第23卷第6期2007年12月
德州学院学报
Jour nal of Dezhou University Vol.23,No.6
Dec.,2007
碳源、氮源及其比例对香菇液体深层培养的影响
刘成荣
(福建莆田学院环境与生命科学系,福建莆田 351100)
摘 要:通过摇瓶培养,研究香菇液体深层培养最适发酵培养时间、最适碳源、最适氮源及最佳碳源与氮源质量配比.结果表明最适发酵培养时间为168h,所得菌丝体干重达0 399g/50mL 菌液,最适碳源为蔗糖,菌丝体干重达到0 396g /50mL 菌液;最适氮源为牛肉膏,菌丝干重达到0 421g/50mL 菌液,并通过正交实验筛选出最佳碳源与氮源质量配比为:W (蔗糖):W(牛肉膏):W(麦芽糖)=2 5:1:1.
关键词:香菇;碳源;氮源;摇瓶培养;生物量;正交实验
中图分类号:R282 文献标识码:A 文章编号:1004-9444(2007)06-0058-03
收稿日期:2007-08-29;修回日期:2007-10-20
作者简介:刘成荣(1964-),男,福建莆田人,副教授,学士,主要从事食、药用菌生物技术方面的研究.
香菇(Lentinula edodes)又名香蕈,属于担子菌纲,伞菌目,蘑菇科.香菇是一种营养价值很高的食用菌,不仅味道鲜美,香味郁人,而且香菇多糖更是具有一定保健功能.香菇多糖是香菇经过发酵培养及分离纯化得到的胞外多糖,它具有活化巨噬细胞、刺激产生抗体、提高人体免疫力、抗衰老、降血糖,特别是对抗肿癌有显著效果[1-5].近几年,由于生产原料、设备、燃料、水电等价格的不断提高,造成香菇生产的成本上涨,致使经济效益下降,影响香菇生产的发展.因此研究和探讨如何提高生产数量和质量,特别是对菌丝生长营养条件具有重要意义.虽然人们对它做过一些研究[6-9]
,但实验材料各人不尽相同.因此有必要对香菇液态深层发酵进行研究,以期短时间内大量生产菌丝体.
1 材料与方法
1.1 材料
1)主要仪器
电子天平ZDX-35BI 型座式自动电热压力蒸汽灭菌器SH K-99-11型回旋振荡器PYX-250S -A 型生化培养箱H Y-5型回旋振荡器DH G-9031型电热恒温干燥箱、洁净工作台(上海淀山湖净化设备厂制造)
2)菌种来源
香菇Cr02(本单位保存)
3)培养基
(1)马铃薯葡萄糖培养基(PDA)固体培养基.马铃薯200g 、葡萄糖20g 、琼脂15~20g 、水1000mL,配制方法:将马铃薯去皮、切成块、煮沸30min,用4层沙布过滤,取滤液加糖及琼脂融化后加水补至1000m L,121 灭菌20m in.冷却摆斜面后接种,26度培养长满试管即为母种.
(2)液体种子培养基.马铃薯20%、葡萄糖2%酵母膏0 1%、磷酸二氢钾0 2%、硫酸镁0 1%、维生素B10 01%、PH 值6 5.装液量为250m L 、三角瓶装50mL,121度灭菌20min,冷却后从斜面母种挑取绿豆大小的菌块接入液体种子培养基,26 160r/min 培养168h 即为种子.
(3)基础培养基.磷酸二氢钾0 1%、硫酸镁0 1%、维生素B10 01%PH 值自然.1.2实验方法
1)最适发酵培养时间确定.在液体种子培养基中接入种子后,分别在培养的第96h 、120h 、144h 168h 、192h 各取3瓶测定其生物量.2)最适碳源实验.在基础培养基中以0 3%牛肉膏为氮源,碳源分别为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、果糖,用量各为2 5%,其他成分同基础培养基.
3)最适氮源试验.在基础培养基中以2 5%葡萄糖为碳源,氮源分别为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵,甘氨酸,用量各为2 5%.其他成分同
基础培养基.以上各实验的接种量均为15%,培养温度26 ,摇瓶转速160r/min,培养168h,各处理3次重复.
4)正交试验[10]
利用实验得到的最适碳源与最适氮源之间通过正交实验找出最适的碳源氮源质量比组合,正交实验的因素和水平(见表1).
表1 正交试验的因素和水平
水平
因素
蔗糖(%)牛肉膏(%)麦芽糖(%) 1110.5
2 2.5 2.51
3 3.5 3.5 1.5
5)生物量的测定方法
取发酵液用滤纸过滤后,用蒸溜水冲洗几次,在电热恒温干燥箱中60 烘干至恒重,最后用电子天平称重,文中以下生物量的实验数据均为3次重复实验的平均值.
2 结果与分析
2.1 最适发酵培养时间试验
菌体的生长经过延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段.当进入稳定期时,产量最大,其试验结果见图1.从图1中可得出培养168h时所得菌丝干菌最大,所得菌丝体干重达0 399g(干重)/50mL 菌液.
菌丝干重(g/50mL )
图1 发酵培养时间对菌丝体生长的影响
注:横坐标为培养时间(h),纵坐标为菌丝干重(g)
2.2 最佳碳源试验
碳源营养是香菇菌丝体生长所必需的
件、是菌丝生长的物质和能量基础,但是菌丝体对不同碳源利用效果不同(见表2).可看出香菇菌丝体单糖、双糖和多糖均能利用,但利用程度不同,其中以蔗糖最好,所得菌丝(干)最大,达到0 396菌丝干重(g/50mL).
表2 不同碳源对香菇菌丝体生长影响
碳源名称葡萄糖麦芽糖蔗糖淀粉乳糖果糖菌丝干重
(g/50mL)
0.2690.3710.3960.0630.2330.315
2.3 最佳氮源试验
氮素是细胞生长和生殖所必须的大量的营养物质.同时也是酶类、核酸、蛋白质等重要组成部分.所以氮源营养物质能直接影响菌丝体的生长状况(见表3).表3结果说明香菇菌丝体在以牛肉膏为氮源制成的培养基上所得菌丝干重最大,达到0421菌丝干重(g/50mL).而以硫酸铵或硝酸铵为氮源的几乎不生长.
表3 不同氮源营养对香菇菌丝体生长的影响
氮源名称牛肉膏蛋白胨酵母膏硫酸铵硝酸铵甘氨酸菌丝干重
(g/50m l)
0.4210.1830.3610.0200.030.086
2.4 最佳碳源和氮源的最适配比试验
不同碳源、氮源影响香菇菌丝体生长,培养基中营养物质之间的不同配比也直接影响菌丝体生长(见表4).最适碳、氮源质量配比为:W(蔗糖):W (牛肉膏):W(麦芽糖)=2.5:1:1
表4 正交实验结果及数据分析
59
第6期 刘成荣:碳源、氮源及其比例对香菇液体深层培养的影响
3 小结
从上述的研究结果表明,香菇菌丝体对不同碳源和氮源物质均可以利用,但利用效果不同,菌丝体的同化和吸收相差较大,其中菌丝体对蔗糖利用最好.在氮源中对牛肉膏利用最好,最适发酵培养时间为168h,最佳碳源与氮源质量配比为:W(蔗糖): W(牛肉膏):W(麦芽糖)=2.5:1:1.
参考文献:
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Influence on Submerged Culture of Lentinula Edods
in Carbon-nitrogen and Their Ratio
LIU Cheng-rong
(Departm ent of Envirom ental and Science,Putian U niversity,Putian Fujian351100,China)
Abstract:T hrough flask culture,research Lentinula edods subm erg ed culture optimum fermentation time, the optim um carbon,nitro gen and optimum best quality carbo n and nitr ogen ratio.Results sho w ed that the o ptimal incubation time for168hours,fr om m ycelium0.399g(dry w eig ht)/50m l bacilli,the opt-i m um carbo n sug ar,dry mycelium r each0.396g/50m l bacilli;For optimum nitrogen beef ex tr act,dry w eight o f mycelium reach0.421g/50m l bacilli,and the o rtho gonal experimental screening the best quality carbon and nitrogen ratio:W(sucrose):W(beef ex tract):W(maltose)= 2.5:1:1.
Key words:Lentinula edods;carbo n;nitro gen;flask-culture;Biomass;orthogo nal ex periment
60德州学院学报 第23卷
35、下列营养物质,既含有碳源、氮源,又含有生长因子的是： 35、下列营养物质，既含有碳源、氮源，又含有生长因子的是: A(牛肉膏 B(生物素 C(蛋白胨 D(酵母粉 36、下列哪种细胞不具有癌变特点，不可以在培养条件下无限传代下去: A(原代细胞 B(细胞株 C(细胞系 D(胚胎细胞 37(以下各项说法中，不正确的是 ( ) 选蛋白质功能项 A RNA聚合酶参与DNA的复制 B 胰岛素调节血糖浓度 C 干扰素与抗原结合 D 固氮酶参与化能合成作用 38(下列关于环境污染的叙述中正确的是 ( ) A(环境污染是生物多样性面临威胁的原因之一 B(水中N、P、K等植物必需矿质元素的含量越多对水生植物生长越有利 C(固体废弃物是没有使用价值的污染源 D(环境污染是造成多基因遗传病发病率升高的原因之一 39(下列各项中是有丝分裂和减数分裂共有的特点的是( ) A(出现纺锤丝 B.染色体缩短变粗 C.着丝点分裂 D.非同源染色体自由组合 40(在基因工程中，作为基因运输工具的运载体，必须具备的条件有 ( ) A(能够在宿主细胞中复制，并稳定地保存 B(具有多个限制酶切点 C(必须是细菌的质粒或噬菌体 D(具有某些标记基因 41.下列结构在光下可产生ATP的是 A.细胞质基质 B.突触后膜 C.叶绿体的类囊体 D.线粒体的内膜 42. 淋巴细胞受某种抗原刺激后所产生的抗体 ( ) A(其化学本质是蛋白质 B(起非特异性免疫作用 C(是针对各种抗原的 D(能在体内存留 43.用氰化物抑制离体肌肉的细胞呼吸后，肌肉在一定时间内遇刺激仍能收缩，此时收缩的能量来自 A.外界的刺激 B.乳酸 C.磷酸肌酸 D.三磷酸腺苷 44.下列各项所进行的细胞分裂，不出现同源染色体配对现象的有
6 培养基 1.培养基概念？常用培养的基本要求是什么？ 答：概念：是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。 基本要求：必须含有供细胞生长繁殖和合成细胞成分的原料；满足产物生成的需要；能够维持一定的pH 条件；来源丰富、价格低廉、质量稳定等。 2、培养基是由哪些成分组成？这些成分的来源是什么（尤其是碳源和氮源）？各成分的作用是什么？在应用天然碳源和氮源时应注意什么问题？答：培养基各成分的来源及作用如下
在应用天然碳源和氮源时应注意的问题： ①不同菌种能够利用的碳源/氮源往往不同，同一个菌种对不同碳源/ 氮源的利用 速度也是不同的，一般单糖的利用速度要比双糖和多糖快，所以应根据菌种的种类和生长特性选择不同的碳源/氮源。
②碳、氮源直接的利用速度具有密切关系，各种糖的代谢速度不同，氨及铵盐的利用 速度也随之改变，所以应根据两者间的代谢速度关系投放的量。 ③碳源和氮源之间的比例能够直接影响微生物的生长和发酵产物的积累，在生产不同 阶段应根据菌体的不同代谢阶段通过控制碳氮源的比例来满足菌体的大量繁殖同时又能大量形成产物。 ④天然碳源/ 氮源的质量要求保证全营养成分的均衡，不能因地域性而导致天然碳 源/氮源中某些营养成分（蛋白质、多肽、氨基酸、维生素、微量元素等物质）的先天缺失或不足，进而影响微生物的发酵产率。 3.天然、合成和半合成培养基各有哪些应用？举例。 答：（1）天然培养基，所用原料是一些天然动植物产物，其化学成分不清楚或化学成份不恒定，如牛肉膏蛋白胨培养基A（广泛用于细菌培养）、麦芽汁培养基B （啤酒发酵），其特点是营养丰富，价格低廉，适合于生产。 （2）合成培养基，由化学成分已知的试剂配制的，各成分的量都确切知道的培养基，如培养放线菌的高氏一号培养基、培养真菌的察氏培养基，这种培养基成分明确、实验的重复性好，但配置较繁琐、培养的微生物生长较慢、价格较高，适用于实验室进行微生物营养、代谢、生理生化、遗传育种、菌种鉴定和生物测定等定量要求较高的研究工作，不适于大规模的工业生产。 （3）半合成培养基，由部分天然的有机物作碳源、氮源和生长因子，然后加入适量的化学药品配制而成的半合成培养基，这种培养基在生产和实验中使用较多。如培养真菌用的马铃薯蔗糖培养基，和LB 培养基（一般用于基因克隆中的大肠杆菌培养）。这种培养基配置方便、微生物生长良好，实验室和发酵生产用的大多数培养基属于半合成培养基。 4.简述培养基的类型和作用、孢子培养基、种子培养基和发酵培养基区别。说明理由。答：培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类。 （1）按培养基的组成成分，有合成培养基和天然培养基。合成培养基多用于研究和育种；天然培养基多用于大规模的工业生产。
§1 微生物的营养要求P75 营养：微生物摄取和利用营养物质的过程。 营养物质：能满足微生物生长、繁殖和进行各种生理活动需要的物质。 微生物细胞培养收集湿菌体 烘干至恒重 干细胞灰分 无机物（盐） 有机物 蛋白质、糖、脂类、核酸、 维生素等及其降解物 分析方法：课本P79水分：70－90％离心、过滤、洗涤高温烘干105℃；低温真空干燥；红外线快速烘干。550℃焚烧 一、微生物细胞 的化学组分 2.细胞化合物的组成： 糖类、脂类、蛋白质、水、无机盐、生长因子、核酸 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” 3.化学元素组成： 主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁 微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” 4.微生物细胞的化学组分特点 (1)、不同的微生物细胞化学组分不同 （2）、同一种微生物在不同的生长阶段，其化学组分也有差异 二、营养物质及其生理功能 P76 1.根据营养物质在机体中的生理功能不同进行分类 五大类（武大）：碳源、氮源、水、无机盐、生长因子 六大类（周德庆）:碳源、氮源、水、无机盐、生长因子、能源 1、碳源(carbon source) 为微生物提供碳素来源的物质。 1、功能 （1、构成微生物细胞物质，如糖、蛋白质、核酸等
（2、形成代谢产物，如酒精、乳酸等 （3、提供生命活动的能源 2、可作碳源的物质（P80表4－2） 糖类，蛋白质，有机酸，醇类，脂类，烃，CO2，碳酸盐等 碳源谱 必须利用有机碳源无机碳源为（唯一）主要碳源 自养微生物 异养微生物 最适碳源糖类优于其它化合物 单糖优于双糖、多糖 己糖优于戊糖 葡萄糖、果糖优于其他己糖 同一微生物对不同碳源的利用差别－速效碳源和迟效碳源 如葡萄糖和半乳糖同时存在于培养基中时，大肠杆菌先利用葡萄糖（速效碳源），再利用半乳糖（迟效碳源） 不同微生物的碳源谱相差很大 双功能营养物异养微生物的碳源兼作能源 2、氮源(nitrogin source) 为微生物提供氮素来源的物质。 1、功能 （1、构成微生物含氮物质，如蛋白质、核酸等 （2、形成代谢产物，如谷氨酸等 (3、一般不做能源 2、可作氮源的物质（P81表4－3） 蛋白质及其降解物（胨、肽、氨基酸）、硝酸盐、氨盐、N2、尿素、嘌呤、嘧啶、氰化物等 3、异养微生物氮的利用顺序 C.H.O.N> C.H.O.N.x >N.H > N.O 培养基中最常用的有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏 3、速效氮源和迟效氮源 实例：土霉素发酵生产中添加的玉米浆和花生饼粉 玉米浆：以较易吸收的蛋白质降解产物形式存在，易被利用（速效氮源） 花生饼粉：以大分子蛋白质形式存在，不易被利用（迟效氮源） 发酵生产中的作用不同：前者有利于菌体生长，后者有利于代谢产物形成保持适当的比例，协调菌体生长期和产物形成期，提高土霉素的产量 4、生理酸性盐与生理碱性盐： 以(NH4)2SO4等氨盐作为氮源培养微生物时，由于NH4+被吸收，会导致培养基的pH下降，因而将其称为生理酸性盐； 以NO3-为氮源培养微生物时，由于NO3-被吸收，会导致培养基pH升高，因而将其称为生理碱性盐。 3、无机盐（mineral salts 大量元素：Ca、K 、Mg、Fe等生长所需浓度在10－3-10－4mol/l 微量元素:Zn、Cu、Mn、Co、Mo等生长所需浓度在10－6-10－8mol/l
第六章微生物发酵制药工艺 6.1 微生物发酵与制药 6.2 微生物生长与生产的关系 6.3 微生物生产菌种建立6.4 发酵培养基制备 6.4 发酵培养基制备 ? 概念（medium）供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要 的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 ? 培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。 6.4.1 培养基的成分 碳源 氮源无机盐水生长因子 前体与促进剂 消泡剂 1、碳源(carbon sources) 概念： 构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。作用：为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。 碳源种类 糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜 脂肪：豆油、棉籽油和猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸 迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸 2、氮源（nitrogen sources） 概念：构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。 作用：为生长和代谢主要提供氮素来源。种类：无机氮源、有机氮源 有机氮源 几乎所有微生物都能利用有机氮源 黄豆饼粉、花生饼粉 棉籽饼粉、玉米浆、蛋白\胨、酵母粉、尿素 无机氮源 氨水、铵盐和硝酸盐等。氨盐比硝酸盐更快被利用。 工业应用：主要氮源或辅助氮源；调节pH值生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质。（NH4）2SO4利用后，产生硫酸 生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。 3、无机盐和微量元素 ? 概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质 ? 作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。? 种类：盐离子 磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加 铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。 4、水 菌体细胞的主要成分。 营养传递的介质。良好导体，调节细胞生长环境温度。培养基的主要成分之一。 5、生长因子（growth factor）
2009年第3期 试验研究 麦麸 棉柏玉米粉蛋白质含量15～20％ 35～40％ 8～12％ 不同氮源对柠檬酸发酵的影响 石河子长运生化有限责任公司（832000）夏胜洁 摘要本研究立足于以玉米粉为原料，利用黑曲霉生产柠檬酸，对添加不同的氮源进行研究，以提高糖酸转化率和缩短发酵周期为目的。 关键词 氮源；糖酸转化率；发酵周期；周期 中图分类号：Q 946.81+8.6 文献标识码：B 文章编号：1008-0899（2009）06-0001-02 在正常生产情况下，柠檬酸在黑曲霉细胞内不会积累，而且柠檬酸是黑曲霉的良好碳源。柠檬酸积累是菌体代谢失调的结果。柠檬酸发酵需要的条件：磷酸盐浓度低；氮源用NH 4+盐；PH 值低（低于2.0）；溶氧量高。 黑曲霉柠檬酸生产菌的PFK 酶是酵解途径中第一个调节酶，也是决定EM P 途径代谢流量的最重要的关键酶。此酶受正常的生理浓度范围的柠檬酸和ATP 的抑制，为AM P 、Pi 、NH 4+所激活，NH 4+还能有效地解除柠檬酸和ATP 对PFK 酶的抑制。NH 4+在细胞内的生理浓度水平下，PFK ，酶对柠檬酸不敏感，考察柠檬酸发酵时，PFK 酶的这些效应物在细胞内的浓度表明，NH 4+浓度与柠檬酸生产率有密切的关系，并且显示在锰缺乏和充足条件下显著差别，可以认为，锰的效应是通过铵离子浓度升高而减弱了柠檬酸对PFK 酶的抑制［1］ 。能作为氮源的原料很多在考虑氮源用量时，应考虑原料中的含氮量和培养基的碳氮比以控制霉菌的长势。氮源不足长菌弱，发酵期延长，且易染杂菌。而氮源过足则曲霉长势过旺，产酸率显著下降。 从生长角度看，黑曲霉可以利用很多无机和有机氮源，尤其偏好于无机氮源，并且在发酵柠檬酸中途添加NH 4+盐也有优越性［2］。从NH 4+的代谢调节作用考虑，NH 4+在发酵过程中，尤其在产酸阶段不应受限［3］。 国内玉米粉发酵生产柠檬酸工艺也在不断的探索不断的完善，工艺已日趋成熟。国内各柠檬酸厂由于地域的不同在柠檬酸发酵中添加的氮源也不同，究竟哪种氮源最适合黑曲霉柠檬酸发酵，达到柠檬酸生产的最好经济效益，可以提高糖酸转化率和缩短发酵周期。针对添加不同的氮源对柠檬酸生产的影响进行了研究。 氮源分有机氮源和无机氮源，本文分别选取具有代表性的有机氮源麦麸、棉柏、玉米液化液，和无机氮源硫酸铵、硫酸氢铵，将其加入柠檬酸发酵的生产培养基内，研究这些氮 源是否能促进产酸。针对以上问题分别作了500ml 摇瓶实验和5m 3小试验罐实验。1 500ml 摇瓶实验材料和方法1.1实验材料 菌种：黑曲霉，Co827。 分离：斜面、培养基。5°BX 土豆汁（加蔗糖）+琼脂粉20g/l PH 自然。 玉米粉，α-淀粉酶，麦麸、棉柏，硫酸铵、硫酸氢铵氨1.2实验仪器 500ml 三角瓶、150ml 三角瓶、250ml 三角瓶、100ml 定容瓶、500ml 定容瓶、2000ml 烧杯、玻璃棒、50ml 碱式滴定管。1.3实验设备 不锈钢电热恒温水浴锅， DZ 型恒速无级调速搅拌器，GB4027.1-83手提式压力蒸汽消毒器，P270型普通摇床，XSP-2C 显微镜。1.3实验方法 玉米清夜的制备。采用间接液化法，将本厂自磨玉米粉与洁净水按17％～20％浓度在2000ml 烧杯内调浆，将2000ml 烧杯放入水浴锅内升温，升温到玉米淀粉将糊化温度时，按比例加入α-淀粉酶。当碘试合格后将2000ml 烧杯从水浴锅内取出，留小部分液化液待用，将剩余液化液的清夜与玉米渣分离，留玉米清夜备用。 摇瓶培养基的制备。将玉米清液分别和麦麸、棉柏、液化液、 硫酸铵、硫酸氢铵按合适碳氮比添加每瓶摇瓶装量50ml （麦麸、棉柏、玉米粉的蛋白质含量如附表1），分装入洁净的500ml 三角瓶，并用干净四层纱布封口并扎上牛皮纸，在蒸汽灭菌锅内灭菌，121℃30分钟，冷却待用。测定摇瓶培养基的总糖和还原糖、蛋白质含量。1.4实验步骤 表11--
碳源物质 凡是可以被微生物利用，构成细胞代谢产物碳素来源的物质，统称为碳源物质，碳源物质通过细胞内的一系列化学变化，被微生物用于合成各种代谢产物。 微生物对碳素化合物的需求是极为广泛的，根据碳素的来源不通，可将碳源物质氛围无机碳源物质和有机碳源物质。糖类是较好的碳源，尤其是单糖（葡萄糖、果糖），双糖（蔗糖、麦芽糖、乳糖），绝大多数微生物都能利用。此外，简单的有机酸，氨基酸，醇类，醛，酚等含碳化合物也能被许多微生物利用。所以我们在制作培养基时常加入葡萄糖，蔗糖作为碳源。淀粉、果胶、纤维素等，这些有机物质在细胞内分解代谢提供小分子碳架外，还产生能量供合成代谢需要的能量，所以部分碳源物质既是碳源物质，同时又是能源物质。 在微生物发酵工业中，常常根据不通微生物的需求，利用各种农副产品如：玉米粉、米糠、麦麸、马铃薯、甘薯以及各种野生植物的淀粉，作为微生物生产廉价的碳源。这类碳源往往包含了几种营养要素。 氮源物质 微生物细胞中大约含氮5%~13%，它是微生物细胞蛋白质和核酸的主要成分。氮素对微生物的生长发育有着重要的意义，微生物利用它在细胞内合成氨基酸和碱基，进而合成蛋白质，核酸等细胞成分，以及含氮的代谢产物。无机的氮源物质一般不提供能量，只有极少数的化能自养型细菌如：硝化细菌可以利用铵态氮和硝态氮在提供氮源的同时，通过氧化生产代谢能。 微生物营养上要求的氮素物质可以氛围三个类型： 1、空气中分子态氮只用少量具有固氮能力的微生物（如自生固氮菌、根瘤菌）能利用。 2、无机氮化合物如铵态氮（NH4+），硝态氮（NO3—）和简单的有机氮化物（如尿素），绝大多数微生物可以利用。
3、有机氮化合物大多数寄生性微生物和一部分腐生性微生物需以有机氮化合物（蛋白质、氨基酸）为必需的氮素营养。 在实验室和发酵工业生产中，我们常常以铵盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、血粉、蝉蛹粉、豆饼粉、花生饼粉作为微生物的氮源。
枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选 ========= （+++++农业与生物技术学院++ 111111） 摘要：本实验通过福林试剂法检测枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶的活性，旨在筛选出培养枯草芽孢杆菌时的最优碳源和掌握培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制，为今后进一步提高枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶提供可靠地参考数据。 关键词：酶活、最优碳源、碱性蛋白酶。 引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力[4]。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口
[6]。本实验通过碳源优化枯草芽孢杆菌发酵培养基和探究培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。 1.材料与方法 1.1菌株：枯草芽孢杆菌 1.2材料与试剂 酪氨酸、福林试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙、酵母浸粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、蛋白胨 1.3仪器与设备 恒温水浴锅、分光光度计、高速离心机、摇床、超净工作台、15L 发酵罐、PHS-25型酸度计、振荡培养箱、压力灭菌锅。 1.4 培养基 种子培养基(g/L)：胰蛋白栋5g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 18g/L ,pH 值自然，121℃蒸气灭菌20min； 发酵培养基(g/L)：酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，115℃与发酵罐一起进行实消，20min。 1.5方法 1.5.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌的影响 1.5.1.1配制培养基（20mL/150mL） 准确秤取0.2g酵母浸粉、0.06g柠檬酸钠、0.2g磷酸氢二钾、0.06g 氯化钙5份分别加入0.6g蔗糖、0.6g麦芽糖、0.6g葡萄糖、1.1g乳
第五章微生物与发酵工程【菜单】
【精解】 例1．所有细菌都是（） A．异养型 B．寄生 C．腐生 D．以上都不对 解析：细菌的代谢类型和生活方式多种多样，既有化能自养，如硝化细菌，又有光能自养，如光合细菌，还有很多细菌是异养型生物，如大肠杆菌。有的细菌营腐生生活，在生态系统中是分解者，如圆褐固氮菌，有的细菌营寄生生活，在生态系统中是消费者，如使人致病的结核杆菌。所以，关于细菌的代谢类型和生活方式不能一概而论。答案选D。 例2．控制细菌合成抗生素性状的基因，控制放线菌主要遗传性状的基因，控制病毒抗原特异性的基因依次位于（） ①核区大型环状DNA上②质粒上③细胞核染色体上④衣壳内核酸上 A．①③④ B．①②④ C．②①③ D．②①④ 解析：细菌的核区里有一个大型环状的DNA分子，细胞质的质粒也是小型的环状DNA分子。其中，大部分的性状由核区DNA上的基因控制，而控制细菌合成抗生素的基因、抗药性基因和固氮基因等却在质粒上；放线菌也是原核生物，核区内也有大型的DNA分子，控制着放线菌主要的遗传性状，病毒的基因只在核酸上，而蛋白质外壳没有基因。以上三类生物都没有染色体。答案选D。 例3．“非典”的病原体SARS病毒是RNA病毒，据报道，SARS疫苗的研究已取得突破性进展，
不久将进行临床实验。下列关于SARS病毒及疫苗的叙述正确的是（） A．SARS病毒的遗传物质的组成中含有5种碱基，8种核苷酸 B．接种SARS疫苗能增强人体免疫力是因为接种了SARS抗体 C．可用含碳源、氮源、生长因子、水、无机盐的普通培养基培养SARS病毒 D．决定其抗原特异性的是SARS病毒的衣壳 解析：SARS病毒是RNA病毒，因此组成它遗传物质的碱基有A．U．C．G4种，只有4种核苷酸。而病毒只能寄生在活细胞内，因此，用普通培养基是不能培养病毒的；决定病毒抗原特异性的是衣壳部分。若SARS疫苗研制成功，它可能是经过处理的已经没有毒性或毒性极弱的SARS 病毒或者是其衣壳部分，注入人体能起到抗原作用，即能刺激人体产生抗体；因此，接种的是抗原而不是抗体。本题容易错选为C，主要是没有正确掌握病毒的生活方式。答案选D 例4．下列关于病毒的叙述，正确的是（） A．病毒都含单链RNA或单链DNA B．侵染宿主细胞前，病毒自身不带有任何酶 C．病毒结构成分中只有蛋白质和核酸 D．病毒结构中有时可能装配有寄主细胞中的某些成分 解析：病毒的核酸只有一类，有的是DNA，有的RNA；有的病毒DNA是双链的，有的病毒DNA 是单链的。有的病毒RNA是单链的，也有的病毒RNA是双链的；有的病毒在侵染宿主细胞前带有一些酶，如艾滋病病毒自身带有逆转录酶，T2噬菌体带有溶菌酶。简单的病毒如烟草花叶病毒的结构成分只有蛋白质和核酸，而有些病毒如流感病毒除了核衣壳外，还带有囊膜，因此，组成成分中除了蛋白质和核酸外，还有少量脂质和糖类。所以，病毒结构成分不是只有蛋白质和核酸。因为，衣壳和核酸的组装在寄主细胞中进行，所以，有时可能装配有寄主细胞中的某些成分。答案选D 例5．下列有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（） A．作为碳源的物质不可能同时是氮源 B．凡是碳源都能提供能量 C．除水以外的无机物只提供无机盐 D．无机氮源也能提供能量 解析：碳源是指能给微生物提供碳元素的物质，而氮源是指能给微生物提供氮元素的物质，有的物质如氨基酸中，即有碳元素又有氮元素，因此可作为异养微生物的碳源和氮源。自养微
什么是碳源、氮源？ 碳源 碳源是微生物生长一类营养物，是含碳化合物。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸及有机酸酯和小分子醇。根据微生物所能产生的酶系不同，不同的微生物可利用不同的碳源。 碳源对微生物生长代谢的作用主要为提供细胞的碳架，提供细胞生命活动所需的能量，提供合成产物的碳架。 氮源 作为构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的材料。把从外界吸入的氮素化合物或氮气，称为该生物的氮源。能把氮气作为氮源的只限于固氮菌、某些放线菌和藻类等。高等植物和霉菌以及一部分细菌，仅能以无机氮素化合物为氮源。动物和一部分细菌，不用有机氮化合物作为氮源就不能生长。 作为植物的氮源最重要的是无机化合物的硝酸盐和氨盐。硝酸盐一般需还原成氨盐后才能进入有机体中，但由于生物的性质和环境条件的不同，作为氮源来说，有时氨盐适宜，有时硝酸盐适宜。如浓度适宜，亚硝酸盐、羟胺等也可作为氮源。作为氮源的有机化合物有氨基酸、酰胺和胺等。特殊的细菌，也有时需要以极其特殊的氮素化合物作为唯一的氮源来进行培养。 碳源和氮源的合理性 合理的碳源和氮源，直接影响作物的生长，碳源含量高，作物生长受到抑制，根系生长比较快，茎叶收到缓慢，可能直接降低作物的茎秆高度等。氮源含量，作物发生旺长，叶片茎秆生长有劲，可能提高作物之身的高。碳源和氮源合理，作物生长平稳，根系和果实、叶片都处在健康状态。 碳氮比一般在25:1比较合理，因此，合理补充土壤中的碳源、氮源比较关键，部分碳源由作物腐烂的茎叶和根系来补充，氮源由植物吸收空气的中的氮作物补充。但是，碳源来源不稳定，根据作物的收货的目的，碳源一般比较缺乏，补充碳源可以选择标美力克肥业有限公司“碳神奇”作为碳源补充剂，提高土壤中碳源的含量，增加土壤团粒结构。
细菌的生物化学试验 ●考点 碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验 各种酶类试验 抑菌试验 复合生化试验 不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种鉴定，主要通过这些生物化学试验。 一、碳水化合物的代谢试验 原理：细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。 1.糖（醇、苷）类发酵试验 原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。 培养基：在培养基中加入0.5%～1%的糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇、肌醇等）、苷类（水杨苷等）。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。 方法：接种，培养。结果：产酸：培养基中的指示剂呈酸性反应。 产气：可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。 不分解：培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。 应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。 2.氧化-发酵试验（O/F试验） （1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖而分解蛋白胨的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。 （2）培养基HL：Hugh-Leifson培养基。 （3）方法：将待检菌同时穿刺接种于两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液状石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。将培养基于35℃培养48小时或更长。 （4）结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若仅不加液状石蜡的培养基产酸为氧化型。 （5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与不发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。 3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验） （1）原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚。 （2）试剂：0.75M ONPG溶液 （3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5分钟，加入0.25mlONPG试剂，水浴20分钟～3小时观察结果。 （4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30分钟内显色。
微生物的营养类型 1. 内容 根据微生物生长所需要的主要营养要素即能源和碳源以及电子供体的不同，微生物的营养类型可分为：光能无机自养型、光能有机异养型、化能无机自养型、化能有机异养型。 1.光能无机自养型：以光作为能源，以CO2为基本碳源，还原CO2的氢供体是还原态无机化合物（H2O、H2S或Na2S2O3等）。 2.光能有机异养型：以光为能源，以有机碳化合物（甲酸、乙酸、丁酸、甲醇、异丙醇、丙酮酸和乳酸等）作为碳源与氢供体营光合生长，在只有无机物的环境中不能生长，所以有别于利用CO2作为唯一碳源的自养型。 3.化能无机自养型：利用无机化合物氧化过程中释放出的能量，并以CO2为碳源。它们能在完全无机的环境中生长。 4.化能有机异养型：以有机碳化合物作为能源，碳源和氢供体也是有机碳化合物。有机碳化合物是兼有能源与碳源功能的双重营养物。如淀粉、蛋白质等大分子物质以及单糖、双糖、有机酸和氨基酸等简单有机物。 营养缺陷型：某些菌种发生突变（自然突变或人工诱变）后，失去合成某种（或某些）对该菌株生长必不可少的物质（通常是生长因子如氨基酸、维生素）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。相应的野生型菌株称为原养型。 2. 练习 一、选择题 1. 大多数微生物的营养类型属于：（） A. 光能自养 B. 光能异养 C. 化能自养 D. 化能异养 答案：D 2．蓝细菌的营养类型属于：（） A．光能自养 B. 光能异养 C．化能自养 D. 化能异养 答案：A 3. 自养型微生物和异养型微生物的主要差别是：（） A. 所需能源物质不同 B. 所需碳源不同 C. 所需氮源不同 答案：B 二、填空 1. 光能自养菌以__________作能源，以__________作碳源。
铵态氮与硝态氮的差异 铵态氮肥：氮肥中氮素的形态是氨( NH3)或铵离子(NH4+)。 例如液态氨、氨水、硫酸铵、氯化铵、碳酸氢铵等。 硝态氮肥：氮肥中氮素的形态是硝酸根(NO3-)。如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙。硝、铵态氮肥：氮肥中含有铵离子和硝酸离子两种形态的氮。如硝酸铵、硝酸铵钙、硫硝酸铵。酰胺态氮肥：主要有尿素植物可以大量吸收的氮，是铵态氮和硝态氮，也可吸收少量有机态氮，如尿素和结构比较简单的氨基酸。铵态氮是还原态，为阳离子；硝态氮是氧化态，为阴离子。它们所带的电荷不用，在土壤中的行为以及对植物的营养特点也不一样。不能简单地说哪种形态好，哪种形态不好。它们的好坏与施用条件和作物种类等有关。铵态氮在带阴离子的土壤胶体中容易被吸附，而硝态氮则不能被吸附，具有更大的移动性。硝态氮被植物吸收后，要经过硝酸还原酶和亚硝酸还原酶还原成铵态氮后，才能进一步合成氨基酸。不同作物施用两种形态氮的反应往往不一。水稻施用铵态氮的效果比硝态氮好。因为水稻幼苗根中缺少硝酸还原酶，对硝态氮不能很好利用。除水稻本身原因外，水田中施用硝态氮易于流失，而且在淹水条件下的反硝化作用也是氮素损失的原因。因此，在水稻田施用硝态氮肥，有资料认为其肥效只有铵态氮肥的60%—70%。而与此相反的是烟草和蔬菜，它们是喜硝态氮的作物。硝态氮肥极易溶解，在土壤中活动性大，能迅速提供作物氮素营养，同时，又易于流失，肥效较短。这种特性符合烟草的要求，叶片要生长快，在适当时候又能落黄“成熟”。而且硝态氮有利于烟草体内形成柠檬酸、苹果酸等有机酸，烤出的烟叶品质好，燃烧性好。蔬菜施用硝态氮产量高，如硝态氮低于肥料全氮的50%，产量明显下降。因此，生产烟草、蔬菜专用肥时，氮肥中要有一定比例的硝态氮。但由于在土壤水分、温度、通气条件适宜时，铵态氮可经硝化作用，氧化成硝态氮。所以，烟草、蔬菜也不是绝对不能施用含铵态氮的肥料。另外，施用硫酸铵等生理酸性肥料作物生长不好，往往不是由于铵态氮肥不宜，而是由于生理酸性造成的。尿素施入土壤后一般要经过脲酶水解，转化成铵态氮肥，才能被植物大量吸收利用。
长沙环境保护职业技术学院毕业论文小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 姓名： 学号： 606073119 指导教师姓名：蔡水文老师 指导教师姓名：吕立获生物技术部主管 浙江普洛家园医药科技有限公司系部名称：环境科学系 专业名称：生物技术及应用 班级名称：0731班 论文提交日期：2010年6月12号
目录 摘要 (3) 引言 (4) 1实验部分 (4) 1.1 实验材料 (4) 1.2 培养过程 (4) 1.3 测定方法 (5) 2 结果与分析 (5) 2.1 50 L发酵罐培养结果与分析 (5) 3 结论 (9) 参考文献 (9) 致谢 (10)
摘要 单细胞绿藻在医疗保健、环境保护、生物能源领域等众多领域由很大的用途，并且具有很大的经济效益。但是现在在的小球藻生产工艺还欠成熟，主要问题是其产量不高发酵周期较长，因此如何高效培养出超高细胞浓度小球藻各个企业与实验室想突破的问题。小球藻培养是一个具有高度非线性、时变性和迟滞性的过程，其内在机理非常复杂，传统的培养方法难以实现对小球藻高产的目的，因此对培养、发酵过程进行优化培养很困难。本文主要研究的是对小球藻培养过程中流加与不流加葡萄糖、硝酸钾对小球藻发酵的影响。经过实验结果得知在对数生长期控制葡萄糖浓度与硝酸钾浓度在20g/L、2.2-2.5g/L可以大大提高生长速率与产量。 关键词：小球藻培养；流加；葡萄糖；硝酸钾
小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 引言 单细胞绿藻在水产养殖、环境保护、人类健康食品和重要生命活性物质生产等众多领域的研究与应用得到不断扩展，而如何高效培养出超高细胞浓度小球藻来满足各个应用领域的需要是我国急待解决的藻类生物技术关键课题。本文主要针对小球藻的发酵培养流加碳源与氮源的研究，从而得出最佳流加浓度培养条件达到高产的目的。 1实验部分 1.1实验材料 实验所用菌种是由华中理工大学提供，实验过程中采用食品级葡萄糖和分析纯硝酸钾分别作为小球藻生长的碳源和氮源，其他所用试剂均为分析纯。 1.2 培养过程 首先采用三角瓶，在温度30℃和摇床转速200 r／rain条件下异养批量培 养小球藻，培养3d左右后收获直接作为50 L半自控发酵罐的藻种。 在批量和发酵培养过程中所用培养基成分和含量均由华中理工大学自主研制，初始pH为6．50左右。根据小球藻的不同生长期，采用700 g／L葡萄糖不同量的流加，氮源、微量元素适情况添加。 实验所用培养基和容器均经过121℃、30min的高温、高压灭菌，发酵培养的控制条件是：温度为30℃，灌压0.05Mp,50L、1.5 m3／(L·h) ，培养过程中根据所消耗氧的量来调节通气量和电机频率进而提高氧的含量液中（培养液中氧的含量不低于20%，否则无法正常生长），调一次通气量调一电机频率，交替进行。
微生物：一切肉眼看不见或者看不清的，必须借助显微镜观察和研究的微小生物的总称。 混合培养物：含有多种微生物的培养物。 纯培养物：只有一种微生物的培养物。 二元培养物：培养物中含有二种微生物，而且有意思地保持二者直接的特定的关系的培养物。 分辨率：指辨别两点之间最小距离的能力。 反差：指样品区别于背景的程度。 菌落：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 平板：即培养平板，融化的固体培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板，用于分离、培养微生物。 原核微生物：是指一大类细胞核无核膜包裹，只有称作核区的裸露DNA的原始单细胞生物。包括细菌和古生菌两大类。 古生菌：在进化谱系上与细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与细菌较为接近，同属于原核生物。 细胞壁：是位于细胞最外的一层厚实、坚韧的外被，主要由肽聚糖构成，有固定细胞外形和保护细胞等多种生理功能。 脂多糖：位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物A、O--核心多糖和特异侧链或称O-多糖或O-抗原）三部分组成。 L型细菌：细菌在某些环境条件下（实验室或宿主体内）通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异型。 原生质体：在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。 球状体：和原生质体的处理方法相同，是针对革兰氏阴性细菌处理后而获得的残留部分细胞壁（外壁层）的球形体。 支原体：在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。因它的细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇，所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度。 细胞质膜：又称质膜、细胞膜或内膜，是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约7～8 nm，由磷脂（占20%～30%）和蛋白质（占50%～70%）组成。 芽孢：某些细菌在其生长发育后，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢。 微管二联体：由A、B两条中空亚纤维组成，A是完全微管，13个微管蛋白亚基组成，B是10个，与A共用3个亚基。A上伸出两条动力蛋白臂（能被Ca2+、Mg2+激活的ATP酶），水解ATP，提供鞭毛运动能量。 鞭毛与纤毛：有些真核微生物细胞表面长有或长（长者叫鞭毛）或短（短的叫纤毛）的毛发状细胞器，具有运动功能。 细胞核：真核生物都有形态完整，有核膜包裹的细胞核，对细胞的生长、发育、繁殖和遗传、变异起着决定性的作用。 核被膜：核被膜由核膜和核纤层组成，其上有许多核膜孔。核膜孔是细胞核与细胞质进行物质交换的选择性通道。核膜由两层膜组成，两膜中间叫核周间隙。核纤层位于核膜内侧，成分为核纤层蛋白。 营养物质:那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质。 营养：微生物获得和利用营养物质的过程。 迟效氮源：蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用，这种氮源叫迟效氮源。 速效氮源：无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源。 营养缺陷型：多数微生物可以利用无机含氮化合物作为氮源，也可以利用有机含氮化合物作为氮源。但有些微生物没有将无机氮合成有机氮的能力，它们不能把尿素、铵盐等这些无机氮源自行合成他们生长所需的氨基酸，而需要从外界吸收现成的氨基酸作为氮源才能生长，这类微生物叫做氨基酸异养型微生物，也叫营养缺陷型。微量元素：是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要
第一章 1什么是微生物？主要特点 微生物的指需借助显微镜才能观察到的一群微小生物的总称，它是一大群种类各异独立的生物体。 特点：（1）微生物的体积微小，比表面积大（2）繁殖快，个体长不大（3）种类繁多，分类广布（4）适应性强，易变异（5）观察和研究的手段特殊 2比较古菌、细菌和真核生物的异同点？ 尽管古生菌在菌体大小、结构及基因组结构方面与细菌相似。但其在遗传信息传递和可能标志系统发育的信息物质方面(如基因转录和翻译系统)却更类似于真 核生物。因而目前普遍认为古生菌是细菌的形式，真核生物的内涵。 古生菌细胞具有独特的细胞结构，其细胞壁的组成、结构，细胞膜类脂组分，核糖体的RNA碱基顺序以及生活环境等都与其他生物有很大区别。三个生命域中惟有细菌域具有胞壁质(肽聚糖)，其他两个域中都未发现胞壁质；古生菌域中胞壁质的缺乏和多种类型细胞壁和细胞外膜多聚体的存在，成为两个原核生物域之间最早的生物化学区分指标之一。 3何为纯培养？为什么说它对微生物学的发展至关重要？纯培养和混合培养有什么关系？ 纯培养—微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养. 纯培养是进行生物学研究的基础，使在此之前的繁琐，复杂的细菌分离变的简单 混合培养含有多种微生物，纯培养只含有一种微生物可利用重复结果，但混合培养不可以 4食品微生物学？ 食品微生物学（food microbiology），是微生物学的分支学科，主要研究微生物与食品制造、保藏等方面内容的一门科学。该学科涉及病毒、细菌、真菌多种微生物，除研究这些微生物的一般生物学特性外，还探讨它们与食品有关的特性。随着微生物学及生命科学的迅速发展，食品微生物学也从中获得了许多新的知识和新的技术，并应用这些新知识和新技术来生产更多富有营养和安全的食品。第二章 1革兰氏染色法原理及重要性 染色原理是因为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别： G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。 重要性： 微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，所以革兰氏染色法不仅用来观察细菌的形态，而且它是细菌鉴定的重要方法之一。 2 何谓菌落？ 以母细胞为中心，肉眼可见的，有一定形态构造的子细胞群体。 3芽孢的抗热机理是什么？芽孢抗热性强的特点在有关微生物的科研中有何意义？
第23卷第6期2007年12月 德州学院学报 Jour nal of Dezhou University Vol.23,No.6 Dec.,2007 碳源、氮源及其比例对香菇液体深层培养的影响 刘成荣 (福建莆田学院环境与生命科学系,福建莆田 351100) 摘 要:通过摇瓶培养,研究香菇液体深层培养最适发酵培养时间、最适碳源、最适氮源及最佳碳源与氮源质量配比.结果表明最适发酵培养时间为168h,所得菌丝体干重达0 399g/50mL 菌液,最适碳源为蔗糖,菌丝体干重达到0 396g /50mL 菌液;最适氮源为牛肉膏,菌丝干重达到0 421g/50mL 菌液,并通过正交实验筛选出最佳碳源与氮源质量配比为:W (蔗糖):W(牛肉膏):W(麦芽糖)=2 5:1:1. 关键词:香菇;碳源;氮源;摇瓶培养;生物量;正交实验 中图分类号:R282 文献标识码:A 文章编号:1004-9444(2007)06-0058-03 收稿日期:2007-08-29;修回日期:2007-10-20 作者简介:刘成荣(1964-),男,福建莆田人,副教授,学士,主要从事食、药用菌生物技术方面的研究. 香菇(Lentinula edodes)又名香蕈,属于担子菌纲,伞菌目,蘑菇科.香菇是一种营养价值很高的食用菌,不仅味道鲜美,香味郁人,而且香菇多糖更是具有一定保健功能.香菇多糖是香菇经过发酵培养及分离纯化得到的胞外多糖,它具有活化巨噬细胞、刺激产生抗体、提高人体免疫力、抗衰老、降血糖,特别是对抗肿癌有显著效果[1-5].近几年,由于生产原料、设备、燃料、水电等价格的不断提高,造成香菇生产的成本上涨,致使经济效益下降,影响香菇生产的发展.因此研究和探讨如何提高生产数量和质量,特别是对菌丝生长营养条件具有重要意义.虽然人们对它做过一些研究[6-9] ,但实验材料各人不尽相同.因此有必要对香菇液态深层发酵进行研究,以期短时间内大量生产菌丝体. 1 材料与方法 1.1 材料 1)主要仪器 电子天平ZDX-35BI 型座式自动电热压力蒸汽灭菌器SH K-99-11型回旋振荡器PYX-250S -A 型生化培养箱H Y-5型回旋振荡器DH G-9031型电热恒温干燥箱、洁净工作台(上海淀山湖净化设备厂制造) 2)菌种来源 香菇Cr02(本单位保存) 3)培养基 (1)马铃薯葡萄糖培养基(PDA)固体培养基.马铃薯200g 、葡萄糖20g 、琼脂15~20g 、水1000mL,配制方法:将马铃薯去皮、切成块、煮沸30min,用4层沙布过滤,取滤液加糖及琼脂融化后加水补至1000m L,121 灭菌20m in.冷却摆斜面后接种,26度培养长满试管即为母种. (2)液体种子培养基.马铃薯20%、葡萄糖2%酵母膏0 1%、磷酸二氢钾0 2%、硫酸镁0 1%、维生素B10 01%、PH 值6 5.装液量为250m L 、三角瓶装50mL,121度灭菌20min,冷却后从斜面母种挑取绿豆大小的菌块接入液体种子培养基,26 160r/min 培养168h 即为种子. (3)基础培养基.磷酸二氢钾0 1%、硫酸镁0 1%、维生素B10 01%PH 值自然.1.2实验方法 1)最适发酵培养时间确定.在液体种子培养基中接入种子后,分别在培养的第96h 、120h 、144h 168h 、192h 各取3瓶测定其生物量.2)最适碳源实验.在基础培养基中以0 3%牛肉膏为氮源,碳源分别为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、果糖,用量各为2 5%,其他成分同基础培养基. 3)最适氮源试验.在基础培养基中以2 5%葡萄糖为碳源,氮源分别为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵,甘氨酸,用量各为2 5%.其他成分同