克隆 P73 图2－13
pBR322质粒
诱生的白细胞
提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱获得寡A的mRNA
pBR322质粒DNA的PstI酶 蔗糖密度梯度离心提取12s的 mRNA 切割加上dA或dC 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾
cDNA,PCR，基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。
1、基因工程假单胞杆菌菌种建立
第二步：表达载体构建 IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体
1、基因工程假单胞菌菌种建立
第三步：工程菌构建 转化假单胞菌 筛选高表达、稳定遗传 的工程菌 获得原始菌种
广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） ������ 毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇
金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） 多发性硬化症rhuIFNβ
3、干扰素生产工艺路线（1）
第十三节
基因工程药物制造实例
干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌 的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗 肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重
要组成部分。
根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、 ω等4个类型。α型干扰素在分为α1b α2a α2b等亚型。
2、重组干扰素的临床应用
答：1.生物活性测定：2.理化性质测定：
3.蛋白质含量
5.杂质检测
4.蛋白质纯度分析
6.稳定性考查：
7.产品一致性的保证：
4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。
终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降
温至15℃以下。
检测：发酵液杂菌检查
4．菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min 离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量等。
3.3 干扰素的分离纯化工艺过程
菌体裂解、加絮凝剂和凝聚剂得粗干扰素 溶解粗干扰素
盐析沉淀与疏水层析
阴离子交换层析与浓缩
阳离子交换层析与浓缩
凝胶过滤层析
无菌过滤分装
3.4 质量控制标和要求
干扰素鉴别试验
干扰素效价测定
蛋白质含量，纯度测定，分子量
宿主残余蛋白、残余DNA
干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列
体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞
1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市
产量低：1g IFNα，需要3亿ml人血白细胞
来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵
潜在的血源性病毒污染的可能性
3、干扰素生产工艺路线（2）
人源转化细胞系培养生产工艺：
1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点：活性低，退出临床应用。
退火获的杂交质粒
转化大肠杆菌
1、基因工程假单胞菌菌种建立
第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)
制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成
测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。
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