【CN110178792A】一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法【专利】

[收稿日期]㊀2020-06-28[修回日期]㊀2020-09-15[基金项目]㊀国家自然科学基金项目(81670134);江苏省自然科学基金项目(SBK2020021780)[作者简介]㊀吴凡,硕士,研究方向为动脉粥样硬化,E-mail 为wufan9547@㊂通信作者唐朝君,博士,副研究员,硕士研究生导师,研究方向为血管疾病机制研究与转化,E-mail 为zjtang@㊂[文章编号]㊀1007-3949(2021)29-07-0579-06㊃实验研究㊃新型小鼠动脉粥样硬化消退模型的构建吴凡1,盛玉兰2,梁羽3,唐朝君2,4,5(1.苏州大学医学部剑桥-苏大基因组资源中心,2.苏州大学唐仲英血液学研究中心,3.苏州大学卫生与环境技术研究所,4.苏州市血栓与血管生物学重点实验室,5.江苏省血液学协同创新中心,江苏省苏州市215123)[关键词]㊀动脉粥样硬化消退;㊀血液扰动流;㊀动物模型;㊀部分颈动脉结扎[摘㊀要]㊀目的㊀动脉粥样硬化通常被认为是一种不断发展的病变,但斑块的消退提示动脉粥样硬化病变存在逆转的可能,因此建立一种高效且操作方便的小鼠动脉粥样硬化斑块消退模型对于阐明斑块消退的机制具有重要意义㊂方法㊀在ApoE -/-模型鼠中,首先进行三种类型的颈动脉结扎,诱导不同类型的血流形成颈动脉斑块㊂为了建立斑块消退模型,利用活结部分结扎小鼠左颈动脉分支造成扰动流,高脂饮食喂食2周诱导斑块形成后,打开活结,并恢复正常饮食㊂颈动脉血流超声检测追踪由结扎或斑块引起的血流变化;苏丹Ⅳ染色评估动脉粥样硬化病变区域;免疫荧光染色评估巨噬细胞浸润情况㊂结果㊀颈动脉部分结扎高脂饮食喂养2周后,扰动流模型诱导的动脉粥样硬化斑块面积最大㊂造模小鼠打开活结2周后,颈动脉血流恢复接近正常值;且可显著减少动脉粥样硬化斑块大小,同时斑块中巨噬细胞含量和血管腔内斑块面积也明显减少㊂结论㊀基于颈动脉结扎手术的新型小鼠动脉粥样硬化消退模型成功建立,利用该模型将帮助理解动脉粥样硬化消退的潜在机制㊂[中图分类号]㊀R363;R5[文献标识码]㊀AThe establishment of a novel model of atherosclerosis regression in ApoE -/-miceWU Fan 1,SHENG Yulan 2,LIANG Yu 3,TANG Chaojun 2,4,5(1.CAM-SU Genomic Resource Center ,2.Cyrus Tang Hematology Center ,3.Sanitation &Environment Technology Institute ,4.Suzhou Key Laboratory of Thrombosis and Vascular Biology ,5.Collaborative Innovation Center of Hematology of Jiangsu Province ,Soochow University ,Suzhou ,Jiangsu 215123,China )[KEY WORDS ]㊀atherosclerosis regression;㊀disturbed blood flow;㊀animal model;㊀partial carotid ligation[ABSTRACT ]㊀㊀Aim ㊀Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease,but the regression of plaques suggests the possibility of reversal of atherosclerotic disease.㊀Thus,the establishment of a model of atherosclerosis regression in mice is of great significance for elucidating the mechanism of plaque regression.㊀㊀Methods ㊀In ApoE -/-mice,three types of carotid ligation were performed to induce different types of blood flow.㊀To establish the regression model,partial carotid ligation with a slipknot was firstly used to induce disturbed flow.㊀After feeding on a high-fat diet for 2weeks,the slipknot was removed,and followed by a chow diet for two weeks.㊀The ultrasonic testing was performed to monitor the blood flow in real time caused afterligation or plaque formation;Sudan Ⅳstaining was used to assess atherosclerotic lesions;immuno-fluorescence staining with anti MOMA2was applied to examine monocyte-macrophage infiltration.㊀㊀Results ㊀Three types of ligation induced different types of blood flow.㊀The disturbed flow induced the largest atherosclerotic plaque area in ApoE -/-mice.㊀After restore of blood flow combined with chow diet,atherosclerotic plaques can be significantly reducedand reversed,and the macrophage infiltration also significantly decreased.㊀㊀Conclusion ㊀A novel atherosclerosis re-gression model in mice based on carotid ligation surgery was successfully constructed,which will help to understand the un-derlying mechanism of atherosclerosis regression.㊀㊀动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是一种好发于大㊁中等动脉以脂质蓄积和炎症为特征的血管壁慢性病变,其病变过程包括血管炎症㊁内皮损伤㊁血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)表型转化和迁移增殖㊁泡沫细胞形成㊁细胞死亡㊁脂质和胆固醇蓄积以及血栓形成等[1]㊂临床上通常利用各种抗动脉粥样硬化药物抑制斑块进展,但是很少有药物表现出显著诱导斑块消退的作用㊂据报道某些新一代他汀类药物可减少啮齿类动物的颈动脉斑块大小,但在人体中促成斑块减小的有效剂量限制了其临床应用[2-5]㊂尽管到目前为止进展有限,但人们仍在努力寻找可以逆转动脉粥样硬化病变的新型药物[2,6]㊂先前的研究表明,巨噬细胞和单核细胞浸润至动脉内皮下在动脉粥样硬化的发病机制和进程中起着至关重要的作用[7]㊂已知高脂血症和扰动流会促进白细胞向病灶处募集和迁移,从而导致内皮炎症促进动脉粥样硬化斑块发生[8]㊂相关遗传模型的建立如载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)和低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)基因敲除小鼠揭示了该过程的机制,这为开发抗动脉粥样硬化药物提供了有价值的工具[9-12]㊂但目前已报道的斑块消退动物模型较少,Reis等[9]利用ApoE-/-小鼠主动脉段移植模型来研究动脉粥样硬化病变的消退㊂另有报道利用遗传手段构建了用于斑块消退的模型,一种可逆转的高脂血症小鼠品系(LDLR-/-ApoB100/100Mttpfl/flMx1Cre+/+),可通过失活微粒体甘油三酯转移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTTP)抑制小鼠高胆固醇血症的发生[13]㊂此外,给ApoE-/-小鼠注射ApoA1[14]或miR-33抗体[15-16],可以迅速降低小鼠血液胆固醇水平㊂总之,这三个动脉粥样硬化斑块消退模型都是基于降低低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平的㊂与胆固醇相似,大量研究表明血液扰动流(dis-turbed flow,Db-flow)在动脉粥样硬化中具有促斑块形成的作用,而稳定的层流可保护前期内皮免受动脉粥样硬化刺激㊂尽管如此,层流对动脉粥样硬化消退的贡献仍有待阐明㊂为了确定层流是否可以调节动脉粥样硬化斑块的消退,本研究根据Nam 等[17]先前报道的小鼠部分颈动脉结扎(partial carotid ligation,PCL)模型提出了一种手术诱导的小鼠颈动脉斑块消退模型㊂该模型利用ApoE-/-小鼠PCL手术后高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导斑块形成,通过开结恢复颈动脉血流同时停止HFD而促使斑块消退㊂该斑块消退模型具备操作简易和观察期短的特点,有望成为未来心血管研究的有用工具㊂1㊀材料和方法1.1㊀实验动物野生型C57BL/6J小鼠和ApoE-/-(C57BL/6J 背景)小鼠购自南京大学模式动物研究中心㊂动脉粥样硬化消退模型中,小鼠喂食正常的食物8周成年后进行颈动脉结扎手术,之后改用含0.15%胆固醇和21%脂肪的高脂饮食喂养㊂将所有动物饲养在SPF级动物房条件下,保持恒温24ħ,湿度40%~70%和光照周期为12/12h的昼夜节律,并自由获取食物和水㊂苏州大学动物实验许可证为SYXK(苏)2017-0043,所有实验操作符合苏州大学动物使用指南㊂1.2㊀颈动脉结扎模型构建气体麻醉系统麻醉小鼠,剪开小鼠颈部皮肤暴露颈动脉,利用10-0规格医用结扎线进行颈动脉分支结扎手术㊂颈动脉结扎小鼠颈外动脉(external carotid artery,ECA)和甲状腺上动脉(superior thyroid artery,STA)两个分支构建缓速流模型(decreased flow,De-flow)(图1A)㊂扰动流模型(disturbed flow, Db-flow)参照Nam等[17]所述,结扎小鼠左颈动脉(left carotid artery,LCA)的颈外动脉㊁颈内动脉(in-ternal carotid artery,ICA)和枕动脉(occipital artery, OA),而保留甲状腺上动脉完整(图1B)㊂通过结扎颈动脉中的所有分支建立全扎模型(blocked flow, Bl-flow)模型(图1C)㊂右颈动脉(right carotid artery,RCA)作为假手术对照㊂进行颈动脉超声检查以检测是否成功构建模型,结束后将小鼠置于加热垫苏醒㊂1.3㊀En-face染色采用0.1%苏丹Ⅳ(S4261,Sigma-Aldrich)染液对颈动脉的动脉粥样硬化斑块进行染色㊂颈动脉固定后,70%乙醇中浸泡2min后放入0.1%苏丹Ⅳ中染色30min或过夜,用80%乙醇洗涤1min㊂然后将样品浸于PBS中,沿中线纵向切开,展平后用毛细针固定在黑石蜡盘中,体视显微镜(Olympus SZX16)进行图像采集㊂1.4㊀免疫荧光染色及定量分析组织固定后蔗糖脱水,OCT包埋及冰冻切片㊂使用大鼠抗小鼠MOMA-2(anti-monocyte/macrophage, MOMA-2)抗体(ab33451,Abcam)鉴别单核/巨噬细胞,DAPI(C1002,Beyotime)定位细胞核㊂荧光偶联的山羊抗大鼠二抗(ab150167,Abcam)染色单核/巨噬细胞㊂使用激光共聚焦显微镜拍照,通过FV10-ASW软件进行图像分析㊂根据荧光染色切片结果,血管斑块横截面积占比(%)=1-(血管残余内腔面积/内弹力板管腔面积)㊂1.5㊀统计学分析所有数据均至少有3次以上重复,每组数据均至少有3个样本㊂数据统计以xʃs表示㊂两组数据之间比较用Students t检验进行分析,多组数据分析使用单因素方差分析,数据用GraphPad Prism软件进行统计,当P<0.05被认为差异有统计学意义㊂2㊀结㊀果2.1㊀颈动脉结扎方式的改变造成不同的血流动力学改变血流动力学影响动脉粥样硬化的发生发展过程,2009年Nam等[17]成功利用部分颈动脉结扎(PCL)手术构建了扰动流诱导的动脉粥样硬化小鼠模型,但改变结扎方式造成的血流动力学改变和动脉粥样硬化斑块形成还不清楚㊂首先,结扎左颈动脉的两个分支导致血流减少构建缓速流模型(De-flow),超声血流频普显示与假手术组右颈动脉血流无差异,2周后血流减缓但相较于右颈动脉血流流速无明显差异(图1A)㊂结扎左颈动脉的三个分支导致血流紊乱构建扰动流模型(Db-flow),恢复2周后左颈动脉血流频普呈多峰形态,收缩期迅速达高峰,上升陡直,舒张期下降亦快,相比右颈动脉血流明显减缓并且出现逆向流,相较于右颈动脉血流减少67.5%(图1B)㊂全扎模型(Bl-flow)结扎左颈动脉全部分支,血流超声波形呈平直单峰型,峰值低,频带窄,相较于右颈动脉血流减少72.2%(图1C)㊂图1.PCL引起的不同血流类型导致血流速度下降(nȡ4)A为缓速流模型(De-flow)和对应的血流超声图像及统计数据;B为扰动流模型(Db-flow)和对应的血流超声图像及统计数据;C为全扎模型(Bl-flow)和对应的血流超声图像及统计数据㊂Figure1.PCL induced the decline of velocity of blood flow(nȡ4)2.2㊀扰动流模型促进ApoE -/-小鼠颈动脉斑块形成为进一步探究血流变化对高脂饮食喂养小鼠斑块形成的影响,三种血流模型在手术后进行高脂饮食喂养2周,所有小鼠安乐死并分离出颈动脉㊂苏丹Ⅳ染色可见所有小鼠均形成颈动脉粥样斑块;定量结果表明Db-flow 组斑块面积较其他两组更大,Db-flow 组斑块面积较De-flow 组增加65%,与Bl-flow 组相比增加88%(图2)㊂结果表明低速且振荡的扰动流可加重ApoE -/-小鼠高脂饮食诱导的斑块形成㊂图2.Db-flow 诱导ApoE -/-小鼠形成的斑块面积最大(n ȡ3)A 为苏丹Ⅳ染色观察ApoE -/-小鼠颈动脉的腔内动脉粥样硬化斑块;B 为三种模型小鼠染色斑块面积占左颈动脉总面积大小的统计图㊂Figure 2.Db-flow induced the largest plaque size in ApoE -/-mice (n ȡ3)2.3㊀基于扰动流模型的动脉粥样硬化消退模型建立小鼠动脉粥样硬化消退模型设计如图3A 所示,对照组喂食高脂饲料4周,斑块消退组在Db-flow 手术2周后喂食高脂饲料2周,之后释放左颈动脉的活结以恢复颈动脉血流,转为正常饲料喂养㊂高分辨率小动物超声监测部分颈动脉结扎手术前后的血流(红色曲线表示PCL 之后和活结释放之前的血流速度,蓝色曲线表示活结释放后的流速),结果显示解除部分颈动脉结扎(release partial carotid ligation,rPCL)后颈动脉血液流速增加,2周后血流速度恢复至原始流速的66%(图3B)㊂图3.动脉粥样硬化消退模型的构建(n ȡ8)A 为小鼠斑块消退模型的示意图,对照组为小鼠部分颈动脉结扎后高脂饮食喂养4周,消退组为在部分颈动脉结扎手术后高脂饮食喂养2周后解除结扎即rPCL,之后采用正常饮食喂养2周㊂B 为活结释放后,利用高分辨率小动物超声仪记录颈动脉血流速度㊂Figure 3.The construction of a model of atherosclerosis regression (n ȡ8)2.4㊀消退模型小鼠颈动脉斑块形成减少为检测血流恢复是否促成斑块消退,将ApoE -/-小鼠分为三组:PCL 2周组㊁PCL 4周组和rPCL 组㊂苏丹Ⅳ染色结果显示rPCL 组的斑块大小与PCL 后喂食高脂饮食4周组小鼠相比明显减少23%,而与PCL 后喂食高脂饮食2周组小鼠斑块总面积差异无显著性(图4A 和4B)㊂进而通过免疫荧光染色检测了颈动脉管腔内斑块区域的横截面积,结果发现与PCL 2周组和PCL 4周组相比,rPCL 组血管腔内斑块面积分别减少26%和33%(图4C 和图4D)㊂单核/巨噬细胞的积累对动脉粥样硬化斑块的进展至关重要㊂进一步通过单核/巨噬细胞抗体MOMA-2对LCA 斑块进行染色以定量巨噬细胞,结果显示,与PCL 2周组和PCL4周组相比,rPCL 组中观察到MOMA-2+单核/巨噬细胞显著下降(图4C 和图4E)㊂斑块巨噬细胞含量和斑块横截面积下降表明血流和饮食的恢复促进了动脉粥样硬化斑块的消退㊂图4.ApoE -/-小鼠的血流和饮食恢复减少动脉粥样硬化斑块形成A 为PCL 手术结合高脂喂食2周㊁4周和rPCL 组小鼠的颈动脉斑块苏丹Ⅳ染色㊂B 为LCA 中的斑块占LCA 总面积的占比统计图(n ȡ4)㊂C 为左颈动脉腔内斑块MOMA-2染色(红色);L 为管腔㊂D 为3~6个切片样品定量斑块面积相对于管腔面积的占比(n ȡ3)㊂E 为3~6个切片样品定量MOMA-2荧光面积相对于斑块总面积占比(n ȡ3)㊂Figure 4.Restore of blood flow and diet decreased the atherosclerotic plaque formation3㊀讨㊀论高脂血症是引起动脉粥样硬化斑块发生发展的必要因素[18]㊂当血浆LDLC 浓度降低,HDL 胆固醇逆向转运功能增强时,动脉粥样硬化斑块消退效果最佳㊂降脂治疗也是目前临床治疗消退斑块努力的方向[19]㊂为探索动脉粥样硬化的发生发展机制,广泛应用的动物模型包括ApoE 和LDLR 基因敲除小鼠具有非常重要的作用[2]㊂然而,关于斑块消退的研究遇到了相当大的阻力,现有的斑块消退动物模型难以得到广泛应用㊂因此,仍然需要更多可以应用于研究动脉粥样硬化消退的新方法和模型㊂在我们的研究中,基于ApoE -/-小鼠的动脉粥样硬化消退模型利用部分颈动脉结扎手术在短期诱导动脉粥样硬化斑块,恢复血流和正常饮食后即可促进动脉粥样硬化斑块消退㊂2018年Mueller 等[20]报道低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipo-protein receptor-related protein 1,LRP1)敲除能够加速动脉粥样硬化斑块消退㊂因此,利用本研究的斑块消退模型结合降脂或者LRP1阻断抗体结合或能在促进动脉粥样硬化斑块消退方面取得更显著的效果㊂此外,在将来的研究中,如何在同一实验动物个体内实现实时精确定量追踪斑块的消退也是该领域需要重点攻克的难点㊂除了已知的动脉粥样硬化的危险因素(包括高脂血症㊁高血压或糖尿病)导致内皮功能障碍以外[21-23],血液扰动流也被认为是诱导动脉粥样硬化斑块发生的重要因素㊂已知血液扰动流主要存在于血管弯曲和分岔处,血液剪切应力较低且紊乱,抑制内皮细胞一氧化氮合酶产生,上调内皮炎症因子表达,促进动脉粥样硬化的发生㊂相反,稳定的层流起到动脉粥样硬化保护作用[8,24],因此剪切应力在动脉粥样硬化的发病机制中起重要作用㊂本研究对比不同血流速度变化对动脉粥样硬化斑块形成的影响,与之一致的是,发现只有血流低速且振荡才能导致更加严重的动脉粥样硬化病变,而层流则发挥保护血管功能的作用㊂鉴于此,PCL模型经过改进后成功构建颈动脉斑块消退小鼠模型㊂与已有研究报道的消退模型相比,该模型技术要求更低,更重要的是该模型可以使动脉粥样硬化斑块在1个月内开始消退,为研究动脉粥样硬化消退的机制和介入研究提供了有效的途径㊂基于PCL的动脉粥样硬化消退模型可应用于研究基因敲除或转基因小鼠研究疾病进展与机制㊂通过与最先进的彩色多普勒超声结合,该模型有望增进对动脉粥样硬化中血液动力学调节作用的理解,参与相关药物的研发与创新㊂该模型导致斑块消退的机制如何,是否与血管细胞和血液细胞的炎性反应相关,需要进一步的实验探讨㊂综上,本研究中紊乱的血液扰动流在动脉粥样硬化斑块的发生和进展中起着至关重要的作用㊂因此,本研究建立了一种基于扰动流诱发动脉粥样硬化的新型消退模型㊂该模型具有更低的介入性和较低的技术要求,并且可以短期内促进动脉粥样硬化斑块消退,将为动脉粥样硬化的机制研究提供新的手段㊂[参考文献][1]赵战芝,姜志胜.我国动脉粥样硬化基础研究几个热点领域的新进展[J].中国动脉硬化杂志,2019,27(8):645-654. 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颈动脉斑块破裂动物模型的建立韩学府;王丽丽;王健;陈茜;杨笛【摘要】目的：建立颈动脉斑块破裂的动物模型。

方法36只载脂蛋白E（ApoE）缺陷小鼠，随机分为未结扎组、单纯结扎组、结扎套管2天组、结扎套管4天组、结扎套管7天组和假手术组各6只，除未结扎组外各组结扎其左侧颈总动脉并饲以普通饮食。

假手术组小鼠套管后即刻取下套管。

结扎套管2天组、结扎套管4天组、结扎套管7天组于结扎处近段放置套管，分别于套管后第2、4和7天剪取结扎侧颈总动脉。

血管切片，行HE、Masson胶原染色，计算病变血管管腔狭窄率、管壁厚度、单位中膜面积细胞数和单位内膜面积胶原含量；应用免疫组化法检测平滑肌α肌动蛋白（αSMC-actin）、血管假性血友病因子（ vWF）表达。

结果单纯结扎组结扎动脉管腔内膜增生明显，管腔狭窄，斑块内散在分布大量泡沫细胞，斑块表面可看到明显纤维帽形成。

未结扎组、单纯结扎组管腔狭窄率分别为0．10％±0．018％、0．88％±0．033％，中膜厚度分别为（0．44±0．02）、（0．70±0．04）mm，单位中膜面积细胞数分别为（16．5±1．03）、（12．7±1．07）个，两组比较，P均＜0．05。

单纯结扎组、结扎套管2天组、结扎套管4天组、结扎套管7天组和假手术组斑块破裂分别为0、5、4、6、0只；单位斑块面积内胶原含量分别为0．47±0．04、0．09±0．03、0．12±0．04、0．16±0．08、0．41±0．07，单纯结扎组与套管各组比较，P均＜0．05。

单纯结扎组动脉斑块内部和纤维帽处均可检测到αSMC-actin表达，但纤维帽处表达更明显；斑块破裂后局部仍有表达，但纤维帽处表达减弱。

vWF在部分斑块内表达，在斑块破裂处无表达。

结论通过结扎并套管成功制作了小鼠颈动脉斑块破裂模型。

一种快速建立大鼠动脉粥样硬化模型的方法作者：薛仪强黄石安来源：《中国医学创新》2014年第29期【摘要】目的：探讨一种简单有效的大鼠动脉粥样硬化模型。

方法：将健康雄性SD大鼠40只按照随机数字表法分为高脂维生素组、高脂组、维生素D组、对照组各10只。

4周后检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、白介素1（IL-1）、白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和C反应蛋白（CRP），并分离各组大鼠的主动脉、肝脏和心脏组织做HE染色。

结果：对照组和维生素D 组的大鼠体重一直处于增加状态，对照组的体重增加幅度明显高于其他各组（P0.05）。

各组间大鼠心脏与体重比有明显差异（P【关键词】动脉粥样硬化；模型；高脂；维生素D；大鼠动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是危害人类健康最严重的的疾病之一，但是其发病机制尚未完全明确，因此，建立可靠有效的动物模型对探明动脉粥样硬化的病因、发病机制、防治和药物的研发有非常重要的意义[1]。

目前已经采用的模型动物包括家兔、鼠、小型猪、猴和鸟类，所采用的方法包括脂质浸润、内膜损伤、转基因和免疫刺激等，其中大鼠具有体型适中、抵抗力强、食性与人接近、与人类基因高度同源等特点，是较为理想的动脉粥样硬化模型的动物[2-10]。

有研究者运用维生素D或维生素D联合高脂饲料可以看到大鼠动脉管壁中有早期斑块，而每个研究者运用的维生素D的剂量和高脂饲料的配方不同[11-16]。

本研究在总结了其他研究者的实验方法的基础上，对本试验进行了改进，经过4周建立了较为成功的大鼠动脉粥样硬化模型。

1 材料与方法1.1 实验动物健康SD雄性大鼠，6～8周，体重160～180 g，由广东省实验动物中心提供。

1.2 模型建立将40只SD大鼠按照随机数字表法分为4组，每组10只。

高脂维生素组在喂养高脂饲料（1%胆固醇、0.35%胆酸、5%猪油、0.61%丙基硫氧嘧啶、93.04%基础饲料，由广东省实验动物中心提供）每只每天20 g的基础上腹腔注射维生素D3（60万U/kg，购买于上海通用药业）分3 d连续注射；高脂组给予同等剂量高脂饲料喂养；维生素D组在给予同等剂量基础饲料的基础上腹腔注射维生素D3（60万U/kg）分3 d连续注射；而对照组仅给予同等剂量基础饲料喂养。

专利名称：一种Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法及其应用
专利类型：发明专利
发明人：郑前前,梁银明,卢燎勋,晁天柱,张黎琛,黄蓉
申请号：CN202010537546.6
申请日：20200612
公开号：CN111778278A
公开日：
20201016
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法及其应用。

本发明将Slfn4基因敲除通过CRISPR‑Cas9系统引入ApoE基因缺失遗传背景的动脉粥样硬化小鼠，回交和杂交后进行基因型筛选，获得了双基因缺失的纯合子模型小鼠ApoESlfn4。

Slfn4缺失动脉粥样硬化模型小鼠(ApoESlfn4)较ApoE小鼠动脉粥样硬化斑块显著减少，症状显著减轻，表明Slfn4基因具有促进主动脉粥样硬化斑块形成的作用。

针对Slfn4上述功能，Slfn4可以作为药物靶标筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物；Slfn4抑制剂能够用于制备治疗动脉粥样硬化疾病的药物。

申请人：新乡医学院
地址：453003 河南省新乡市金穗大道东段
国籍：CN
代理机构：郑州睿信知识产权代理有限公司
代理人：牛爱周
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010360359.5(22)申请日 2020.04.30(71)申请人 吉林大学地址 130012 吉林省长春市前进大街2699号(72)发明人 冯海华　金美玉　阚兴池　沈冰玉　覃海燕　王齐　严斯如　李金霞　(74)专利代理机构 长春市恒誉专利代理事务所(普通合伙) 22212代理人 李荣武(51)Int.Cl.A01K 67/02(2006.01)(54)发明名称一种利用LPS和泰洛沙泊构建小鼠动脉粥样硬化模型的方法(57)摘要本发明公开了一种利用LPS和泰洛沙泊构建小鼠动脉粥样硬化模型的方法。

本发明首次利用LPS和泰洛沙泊长期诱导小鼠动脉粥样硬化模型。

通过实验证实，在该模型小鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)的含量均显著增高，并在小鼠主动脉瓣处形成动脉粥样硬化斑块。

本发明通过利用LPS和泰洛沙泊成功构建了小鼠动脉粥样硬化模型，该发明实验成本低，成模周期短，成模率高，且稳定性好。

本发明为研究动脉粥样硬化的病因以及筛选治疗动脉粥样硬化的药物提供了更加有效的经济模型。

权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 111387142 A 2020.07.10C N 111387142A1.一种利用LPS和泰洛沙泊构建小鼠动脉粥样硬化模型的方法，其特征在于：利用LPS 和泰洛沙泊联合使用构建小鼠动脉粥样硬化模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠为雄性C57BL/6小鼠。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用50μg的LPS通过腹腔注射的方式注入小鼠体内。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，LPS的诱导时间为每周一次，持续8周。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用500mg/kg的泰洛沙泊通过腹腔注射的方式注入小鼠体内。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910375476.6(22)申请日 2019.05.07(71)申请人 哈尔滨医科大学地址 150081 黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路157号(72)发明人 于波　田进伟　王雪羽　郭守利　田江天　符亚红　(74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司 11139代理人 孙皓晨　马鑫(51)Int.Cl.A01K 67/027(2006.01)(54)发明名称一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法(57)摘要本发明公开了一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法。

该方法是通过杂交的方法获得具有原纤蛋白1(Fibrillin -1，Fbn1)基因杂合点突变的低密度脂蛋白受体基因(LDLR )敲除小鼠。

本发明首次将Fbn1C1039G +/-点突变引入LDLR -/-小鼠基因组，结合了两种基因型的特点，方法简单易行，能形成具有大脂质核心、大量的炎症细胞、典型薄纤维帽、丰富的新生血管和斑块内出血、血管外向重构等特点的易损斑块，且能模型上观察到类似于人的斑块破裂等导致急性心脑血管事件的发生。

其成模率高，可重复性好，为药物研究、器械耗材改进提供良好的动物基础，为探索动脉粥样硬化机制提供了良好平台。

权利要求书1页 说明书5页 附图4页CN 110178792 A 2019.08.30C N 110178792A1.一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法，其特征在于，通过杂交的方法获得具有原纤蛋白1(Fibrillin -1，Fbn1)基因杂合点突变的低密度脂蛋白受体基因(LDLR)敲除小鼠。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的原纤蛋白1(Fibrillin -1)基因杂合点突变是指Fbn1C1039G+/-。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将Fbn1基因杂合点突变鼠Fbn1C1039G+/-与低密度脂蛋白受体基因敲除(LDLR -/-)小鼠杂交，获得F1代鼠，F1代鼠的基因型为Fbn1C1039G+/+LDLR +/-或Fbn1C1039G+/-LDLR +/-；(2)选择基因型为Fbn1C1039G+/-LDLR +/-的F1代鼠与LDLR -/-小鼠杂交，获得F2代，F2代基因型为Fbn1C1039G+/-LDLR -/-、Fbn1C1039G+/-LDLR +/-、Fbn1C1039G+/+LDLR +/-或Fbn1C1039G+/+LDLR -/-；(3)选择F2代鼠中基因型为Fbn1C1039G+/-LDLR -/-的小鼠经高脂饲料喂养后，即为动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型。

关于动脉粥样硬化斑块破裂的动物模型
许金鹏;王绿娅
【期刊名称】《中国动脉硬化杂志》
【年(卷),期】2004(12)4
【总页数】3页(P440-440)
【关键词】动脉粥样硬化;斑块破裂;动物模型;药物治疗
【作者】许金鹏;王绿娅
【作者单位】首都医科大学附属安贞医院心内科;首都医科大学附属安贞医院动脉粥样硬化研究室
【正文语种】中文
【中图分类】R543.5
【相关文献】
1.动物模型在研究动脉粥样硬化斑块破裂方面的价值 [J], 由倍安
2.破裂与非破裂颈动脉粥样硬化斑块周围血流动力学的MRI分析 [J], 荆利娜;高培毅;林燕;隋滨滨;薛静;秦海强;王辉;沈宓
3.Th17细胞对动脉粥样硬化斑块易损性和斑块破裂的影响研究 [J], 杨玉媛;刘有旺;李腾;张晓东;姚梦园;宋泮泮;李雅林
4.动脉粥样硬化斑块磁共振成像动物模型 [J], 叶鹏飞;郭应坤;张怡;沈梦婷;李湘;陈林;徐婷;文凌仪
5.冠状动脉粥样硬化斑块组成成分与斑块破裂的关系 [J], 郭爱桃;韦立新;李向红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。