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ssr筛选步骤3.4 微卫星DNA 富集文库的构建3.4.1 基因组DNA 的酶切基因组DNA 使用限制性内切酶Mse I 酶切，酶切体系如下：名称酶切体系对照体系ddH 2O 24 μL 23 μL 10 × 缓冲液3 μL 3 μL Mse I （10 U/μL ）1 μL 0 μL 基因组DNA （50 ng/μL ）总反应体积2 μL 30 μL4 μL 30 μL65℃孵化4 h 。
酶切产物使用1% 琼脂糖电泳检测酶切效果。
3.4.2连接反应使用Mse I 进行连接Mse I 接头序列为：5’-G ACG ATG AGT CCT GAG- 3’ 3’- TAC TCA GGA CTC AT- 5’ 连接体系如下：16℃过夜连接。
名称连接体系10 × 连接缓冲液3 μL ddH 2O4 μL Mse I 接头（10μM ）1 μL ATP （10mM ） 0.5 μL DNA 酶切产物21 μL T4 DNA Ligase 0.5 μL 总反应体积30 μL3.4.3 PCR扩增及产物回收Mse I 扩增引物Mpoo序列: 5’-G ATG AGT CCT GAG TAA - 3’按照如下反应体系：名称反应体系dd H2O 17.5 μL10×缓冲液2.5 μLdNTP (10 mM, each) 1.0 μLMgCl2 (25mM) 1.5 μLMse I 扩增引物(10 μM) 1 μL酶切连接产物1.5 μLTaq DNA聚合酶0.2 μL总反应体积25 μLPCR反应条件如下：94 ℃30 s，53 ℃1 min，72 ℃1 min，20个循环；72 ℃延伸10 min。
经1%琼脂糖电泳检测扩增产物。
扩增产物的回收：向上述PCR产物中加入2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积3 mol/L NaAc，混匀，-20℃放置40 min以上。
离心回收沉淀，70%乙醇洗涤，干燥后溶于5μL灭菌双蒸水中。
SSR引物的筛选步骤（1）利用琼脂糖凝胶电泳对引物可扩增性进行筛选通过反复摸索Tuber indicu m的PCR反应体系和扩增条件，确定以下程序进行扩增。
25µl反应体系：30 ng DNA样品，2.0 mM MgCl2，0.2 mM dNTP，0.1 µM引物，1.0U Taq DNA聚合酶，1 × PCR缓冲溶液。
扩增条件：94℃预变性2.5min，随后94℃30s，45℃～60℃（依引物的退火温度而定）30s，72℃30s，循环30～40次，最后在72℃延伸20 min。
（可根据自己的实验改变反应条件）利用以上扩增产条件，选取三个居群的三个体，对引物的可扩增性进行筛选，并经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
（2）利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对引物的多态性进行筛选试剂配制：8%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制（25ml）：15ml的去离子水H2O，5ml 的5×TBE，5ml 的40%（W/V）聚丙烯酰胺溶液，180ul的10%（W/V）过硫酸铵（APS），16 ul的TEM ED。
5×TBE的配制：54g的Tr is base，27.5g的硼酸，20ml0.5 mol/L的EDTA，最后定容至1L。
40%（W/V）聚丙烯酰胺的配制（100ml）：38.5g丙烯酰胺（Acryla mide），1.5g甲叉双丙烯酰胺（Bis-acryla mide），加100ml去离子水搅拌溶解，棕色瓶4℃保存。
10%（W/V）过硫酸铵（APS）的配制（20ml）：2gAPS加20ml去离子水后搅拌溶解，于4℃保存，可保存2周，超过期限会失去催化作用。
实验步骤：顺序安装聚丙烯酰胺凝胶电泳仪各部件，灌胶并凝聚2小时。
在电压105V，电流43mA条件下电泳3.5个小时，取下凝胶并进行以下步骤。
枣品种鉴定技术规程ssr分子标记法
粒子标记技术（SSR）是一种常用的枣品种鉴定方法，它基于
分子标记技术，通过检测植物基因组DNA中的特定序列，在
枣的品种鉴定中起到了重要作用。
SSR标记法的主要步骤包括：
1. DNA提取：从枣树的叶片、茎或果实中提取DNA。
2. SSR引物选择：选择适合枣品种鉴定的SSR引物，通常选
择在枣基因组中高度保守和多态性较高的位点。
3. PCR扩增：利用选择的SSR引物对提取的DNA进行PCR
扩增，以增加DNA的数量。
PCR扩增的条件包括温度、时间
和引物浓度等。
4. PCR产物分析：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，对PCR
扩增产物进行分析，根据不同的SSR位点在不同品种之间呈
现的多态性差异，判断枣的品种。
利用SSR分子标记法能够获得高度特异性和稳定的分子标记，可用于枣品种的鉴定、遗传多样性分析以及品种保护等方面。
但同时也需要注意该方法的操作技术要求较高，且需要相应的实验设备和试剂支持。
利用SSR标记筛选水稻富γ-氨基丁酸后代材料SSR标记是一种常用的分子标记技术，可以用来筛选水稻富含γ-氨基丁酸（GABA）的后代材料。
GABA是一种非常重要的生物活性物质，具有许多医疗和保健功能，如抗氧化、抗老化和抗糖尿病等。
培育富含GABA的水稻品种对于提高水稻的营养价值和经济效益具有重要意义。
为了利用SSR标记筛选富含GABA的水稻后代材料，我们首先需要了解水稻的基因组结构和GABA合成相关基因的位置。
然后，通过SSR技术测定水稻后代材料中的特定区域的基因多态性。
具体步骤如下：1. DNA提取：从水稻后代材料中提取DNA。
可以利用商业化的DNA提取试剂盒进行提取，遵循相应的操作步骤。
2. 设计引物：根据已知的水稻基因组序列和GABA合成相关基因的信息，设计能够特异性扩增目标基因区域的引物。
确保引物的特异性和合适的引物长度。
3. PCR扩增：将设计好的引物与提取出的DNA样品进行PCR扩增反应。
PCR反应体系和反应条件根据具体实验条件进行优化，确保扩增反应的特异性和效率。
4. 扩增产物分析：将PCR扩增产物进行电泳分析。
可以选择使用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
根据不同PCR产物的大小和浓度，选择合适的电泳条件。
5. 数据分析：根据电泳结果，分析每个样品在特定区域的扩增产物条带情况。
通过比对扩增产物的大小和浓度，筛选出富含GABA的后代材料。
通过以上步骤，我们可以筛选出富含GABA的水稻后代材料。
在筛选过程中，可以根据需要选择不同的引物和扩增条件，以提高筛选的准确性和效率。
也可以通过扩大样品数量和进行重复实验，进一步验证筛选结果的可靠性。
这种利用SSR标记筛选富含GABA的水稻后代材料的方法，可以为水稻育种提供重要的参考和指导，为培育高品质、高营养价值的水稻品种奠定基础。
SSR技术1. SSR 简介说明：简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，简单重复序(SSR)也称微卫星DNA ，其串联重复的核心序列为1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA) n 和(TG) n 每个微卫星DNA 的核心序列结构相同，重复单位数目10-60 个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR 反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR 的方法扩增出不同长度的PCR 产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
在真核生物中，存在许多2-5bp 简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR 扩增，揭示其多态性。
SSR具有以下一些优点：(l) 一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA 量少。
显然，在采用SSR 技术分析微卫星DNA 多态性时必须知道重复序列两端的DNA 序列的信息。
如不能直接从DNA 数据库查寻则首先必须对其进行测序。
SSR的分类：根据SSR 核心序列排列方式的不同，可分为 3 种类型：1）完全型(perfect) ，指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA 。
如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT ；2）不完全型(imperfect) ，指在SSR 的核心序列之间有 3 个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于 3 。
如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT ；3）复合型(compound) ，指2 个或 2 个以上的串联核心序列由 3 个或3 个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于 5 。
SSR引物筛选实验步骤一.CTAB法提取DNA1.取0.1g嫩叶于研钵中，加少量碳酸钙研磨成浆，加入800μL 65℃预热的CTAB，转移至离心管；2.将离心管置于65℃水浴锅中水浴1h,期间摇5次，混匀；3.取800μL氯仿∶异戊醇（24∶1）加入离心管中，上下颠倒10min,12000rpm离心15min；4.吸取上清液（600~700μL）转移至新的离心管，再加入1/10体积的NaAc（3mol/L）;5.加入等体积-20℃预冷无水乙醇（或异丙醇），轻摇，置于-20℃中10min;6.12000rpm离心10min后弃上清；7.清洗两次：加入500μL 75%乙醇，轻弹，离心5min,再倒出上清液8.清洗两次后晾干，加100μL ddH2O溶解（一般溶解一晚上）；9.溶解后测浓度。
二.8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1.PCR：测定DNA浓度后将其稀释至100-200（ng/μL）;配10μL PCR体系：4.6μL ddH2O、2.4μL Mix、2μL DNA模板、1μL引物（引物需稀释10倍；前后引物各0.5μL）PCR温度设置：94℃ 2 m94℃ 30s }50℃ 30s } 35cycles72℃ 30s }4℃ ∞PCR结束后将结果置于-4℃2.各溶液配置：（1）8%非变性聚丙烯酰胺凝胶母液:120ML:40% Acr 24mL2% Bis 13mL10×TBE 12mLddH2O 71mL（2）10×TBE：Tris 108g硼酸55gEDTA 7.44g超纯水定容至1L（3）10% AP:称取10g过硫酸铵，ddH2O溶解，定容至100mL （4）电泳缓冲液：1×TBE：取100mL 10×TBE稀释至1L（5）银染液：1g AgNO3加蒸馏水至1L（6）显影液：20g NaOH+0.4g无水Na2CO3+4mL甲醛，加蒸馏水至1L3.清洗玻璃板、胶条与梳子，擦干表面水分；用无水乙醇按一个方向擦拭玻璃板两遍后，将胶条置于大玻璃板底部，将小玻璃板整齐置于大玻璃板上，确保平整后用夹子固定两边及底部；4.制胶：45mL母液+45μL TEMED+450μL 10% AP搅拌后沿着玻璃板一侧匀速灌胶，保证无气泡，放梳子时留2-3mm在外面，注意别产生气泡；凝40min后缓缓拔出梳子；用1×TBE冲洗胶槽，冲洗后移去夹子和胶条，将玻璃板固定于电泳仪器上，在上下槽加入电泳缓冲液。
基于SSR标记的杨树新品种鉴定及核心引物筛选杨树是世界上最重要的经济林木之一，具有广泛的生态适应性和经济价值。
在杨树品种的鉴定工作中，SSR标记已成为重要的工具。
本文将介绍一种新品种的鉴定方法以及核心引物的筛选过程。
一、新品种的鉴定1. 样本收集：从繁殖基地随机采集目标品种和对照品种的嫩枝，放入冷藏箱中保存。
2. DNA提取：将被试和对照品种的嫩枝分别研磨成粉末状，然后按照基因组DNA提取试剂盒说明书的步骤提取DNA。
3. 选择SSR引物：根据目标品种和对照品种的已有的SSR基因组数据信息，选择适合的SSR引物，以提高PCR扩增的成功率。
4. PCR扩增：为每个SSR引物设计PCR反应体系，调整PCR扩增条件，通过PCR扩增获得DNA片段。
5. 电泳分离：将PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，检测PCR扩增结果，分析DNA样本间的差异。
6. 数据分析：根据分离出的电泳图，比对目标品种和对照品种的DNA条带，判断是否存在新品种的DNA序列。
二、核心引物的筛选为了方便大规模遗传多样性研究，我们筛选了一批实用的核心引物，提高了SSR标记的有效性，减少了化验成本。
具体筛选过程如下：1. 数据库搜索：在已有的杨树SSR标记数据库中搜索，获取所有已知的SSR引物信息。
2. 引物评价：根据引物评价标准，评价每个引物的扩增效率、多态性以及与目标基因组的匹配度。
3. 引物排列：将符合条件的引物按照其位点分布情况和扩增效率排序，使得每个引物间的间隔最大。
4. 引物测试：对挑选出的引物进行实验，获取比对结果，统计每个引物的多态性指数和PIC的值。
经过筛选，我们最终选择了30个核心引物，具有较高的扩增效率和多态性，适用于杨树遗传多样性研究和育种工作。
总之，SSR标记的鉴定和核心引物的筛选是杨树遗传多样性研究工作中的关键步骤，本文提供了一种可行的方法供参考。
SSR技术1. SSR简介说明：简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR 产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。
SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。
显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。
如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
SSR的分类：根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型：1）完全型(perfect)，指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA。
如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT；2）不完全型(imperfect)，指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3 。
如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT；3）复合型(compound) ，指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。
如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA 。
3.4 微卫星DNA 富集文库的构建3.4.1 基因组DNA 的酶切基因组DNA 使用限制性内切酶Mse I 酶切，酶切体系如下：名称 酶切体系 对照体系 ddH 2O 24 μL 23 μL 10 × 缓冲液 3 μL 3 μL Mse I （10 U/μL ） 1 μL 0 μL 基因组DNA （50 ng/μL ）总反应体积2 μL 30 μL4 μL 30 μL65℃孵化4 h 。
酶切产物使用1% 琼脂糖电泳检测酶切效果。
3.4.2连接反应使用Mse I 进行连接Mse I 接头序列为： 5’-G ACG ATG AGT CCT GAG- 3’ 3’- TAC TCA GGA CTC AT- 5’ 连接体系如下：16℃过夜连接。
名称 连接体系 10 × 连接缓冲液3 μL ddH 2O4 μL Mse I 接头（10μM ） 1 μL ATP （10mM ） 0.5 μL DNA 酶切产物 21 μL T4 DNA Ligase 0.5 μL 总反应体积30 μL3.4.3 PCR扩增及产物回收Mse I 扩增引物Mpoo序列: 5’-G ATG AGT CCT GAG TAA - 3’按照如下反应体系：名称反应体系dd H2O 17.5 μL10×缓冲液 2.5 μLdNTP (10 mM, each) 1.0 μLMgCl2 (25mM) 1.5 μLMse I 扩增引物(10 μM) 1 μL酶切连接产物 1.5 μLTaq DNA聚合酶0.2 μL总反应体积25 μLPCR反应条件如下：94 ℃30 s，53 ℃1 min，72 ℃1 min，20个循环；72 ℃延伸10 min。
经1%琼脂糖电泳检测扩增产物。
扩增产物的回收：向上述PCR产物中加入2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积3 mol/L NaAc，混匀，-20℃放置40 min以上。
离心回收沉淀，70%乙醇洗涤，干燥后溶于5μL灭菌双蒸水中。
3.4.4 含微卫星DNA序列片段的富集1.杂交SSR探针为生物素标记的Bio-（AC）15寡核苷酸：5’ bio- AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC 3’杂交体系为：名称反应体系20×SSC 21 μL10% SDS 0.7 μLPCR回收产物 3 μLSSR探针（100μM）0.8 μLddH2O 74.5 μL总反应体积100 μL混匀后95℃变性5 min，迅速降温至58 ℃孵育5 min，然后取出冷却到室温。
2.准备磁珠(1)充分摇匀Streptavidin MagneSphere®链霉亲和素磁珠（Promega），取摇匀后的100 μL溶液于1.5 mL离心管中；(2) 在磁珠中加入1 mL TEN100，清洗磁珠2 min，置磁性分离架中约1 min，至所有磁珠沉淀后，弃上清；(3) 重复上步2次，共洗涤3次；(4) 在清洗好的磁珠中加入40 μL TEN100，使其悬浮；3. 吸附将杂交混合物与磁珠悬浮液均匀混合，加入TEN100 300 μL。
放置室温30 min，间断轻柔混匀磁珠，以防沉淀。
4. 洗涤(1) 松弛性洗涤：将盛放吸附混合液的EP管放置于磁架上，1 min静置后弃上清。
加入TEN1000 400 μL，混匀5 min。
重复3次。
(2) 严谨性洗涤：加入400 μL严谨性洗涤液（配方：0.2×SSC，0.1% SDS），轻柔混匀5 min。
重复3次。
5. 洗脱(1). 第一次洗脱将清洗好的磁珠悬浮于50 μL TE缓冲液中；95℃变性5 min，磁力架快速分离上清（—20℃保存）；(2). 第二次洗脱向磁珠中加入NaOH（0.15 mM）12 μL；室温20 min洗脱，间断轻柔混匀；用磁力架快速分离上清；向上清中加入HCl（1mM）1.8 μL，再加入TE缓冲液36.2 μL，补灭菌ddH2O至50 μL。
(3). 第三次洗脱重复进行第一次洗脱。
6. 洗脱产物的沉淀回收使用核酸共沉剂沉淀回收洗脱产物（TakaRa），沉淀步骤如下：1.在第二次和第三次洗脱产物中加入1/10体积（5 ml）的 3 M CH3COONa（P H=5.2）；2.加入4 μL的DNAmate溶液，均匀混合；3.加入2.5倍体积（137.5 ml）的-20℃预冷无水乙醇，充分混匀；4.12, 000 rpm 4℃离心15 min；5.弃溶液，留白色沉淀；6.沉淀用—20℃预冷70%乙醇清洗后，真空干燥；7.干燥后，溶于20 μL灭菌双蒸水中，即得到富含微卫星DNA的单链短基因组DNA片段。
有关试剂的配制如下：20×SSC：3.0 mmol/L NaCl，0.3 mmol/L 柠檬酸钠，pH 7.0TEN100：10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 7.5 TEN1000：10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，1000 mmol/L NaCl，pH 7.5 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，pH=8.07．洗脱产物的PCR扩增及回收以上述洗脱回收产物单链基因组DNA 片段为模板，Mse I primer为引物，PCR体系及条件与3.4.3 相同，获得富含微卫星DNA序列的双链短基因组DNA 片段。
用PCR纯化试剂盒（TakaRa）对PCR产物（300- 800 bp的片段）进行回收纯化。
回收纯化具体步骤参考TakaRa（纯化试剂盒使用说明），纯化后使用1%琼脂糖凝胶检测回收效果。
3.4.5 PCR扩增片段的克隆1. 与pMD18-T Vector 的连接连接反应采用TaKaRa的pMD18-T Vector试剂盒，使DNA与载体的摩尔比为5:1，连接体系如下：名称反应体系ddH2O 3.5 μLpMD18-T Vector 0.5 μLInesrt DNA 1 μLLigation Solution I 5 μL总反应体积10 μL 16℃连接4 h。
2. 连接产物的沉淀回收溶于5 μL灭菌双蒸水中。
3. 电转化(可以选用化转)回收后的连接产物电转化E. coli Electro-Cells DH5α（TaKaRa），具体步骤如下：(1)感受态细胞(50 μL) 从-80℃取出后于冰中缓慢融化。
加入5μL上述连接回收产物，用枪头轻柔搅匀。
(2)将感受态细胞与连接产物的混合液转移至提前冰中预冷的电击小杯中。
(3)放入电转化仪（Eppendorf electroporator 2510）中，1500 V电压冲击后，迅速置于冰中冷却。
(4)向电击小杯中加入1 mL LB液体培养基，轻柔吹打混匀后转入1.5 mL离心管中。
(5)恒温培养箱37℃震荡培养1 h（170 rpm）。
(6)将已转化的感受态细胞涂布于氨苄抗性(100 g/mL) LB 平板培养基上。
(7)37℃倒置过夜培养。
(8)待克隆长出后，用灭菌牙签从平板上挑取单个菌落，分别接种于600 μLLB液体培养基（AMP+）中。
37℃，170 rpm振荡培养过夜。
(9)加入等体积的无菌80%甘油溶液（甘油终浓度为40%），混匀后-20℃冻藏。
3.4.6阳性克隆的筛选用单个菌落扩大培养后的菌液作为PCR反应的模板。
为确定微卫星DNA序列是否位于插入序列的中间位置，用3个单独的PCR反应检测选取的克隆，引物分别为载体上的测序引物M13（-47）、M13（-48）和寡核苷酸序列SSR M。
载体通用引物M（-47）和M（-48）为引物扩增以确定插入片段的大小，以M（-47）或M（-48）与SSR M为引物扩增以确定插入片段中SSR重复序列的有无及其插入片段中的位置。
引物序列为：SSR M：5’ CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA (A/G/T)(A/T/G/C) 3’M13（-48）：5’ AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3’M13（-47）：5’ CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’PCR反应体系如下：名称反应一反应二反应三ddH2O 18.5 μL18.5 μL18.5 μL10×Buffer 2.5 μL 2.5 μL 2.5 μL dNTPs（10 mM）0.5 μL 0.5 μL 0.5 μLMgCl2（25 mM） 1.5 μL 1.5 μL 1.5 μL M13（-48）（10 μM）0.5 μL- 0.5 μLM13（-47）（10 μM）0.5 μL0.5 μL- SSR M（10 μM）- 0.5 μL0.5 μLTaq DNA聚合酶0.2 μL0.2 μL0.2 μL 菌液 1 μL 1 μL 1 μL 总反应体积25 μL25 μL25 μLPCR反应程序如下：94 ℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃复性45 s，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
当用SSR M获得的PCR产物，且与另两个反应之一的产物长度明显不同时（相差大约200-400 bp），表明微卫星DNA序列在插入片段中间位置，将挑选出的克隆送交商业公司测序。
3.4.7 测序结果分析及微卫星DNA序列统计用Chromas软件观察测序峰图，分析测序结果，去掉载体序列和接头序列。
用SSRHunter软件进行微卫星DNA序列初步查找，查找标准如下：7或7个拷贝以上的2碱基重复序列，4或4个拷贝以上的3碱基重复序列，3或3个拷贝以上的4（或5）碱基重复序列，2或2个拷贝以上的6碱基重复序列。
对于查找到的重复序列再分别进行重复类型以及重复拷贝数统计。
3.4.8 微卫星引物的设计及筛选利用在线引物设计软件Primer 3 (/primer3/）设计引物，在微卫星DNA序列上下游20 bp以外的保守区域设计。
引物设计原则为：引物长度18-25 bp，预期PCR产物长度为100-500 bp；Tm值大于50℃，且上下游引物的Tm值相差不超过5℃；两个引物之间少于连续4个核苷酸的配对；GC含量50%-60%。
将所设计的引物送商业公司合成。
对所设计的微卫星DNA引物均进行PCR扩增及条件优化并选择具有多态的引物作为群体多态的引物。
优化条件主要针对Mg2+浓度及退火温度。
Mg2+浓度优化范围为1.0-2.5 mmol/L，退火温度优化范围为50-65℃。
PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；接94℃变性45 sec，最适复性温度下复性45 sec，72℃延伸1 min，共30个循环；之后72℃延伸10 min，4℃保存。
