微生物营养要求看，所有微生物都需要碳源，氮源，无机元素，水及生长物质。如果是好氧微生物还需要氧气。在实验室规模上配制含有纯化合物的培养基非常简单，但在大规模生产上是不合适的。
第一节工业发酵培养基
发酵培养基的作用：
-满足菌体的生长
-促进产物的形成
一、工业上常用的碳源（carbon source）
1. 应用最广的是谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉），淀粉水解后得葡萄糖。
使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。
缺点：
a.难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶。
b.成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。
优点：
来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。
2. 葡萄糖
-所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应。
-工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标。
3.糖蜜
制糖工业上的废糖蜜waste molasses或结晶母液
包括：甘蔗糖蜜（cane molasses）——糖高，氮少
甜菜糖蜜（beet molasses）
两者成分见P226
糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。
二、工业上常用的氮源（nitrogen source）
1.无机氮(迅速利用的氮源)
种类：氨水、铵盐或硝酸盐、尿素
特点：吸收快，但会引起pH值的变化
选择合适的无机氮源有两层意义：
-满足菌体生长
-稳定和调节发酵过程中的pH
无机氮源的影响：硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素
2.有机氮：
来源：一些廉价的原料，如玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、酵母浸出膏等。其中玉米浆（玉米提取淀粉后的副产品）和豆饼粉既能做氮源又能做碳源。
成分复杂：除提供氮源外，还提供大量的无机盐及生长因子。
微生物早期容易利用无机氮，中期菌体的代谢酶系已形成——有机氮源。有机氮源来源不稳定，成份复杂，所以利用有机氮源时要考虑到原料波动对发酵的影响。
三、无机盐（inorganic mineral）
硫酸盐、磷酸盐、氯化物及一些微量元素。无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。
四、生长因子（growth factor）
微生物生长不可缺少的微量有机物质。如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素。
生长因子不是所有微生物都必需的。只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不
可少的营养物。如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型（biotin auxotroph）,以生物素为生长因子。
1.生物素
作用: (1)主要影响细胞膜通透性。P263
（2）影响菌体的代谢途径。
生物素浓度对菌体生长和谷氨酸积累均有影响。大量合成谷氨酸所需要的生物素浓度比菌体生长的需要量低，即为菌体生长需要的“亚适量”。原因：P263，P260（OD值）
生物素过量：菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸。
生物素不足：菌体生长不好，谷氨酸产量也低。
-谷氨酸产生菌为生物素缺陷型。
-要达到菌体生长需要的“亚适量”。
生物素存在于动植物组织中，多与蛋白质呈结合状态存在。用酸水解可以分开。那么，生产上有哪些原料可以作为生物素来源呢？
2.提供生长因子的农副产品原料
（1）玉米浆：（corn steep liquor, CSL）
最具代表性。虽然主要用作氮源，但含有乳酸，少量还原糖和多糖，含有丰富的氨基酸，核酸，维生素，无机盐等。常作为提供生长因子的物质。所以，从某种意义上说，玉米浆液用于配制发酵培养基是发酵工业中的一个重大发现。
（2）麸皮水解液：可代替玉米浆，但蛋白质，氨基酸等营养成分比玉米浆少。
（3）糖蜜：两种糖蜜（cane molasses，beet molasses）均可代替玉米浆。但氨基酸等有机氮含量较低。
（4）酵母：可用酵母膏，酵母浸出液或直接用酵母粉。
第二节淀粉水解糖的制备
在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖（glucose）的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。其主要糖分是葡萄糖。根据水解条件不同，尚有数量不等的少量麦芽糖及其它一些二糖，低聚糖等复合糖。
一、淀粉水解制糖的意义
1.大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）
2.有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。
3.若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。
二、淀粉水解糖的制备方法及原理
（一）酸解法（acid hydrolysis method）
以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。
1.水解过程：
总反应式：(C6H10O5)n+nH2O →nC6H12O6
过程：(C6H10O5)n →(C6H10O5)x →C12H22O11 →C6H12O6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖
H+对作用点无选择性，A-1,4-糖苷键和A -1,6-糖苷键均被切断。
2.葡萄糖的复合反应和分解反应
在水解过程中，由于受到酸和热的作用，一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应。
淀粉
↓盐酸
复合反应葡萄糖分解反应
↙↗↘
复合二糖5‘－羟甲基糠醛
↓ ↑↓
复合低聚糖有机酸、有色物质
损失葡萄糖量7％<1％
不利影响：
（1）降低了葡萄糖的收率。
（2）给产物的提取和糖化液的精制带来困难。
复合反应：葡萄糖分子间经1，6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味），异麦芽糖和其它低聚糖(复合低聚糖)。生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高。
分解反应：生成的5‘－羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难。
如何控制分解反应和复合反应的发生？
（1）淀粉乳浓度
（2）酸浓度都不能过高原因P229-230
（3）温度
3.评价
优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。
缺点：
（1）副产物多，影响糖液纯度，一般DE值(葡萄糖值)只有90％左右。
（2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。
DE值：dextrose equivalent value
（葡萄糖当量值）
表示淀粉糖的含糖量。
还原糖含量（％）
DE值＝---------- х 100％
干物质含量（％）
P231（中间）图最高点下降的原因？
（二）酶解法（enzyme hydrolysis method）
用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。
分两步：
（1）液化：用A-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖
（2）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精和低聚糖转化为葡萄糖。
所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法(double enzyme hydrolysis method)。
液化（liquification）
α－淀粉酶水解底物内部的α－1,4糖苷键，不能水解α－1,6糖苷键，一般采用耐高温淀粉酶，使液化速度加快。85－90℃。
淀粉的糊化与老化：由于淀粉颗粒的结晶性结构对酶作用的抵抗力非常强，需要先加热淀粉乳，使淀粉颗粒吸水膨胀，糊化，破坏结晶性结构。
糊化：淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。
老化：指分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶的过程。
▲淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，必须采取相应的措施控制糊化淀粉的老化。液化程度的控制（液化后需糖化的原因）：如果让液化持续下去，虽然最终产物也是葡萄糖和麦芽糖，但：
a.糖液的DE值低（α-淀粉酶不能水解α-1,6糖苷键）
b.液化在较高温度下进行，液化时间加长，一部分已液化的淀粉又会重新结合成硬束状态，老化，使糖化酶难以作用。
c.液化的目的是为了给糖化酶的作用创造条件，而糖化酶水解糊精及低聚糖等分子时，需先与底物分子生成络合结构，然后发生水解作用，这就要求被作用的底物分子有一定的大小范围才有利于糖化酶生成这种结构，底物分子过大或过小都会妨碍酶的结合和水解速度。
根据生产经验，DE值在20-30之间为好，液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色。P25
液化到终点后，为了避免液化酶对糖化酶的影响，需对液化液进行灭酶处理，升温到100℃，保持10分钟，降温，供糖化用。
2. 糖化（saccharification）
糖化酶从非还原性末端水解α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键。
终点确定：DE值达最高时（DE值不再上升时），停止酶反应（加热至80℃，20min灭酶）。否则DE值将由于葡萄糖经α-1,6糖苷键起复合反应而降低。糖化的温度（50-60℃）和pH 值（4.0-5.0）决定于所用糖化剂的性质。
3.评价
优点：
（1）反应条件温和，不需高温、高压设备。
（2）副反应少，水解糖液纯度高。
（3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓度下水解。
（4）糖液颜色浅，质量高。
缺点：
（1）生产周期长，一般需要48小时。
（2）需要更多的设备，且操作严格。
（三）酸酶结合法（acid-enzyme hydrolysis method）
集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺。根据原料淀粉性质分：
1.酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖。
-淀粉酶液化，短时间液化，反应往往不彻底。α适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原料，若用
-淀粉酶液化，再用酸水解。α2.酶酸法：先用
适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀。或者小的水解，大的未水解；或者大的水解，时间长，小的则发生复合反应。
（四）不同糖化工艺的比较
项目
酸解法
酸酶结合法
酶解法
DE值
91
95
98
羟甲基糠醛（％）0.3
0.008
0.003
色度
10
0.3
0.2
淀粉转化率
90
95
98
工艺条件
高温加压
高温加压
常温
过程耗能
多
多
少
副产物
多
中
少
生产周期
短
中
长
设备规模
小
中
大
防腐要求
高
较高
低
适合发酵工艺情况差
中
有利
第三节糖蜜原料
糖蜜是很好的发酵原料，用其生产，可降低成本，节约能源，便于实现高糖发酵工艺，但有些成分不适合发酵，必须进行预处理。
一、糖蜜的分类及组成
含糖量含氮量
1.分类：cane molasses 高低
beet molasses 低高
raw sugar molasses 精制粗糖时分离出的糖蜜
high test molasses( 高级糖蜜)
glucose molasses 葡萄糖工业不能再结晶葡萄糖的母液
2.组成：粘稠、黑褐色、半流动状液体。组成各不相同。除含有发酵性糖分外，还含有胶体物质，灰分，维生素，氨基酸。甘蔗糖蜜中生物素含量较甜菜糖蜜中高。(国外大多以糖蜜为原料生产谷氨酸。
二、糖蜜的预处理：
胶体(产生大量泡沫)和灰分影响菌体生长及产品纯度。
1.澄清：加酸，加絮凝剂（石灰）
2.脱钙：加Na2CO3
3.降低生物素含量（谷氨酸发酵中）
（1）去除生物素：活性炭及树脂吸附
（2）拮抗生物素：加表面活性剂（Tween 60），阻止油酸合成→磷脂合成不足。
（3）加青霉素：使新增殖的子细胞不具有完整的细胞壁，改善了细胞膜的渗透性。
另外，从菌种方面：使用油酸或甘油缺陷型，不受培养基中高生物素的影响
微生物发酵生长因子(图)
生长因子（growthfactor）是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。它的需要量一般很少。广义的生长因子除了维生素外，还包括碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4～C6的分枝或直链脂肪酸，以及需要量较大的氨基酸；而狭义的生长因子一般仅指维生素。
生长因子虽是一种重要的营养要素，但它与碳源、氮源和能源不同，并非任何一种微生物都须从外界吸收的。各种微生物与生长因子的关系可分以下几类：
（1）生长因子自养型微生物（auxoautotrophs）多数真菌、放线菌和不少细菌，如E．coli （大肠杆菌）等都是不需要外界提供生长因子的生长因子自养型微生物。
（2）生长因子异养型微生物（auxoheterotrophs）它们需要多种生长因子，如乳酸细菌、各种动物致病菌、原生动物和支原体等。例如，一般的乳酸菌都需要多种维生素；许多微生物及其营养缺陷型（突变株）都需要不同的嘌呤、嘧啶碱基；Haemophilusinfluenzae（流感嗜血杆菌）需要卟啉及其衍生物作为其生长因子；支原体常需要甾醇；Haemophilusparahaemolyti-cus（副溶血嗜血菌）需要胺类；一些瘤胃微生物需要C4～C6分枝或直链脂肪酸；某些厌氧菌如Bacteroidesmelaninogenicus（产黑素拟杆菌）需要维生素K 和氯高铁血红素，等等。
生长因子异养型的微生物可用作维生素等生长因子生物测定时的试验菌。
（3）生长因子过量合成微生物有些微生物在其代谢活动中，会分泌出大量的维生素等生长因子，因此，它们可以作为维生素等的生产菌。最突出的例子是生产维生素B2的Eremothe-ciumashbya（阿舒假囊酵母，其B2产量可达2.5g／L发酵液）和Ashbyagossypii （棉阿舒囊霉）；生产维生素B12的Propionibacteriumshermanii（谢氏丙酸杆菌）、一些链霉菌（如Streptomycesolivaceus[橄榄色链霉菌，3.3mg／L]，S．griseus[灰色链霉菌，0.3mg／L]）和产甲烷菌等。
在配制微生物培养基时，如果配制的是天然培养基，则可加入富含生长因子的原料——酵母膏（yeastextract）、玉米浆（cornsteepliquor）、肝浸液（liverinfusion）、麦芽汁（maltextract）或其他新鲜的动植物组织浸液（表5-6，5-7）；如果配制的是组合培养基，则可加入复合维生素溶液。
1.5 黄原胶
1.5.1 概况
黄原胶(Xamthan Gum)别名汉生胶，又称黄单胞多糖，是国际上70年代发展起来的新型发酵产品。它是由甘兰黑腐病黄单胞细菌(Xanthomonas campestris)以碳水化合物为主要原料，经通风发酵、分离提纯后得到的一种微生物高分子酸性胞外杂多糖。其作为新型优良的天然食品添加剂用途越来越广泛。
国际上，黄原胶开发及应用最早的是美国。美国农业部北方地区Peoria实验室于60年代初首先用微生物发酵法获得黄原胶。1964年，美国Merck公司Keco分部在世界上首先实现了黄原胶的工业化生产。1979年世界黄原胶总产量为2000t，1990年达4000t以上。在美国，黄原胶年产值约为5亿美元，仅次于抗生素和溶剂的年产值，在发酵产品中居第3位。
我国对黄原胶的研究起步较晚，进行开发研究的单位，如南开大学、中科院微生物研究所、山东食品发酵研究所等，均已通过中试鉴定。目前全国有烟台、金湖、五连等数家黄原胶生产厂，年产在200t左右，主要用作食品添加剂。我国生产黄原胶的淀粉用量一般在5%左右，发酵周期为72~96h，产胶能力
30~40g/L，与国外比较，生产水平较低。随着黄原胶生产和应用范围的进一步发展，目前北京、四川、郑州、苏州、山东等地都有黄原胶生产新厂建成，预示着我国的黄原胶生产将呈现一个新的局面。
1.5.2 黄原胶的分子结构及其性质
1）黄原胶的分子组成
黄原胶是以5分子糖为一单元，由与此相同的单元聚合而成的高分子多糖物质。每一单元由2分子葡萄糖，2分子甘露糖和1分子葡萄糖醛酸组成。其主链由β-葡萄糖通过1，4-糖苷键相连而成的2分子葡萄糖为单元，其结构与纤维素结构相同，相间在葡萄糖的C3上连有2分子甘露糖和1分子葡萄糖醛酸构成侧链。在侧链上有丙酮酸及竣酸侧基。因其侧链含酸性基团，在水溶液中呈多聚阴离子，构成黄原胶的三级立体结构：带阴离子的侧链缠绕主链形成螺旋结构，分子间靠氢键形成双股螺旋，而双股螺旋结构间又是靠微弱的非共价键维系，形成规则的"超级接合带状的螺旋聚合体”。
2）黄原胶的性质
①典型的流变特性
随着剪切速率增加，因胶状网络遭到破坏，导致粘度降低，胶液变稀，但一旦剪切力消失，粘度又可恢复，因而使黄原胶具有良好的泵送和加工性能。利用这种特性在需要添加增稠剂的液体中加入黄原胶，不仅液体在输送过程中容易流动，而且静止后又能恢复到所需要的粘度，因此被广泛应用于饮料行业。
②低浓度时的高粘性
含2%~3%黄原胶的液体，其粘度高达3~7Pa.s。黄原胶的高粘性使其具有广阔的应用前景，但同时又给生产上的后处理带来麻烦。
③耐热性
黄原胶在相当宽的温度范围内(-98~90℃)粘度几乎无变化。黄原胶即使在130℃的高温下保持36min 后冷却，溶液的粘度也无明显变化。在经多次冷冻-融化循环后，胶液的粘度并不发生改变。在高温条件下若添加少量电解质如0。5%NaCI，可稳定胶液的粘度。
④耐酸、碱性
黄原胶水溶液的粘度几乎与pH值无关。这一独特性质是其他增稠剂如竣甲基纤维素(CMC)等所不具备的。
⑤相容性及溶解性
黄原胶可与绝大部分的常用食品增稠剂溶液溶混，特别是与藻酸盐类、淀粉、卡拉胶、瓜胶溶混后，溶液的粘度以叠加的形式增加。
黄原胶易溶于水，不溶于醇、酮等极性溶剂。在非常广的温度、pH和盐浓度范围内，黄原胶很容易溶解于水中，其水溶液可在室温下配制，搅动时应尽可能减少空气混人。如果将黄原胶预先与一些干物质如盐、糖、味精等混匀，然后用少量水湿润，最后加水搅拌，这样配制出的胶液其性能更好。
⑥分散性及保水性
黄原胶是食品添加剂中优良的悬浮剂和乳化稳定剂。黄原胶对食品具有良好的保水、保鲜作用。
1.5.3 黄原胶的生产
1）工艺流程
菌种的扩培→发酵原料配比→发酵→发酵条件控制→分离→提纯→干燥
2）菌种
黄原胶生产有广泛的微生物来源，黄单胞菌属的许多种类菌株都能产生黄原胶。目前，国内外用于生产黄原胶的菌种大多是从甘兰黑腐病病株上分离到的甘兰黑腐病黄单胞菌，也称野油菜黄单胞菌。另外生产黄原胶的菌种还有菜豆黄单胞菌(X. phaseoli)、锦葵黄单胞菌(X. Malvacearum)和胡萝卜黄单胞菌(X. carotae)等。我国目前已开发出的菌株有南开-01、山大-152、008、L4和L5。这些菌株一般呈杆状，革兰氏染色阴性，产荚膜。在琼脂培养基平板上可形成黄色粘稠菌落，液体培养可形成粘稠的胶状物。
3）发酵培养基
黄原胶发酵培养基的碳源一般是糖类、淀粉等碳水化合物。在黄单胞菌菌体内酶的作用下，1、6-糖苷键被打开，形成直链多糖，经进一步转化，最终变成产物黄原胶。氮源一般以鱼粉和豆饼粉为主。另外，还添加一些微量无机盐，如铁、锰、锌等的盐类。特别是轻质碳酸钙以及NaH2PO4和MgSO4，它们对黄原胶的合成有明显的促进作用。
例如南开大学的南开-01菌种所使用的摇瓶发酵培养基如下：玉米淀粉4%，鱼粉蛋白胨0.5%，轻质碳酸钙0.3%，自来水配制，pH7.0。在大罐生产中将鱼粉蛋白胨改成鱼粉直接配料，其他原料不变。国外用作黄原胶发酵的碳源多数是葡萄糖。
4）发酵
①摇瓶发酵
摇瓶发酵条件：接种量1%~5%，旋转式摇床转速220r/min，培养温度28℃，发酵72h左右。发酵结束，黄原胶产酸能力为20~30g/L，对碳源的转化率在60%~70%。
②工业化生产
接种量为5%~8%。由于培养基的高粘度，黄原胶生产属高需氧量发酵，需大通风量，一般为1~0.6m3/（m3min)。发酵温度为25~28℃。碳源的起始浓度一般在2%~5%。
黄原胶的收率取决于碳、氮源的种类和发酵条件。目前收率一般在起始糖量的40%~75%。黄单胞菌容易利用有机氮源，而不易利用无机氮源。有机氮源包括鱼粉蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼粉、豆饼粉、谷糠等。其中以鱼粉蛋白胨为最佳，它对产物的生成有明显的促进作用，一般使用量为0.4%~0.6%。在氮源浓度较低时，随氮源浓度的提高，细胞浓度也增加，黄原胶的合成速率加快，黄原胶得率也相应提高。起始氮源在中等浓度时，细胞浓度和黄原胶的合成速率均有提高，发酵时间被缩短，但黄原胶的得率却降低，这是因为细胞生长过快，使用于细胞生长及维持细胞生命的糖量增加，用于合成黄原胶的糖反而减少，导致黄原胶得率下降。如果采用发酵后期流加糖的方法，使糖浓度始终维持在一定的水平，那么，由于补加的糖只用于细胞维持生命及合成黄原胶，而没有生长的消耗，从而得率就可比间歇发酵有较大提高。若起始氮源的浓度再提高，虽然细胞浓度有所增加，但黄原胶得率及合成速率却降低了。其主要原因是"氧限制"，高浓度细胞随着发酵的进行，发酵液粘度不断增大，体积传质系数降低，造成氧供应能力逐渐下降，合成速率变慢，得率降低。
黄原胶发酵培养基的起始pH值一般控制在6.5~7.0，这有利于初期的细胞生长和后期的黄原胶合成。
5）黄原胶的分离提取
黄原胶通常由玉米淀粉辅以氮源及微量元素经微生物发酵后制得。发酵醪中除含黄原胶(3%左右)外，还有菌丝体、未消耗完的碳水化合物、无机盐及大量的液体。其中菌丝体等固形物占20%，水溶性无机盐占10%。如果菌丝体等固形物混杂在黄原胶成品中，会造成产品的色泽差、味臭，从而限制了黄原胶的使用范围。因此黄原胶的分离提取，其目的在于按产品质量规格的要求将发酵醪中的杂质不同程度地除去，通过纯化、分离、浓缩和干燥等手段获得成品。黄原胶成品分食品级、工业级和工业粗制品3种。
①溶剂沉淀法
先将发酵液用6mol/LHCI酸化，然后加入工业酒精使黄原胶沉淀。过滤后沉淀物先后用工业酒精和10%KOH洗涤，过滤，沉淀物干燥后进行粉碎，经过筛制得成品。本法由于直接用HCl和工业酒精进行酸化沉淀，没有去除掉菌体，因此仅能制得工业级黄原胶。
为了制得食品级黄原胶，在上面的方法基础上增加了离心除菌体和多次用酒精进行沉淀、洗涤的操作，从而提高了成品的纯度。
溶剂沉淀法工艺简单，产品质量高，大型化生产技术成熟，是目前国内采用的主要生产方法，但该方法溶剂用量大，需设置溶剂回收设备，投资较大，生产成本高。本法提取收率在97.7%。
②钙盐-工业酒精沉淀法
在酸性条件下，黄原胶与氯化钙形成黄原胶钙凝胶状沉淀；加入酸性酒精脱去钙离子，使成短絮状沉淀；过滤，在沉淀中加人酒精并用氢氧化钾溶液调节pH值。
③絮凝法
絮凝剂与黄原胶作用产生絮状沉淀，然后将沉淀物脱水，得到固型物含量为25%左右的湿滤饼；用多糖的非溶剂在适当条件下洗提上述湿滤饼，使其变为水溶性多糖。然后过滤，将水溶性滤饼干燥；经粉碎、筛分后得到合格的黄原胶成品。
④直接干燥法
本法采用滚筒干燥或喷雾干燥等方法，直接将发酵液进行干燥，从而制成工业粗制品级的黄原胶。该方法因为没有分离提纯工序，所以成品质量差，限于对黄原胶质量要求不高的场合使用，有利于降低产品成本。
⑤超滤脱盐法
本法采用近代分离技术，对高分子的黄原胶与小分子的无机盐和水进行超滤分离，将黄原胶发酵液浓缩至2.5%~5%，而无机盐浓度从10%降低至0.5%~1%，然后再进行喷雾干燥。本法与直接干燥法相比，产品质量有所提高，达到工业精制品等级。
⑥酶处理-超滤浓缩法
本法用酶处理发酵液，将蛋白质水解，从而使发酵液变得澄清，简化了离心过滤这一步工序。本法使用的酶包括碱性蛋白酶，酸性或中性蛋白酶，或用复合酶共同进行作用。用酶处理后，不但发酵液澄清度提高，而且氮含量降低，过滤性能得到改善，在微孔过滤中过滤速度可提高3~20倍，成品质量也有提高。
综上所述，黄原胶的分离提取方法很多，但在应用上都受到各自条件、特点的制约。比较而言，采用超滤浓缩纯化发酵液的方法是比较理想的选择。
6）黄原胶的干燥
为了便于保藏和运输，一般都将黄原胶制成干品。黄原胶的干燥有不同的处理方法：真空干燥、滚筒干燥、喷雾干燥、流化床干燥以及气流干燥。由于黄原胶是热敏性物质，不能承受长时间的高温处理，因此使用喷雾干燥法会使黄原胶的溶解性变差。滚筒干燥虽然热效率较高，但机械结构较复杂，用于大型工业化生产目前还难实现。带有惰性球的流化床干燥，因兼有强化传热传质以及研磨粉碎的功能，物料滞留时间也较短，所以适合像黄原胶那样的热敏性粘稠物料进行干燥。
35、下列营养物质,既含有碳源、氮源,又含有生长因子的是： 35、下列营养物质，既含有碳源、氮源，又含有生长因子的是: A(牛肉膏 B(生物素 C(蛋白胨 D(酵母粉 36、下列哪种细胞不具有癌变特点，不可以在培养条件下无限传代下去: A(原代细胞 B(细胞株 C(细胞系 D(胚胎细胞 37(以下各项说法中，不正确的是 ( ) 选蛋白质功能项 A RNA聚合酶参与DNA的复制 B 胰岛素调节血糖浓度 C 干扰素与抗原结合 D 固氮酶参与化能合成作用 38(下列关于环境污染的叙述中正确的是 ( ) A(环境污染是生物多样性面临威胁的原因之一 B(水中N、P、K等植物必需矿质元素的含量越多对水生植物生长越有利 C(固体废弃物是没有使用价值的污染源 D(环境污染是造成多基因遗传病发病率升高的原因之一 39(下列各项中是有丝分裂和减数分裂共有的特点的是( ) A(出现纺锤丝 B.染色体缩短变粗 C.着丝点分裂 D.非同源染色体自由组合 40(在基因工程中，作为基因运输工具的运载体，必须具备的条件有 ( ) A(能够在宿主细胞中复制，并稳定地保存 B(具有多个限制酶切点 C(必须是细菌的质粒或噬菌体 D(具有某些标记基因 41.下列结构在光下可产生ATP的是 A.细胞质基质 B.突触后膜 C.叶绿体的类囊体 D.线粒体的内膜 42. 淋巴细胞受某种抗原刺激后所产生的抗体 ( ) A(其化学本质是蛋白质 B(起非特异性免疫作用 C(是针对各种抗原的 D(能在体内存留 43.用氰化物抑制离体肌肉的细胞呼吸后，肌肉在一定时间内遇刺激仍能收缩，此时收缩的能量来自 A.外界的刺激 B.乳酸 C.磷酸肌酸 D.三磷酸腺苷 44.下列各项所进行的细胞分裂，不出现同源染色体配对现象的有
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法） 1、试剂配制 去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。 硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。 六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。 过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。 磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。 邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。 2、仪器设备 土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。 1–真空干燥器，2–装土壤烧杯，3–装氯仿烧杯4–磨口三通活塞5–真空表 6–缓冲瓶7–抽真空管8–增压泵9–控制开关10–进水口11–出水口 （图6–1 土壤熏蒸抽真空装置） 3、操作步骤 （1）土样前处理 新鲜土样应立即进行前处理或保存于4℃冰箱中。测定前先仔细除去土样中可见的植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2mm）并混匀。如土样过湿，应在室内适当风干至土样含水量约为田间持水量（Water-holding capacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不
§1 微生物的营养要求P75 营养：微生物摄取和利用营养物质的过程。 营养物质：能满足微生物生长、繁殖和进行各种生理活动需要的物质。 微生物细胞培养收集湿菌体 烘干至恒重 干细胞灰分 无机物（盐） 有机物 蛋白质、糖、脂类、核酸、 维生素等及其降解物 分析方法：课本P79水分：70－90％离心、过滤、洗涤高温烘干105℃；低温真空干燥；红外线快速烘干。550℃焚烧 一、微生物细胞 的化学组分 2.细胞化合物的组成： 糖类、脂类、蛋白质、水、无机盐、生长因子、核酸 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” 3.化学元素组成： 主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁 微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” 4.微生物细胞的化学组分特点 (1)、不同的微生物细胞化学组分不同 （2）、同一种微生物在不同的生长阶段，其化学组分也有差异 二、营养物质及其生理功能 P76 1.根据营养物质在机体中的生理功能不同进行分类 五大类（武大）：碳源、氮源、水、无机盐、生长因子 六大类（周德庆）:碳源、氮源、水、无机盐、生长因子、能源 1、碳源(carbon source) 为微生物提供碳素来源的物质。 1、功能 （1、构成微生物细胞物质，如糖、蛋白质、核酸等
（2、形成代谢产物，如酒精、乳酸等 （3、提供生命活动的能源 2、可作碳源的物质（P80表4－2） 糖类，蛋白质，有机酸，醇类，脂类，烃，CO2，碳酸盐等 碳源谱 必须利用有机碳源无机碳源为（唯一）主要碳源 自养微生物 异养微生物 最适碳源糖类优于其它化合物 单糖优于双糖、多糖 己糖优于戊糖 葡萄糖、果糖优于其他己糖 同一微生物对不同碳源的利用差别－速效碳源和迟效碳源 如葡萄糖和半乳糖同时存在于培养基中时，大肠杆菌先利用葡萄糖（速效碳源），再利用半乳糖（迟效碳源） 不同微生物的碳源谱相差很大 双功能营养物异养微生物的碳源兼作能源 2、氮源(nitrogin source) 为微生物提供氮素来源的物质。 1、功能 （1、构成微生物含氮物质，如蛋白质、核酸等 （2、形成代谢产物，如谷氨酸等 (3、一般不做能源 2、可作氮源的物质（P81表4－3） 蛋白质及其降解物（胨、肽、氨基酸）、硝酸盐、氨盐、N2、尿素、嘌呤、嘧啶、氰化物等 3、异养微生物氮的利用顺序 C.H.O.N> C.H.O.N.x >N.H > N.O 培养基中最常用的有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏 3、速效氮源和迟效氮源 实例：土霉素发酵生产中添加的玉米浆和花生饼粉 玉米浆：以较易吸收的蛋白质降解产物形式存在，易被利用（速效氮源） 花生饼粉：以大分子蛋白质形式存在，不易被利用（迟效氮源） 发酵生产中的作用不同：前者有利于菌体生长，后者有利于代谢产物形成保持适当的比例，协调菌体生长期和产物形成期，提高土霉素的产量 4、生理酸性盐与生理碱性盐： 以(NH4)2SO4等氨盐作为氮源培养微生物时，由于NH4+被吸收，会导致培养基的pH下降，因而将其称为生理酸性盐； 以NO3-为氮源培养微生物时，由于NO3-被吸收，会导致培养基pH升高，因而将其称为生理碱性盐。 3、无机盐（mineral salts 大量元素：Ca、K 、Mg、Fe等生长所需浓度在10－3-10－4mol/l 微量元素:Zn、Cu、Mn、Co、Mo等生长所需浓度在10－6-10－8mol/l
第六章微生物发酵制药工艺 6.1 微生物发酵与制药 6.2 微生物生长与生产的关系 6.3 微生物生产菌种建立6.4 发酵培养基制备 6.4 发酵培养基制备 ? 概念（medium）供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要 的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 ? 培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。 6.4.1 培养基的成分 碳源 氮源无机盐水生长因子 前体与促进剂 消泡剂 1、碳源(carbon sources) 概念： 构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。作用：为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。 碳源种类 糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜 脂肪：豆油、棉籽油和猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸 迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸 2、氮源（nitrogen sources） 概念：构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。 作用：为生长和代谢主要提供氮素来源。种类：无机氮源、有机氮源 有机氮源 几乎所有微生物都能利用有机氮源 黄豆饼粉、花生饼粉 棉籽饼粉、玉米浆、蛋白\胨、酵母粉、尿素 无机氮源 氨水、铵盐和硝酸盐等。氨盐比硝酸盐更快被利用。 工业应用：主要氮源或辅助氮源；调节pH值生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质。（NH4）2SO4利用后，产生硫酸 生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。 3、无机盐和微量元素 ? 概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质 ? 作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。? 种类：盐离子 磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加 铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。 4、水 菌体细胞的主要成分。 营养传递的介质。良好导体，调节细胞生长环境温度。培养基的主要成分之一。 5、生长因子（growth factor）
碳源物质 凡是可以被微生物利用，构成细胞代谢产物碳素来源的物质，统称为碳源物质，碳源物质通过细胞内的一系列化学变化，被微生物用于合成各种代谢产物。 微生物对碳素化合物的需求是极为广泛的，根据碳素的来源不通，可将碳源物质氛围无机碳源物质和有机碳源物质。糖类是较好的碳源，尤其是单糖（葡萄糖、果糖），双糖（蔗糖、麦芽糖、乳糖），绝大多数微生物都能利用。此外，简单的有机酸，氨基酸，醇类，醛，酚等含碳化合物也能被许多微生物利用。所以我们在制作培养基时常加入葡萄糖，蔗糖作为碳源。淀粉、果胶、纤维素等，这些有机物质在细胞内分解代谢提供小分子碳架外，还产生能量供合成代谢需要的能量，所以部分碳源物质既是碳源物质，同时又是能源物质。 在微生物发酵工业中，常常根据不通微生物的需求，利用各种农副产品如：玉米粉、米糠、麦麸、马铃薯、甘薯以及各种野生植物的淀粉，作为微生物生产廉价的碳源。这类碳源往往包含了几种营养要素。 氮源物质 微生物细胞中大约含氮5%~13%，它是微生物细胞蛋白质和核酸的主要成分。氮素对微生物的生长发育有着重要的意义，微生物利用它在细胞内合成氨基酸和碱基，进而合成蛋白质，核酸等细胞成分，以及含氮的代谢产物。无机的氮源物质一般不提供能量，只有极少数的化能自养型细菌如：硝化细菌可以利用铵态氮和硝态氮在提供氮源的同时，通过氧化生产代谢能。 微生物营养上要求的氮素物质可以氛围三个类型： 1、空气中分子态氮只用少量具有固氮能力的微生物（如自生固氮菌、根瘤菌）能利用。 2、无机氮化合物如铵态氮（NH4+），硝态氮（NO3—）和简单的有机氮化物（如尿素），绝大多数微生物可以利用。
3、有机氮化合物大多数寄生性微生物和一部分腐生性微生物需以有机氮化合物（蛋白质、氨基酸）为必需的氮素营养。 在实验室和发酵工业生产中，我们常常以铵盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、血粉、蝉蛹粉、豆饼粉、花生饼粉作为微生物的氮源。
枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选 ========= （+++++农业与生物技术学院++ 111111） 摘要：本实验通过福林试剂法检测枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶的活性，旨在筛选出培养枯草芽孢杆菌时的最优碳源和掌握培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制，为今后进一步提高枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶提供可靠地参考数据。 关键词：酶活、最优碳源、碱性蛋白酶。 引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力[4]。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口
[6]。本实验通过碳源优化枯草芽孢杆菌发酵培养基和探究培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。 1.材料与方法 1.1菌株：枯草芽孢杆菌 1.2材料与试剂 酪氨酸、福林试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙、酵母浸粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、蛋白胨 1.3仪器与设备 恒温水浴锅、分光光度计、高速离心机、摇床、超净工作台、15L 发酵罐、PHS-25型酸度计、振荡培养箱、压力灭菌锅。 1.4 培养基 种子培养基(g/L)：胰蛋白栋5g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 18g/L ,pH 值自然，121℃蒸气灭菌20min； 发酵培养基(g/L)：酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，115℃与发酵罐一起进行实消，20min。 1.5方法 1.5.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌的影响 1.5.1.1配制培养基（20mL/150mL） 准确秤取0.2g酵母浸粉、0.06g柠檬酸钠、0.2g磷酸氢二钾、0.06g 氯化钙5份分别加入0.6g蔗糖、0.6g麦芽糖、0.6g葡萄糖、1.1g乳
收稿日期：2003-12-11 文章编号：1005-6114（2004）01-0031-05 农药残留及微生物在农药 降解中的应用与展望 张韩杰，闫艳春 （山东农业大学生命科学学院，271018） 摘 要：农药在人类防治农作物病虫害、草害等诸方面起到了巨大的贡献，但是因之而来的农药残留问题则对 环境和人类健康带来了严重的危害。为解决这一问题，人们进行了大量的研究，其中微生物的降解作用已引起人们的广泛关注。综述了农药残留及微生物在其中的应用及发展情况。 关键词：农药；残留；降解；微生物中图分类号：$481.1+8 文献标识码：B 农药是人们主动投放于环境中数量大、毒性广 的一类化学物质。［12］在过去几十年中，有机氯、有机 磷等农药的开发与应用曾为人类在农、林业防治病虫害，提高农作物产量中起到了不可磨灭的作用。但对那些性质比较稳定、难于分解消失有毒农药的长期、大量使用，已造成严重的全球性环境污染和生态破坏。近年来，由于人们对环境和生态平衡的日益重视，相继提出了“软农药”（so ft p estici des ） 和“抑菌剂”（f un g istatic ） 等概念［9］，生物农药也引起了人们的广泛兴趣，但就目前的科技水平来看，化学农药在很长的一段时间内还是不可替代的，因此解决环境中存在的农药残留问题已经成为世界各国的研究热点。微生物在其中的作用已引起广泛关注，我国科研工作者针对这一问题进行了大量探索。随着生物技术的迅猛发展，应用微生物进行生物修复已成为环境修复的一个重要内容，本文拟对我国农药残留情况以及微生物在农药降解中的应用作一综述。1农药残留及其危害1.1 农药残留 农药作为目前农业增产的主要依靠，在农业中具有广泛的应用。目前我国农药的施用方法仍以药 液喷洒和粉剂喷洒为主。研究表明［6］：施用农药 后，仅有1%!2%的药作用于防治对象本体，有 10%!20%附着在作物本体上，其他80!90%的农 药主要散落在农作物的周边环境，如农田、土壤或漂浮于大气，与尘埃吸附形成气溶胶。试用后的农药经过一段时间的降解、代谢等作用后，其含量会降低到一定的水平，通常，我们把残存在环境中和生物体内的微量农药称作残留农药，它包括农药原体残留量及其具有比原体毒性更高或相当毒性的降解物的残留量。农药残留不仅造成环境污染、妨碍生物生长，而且直接或间接地危害人体健康，这已引起世界各国的广泛关注。 自泰勒等人发现DDT 的高效杀虫能力以来，不同种类的农药相继得到了开发和应用。仅杀虫剂类目前就有4类：有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类。有机氯类农药是高残留、生物富集性很强的一类农药，目前已被禁止生产，但由于已被广泛大量地使用了多年，因此在环境仍有残留，对环境和人的威胁还很大。有机磷类、拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类农药尽管残留期较短，但仍有一定时间的残留期，加之被广泛使用，仍对土壤、大气和水源等造成了不同程度的污染。我国科研工作者对于农药的残留情况进行了大量的研究。谢恩平 等［18］对氨基甲酸酯类农药（克百威、丙硫克百威和 丁硫克百威）在环境中的残留进行了检测，并探讨了 残留性的影响因素；张莹、杨大进等 ［24］对我国食品中有机氯农药的残留水平进行了细致的分析；覃泰 群等［10］对拟除虫菊酯类农药进行了残留分析；杨大 ? 13?湖北植保2004年第1期
第五章微生物与发酵工程【菜单】
【精解】 例1．所有细菌都是（） A．异养型 B．寄生 C．腐生 D．以上都不对 解析：细菌的代谢类型和生活方式多种多样，既有化能自养，如硝化细菌，又有光能自养，如光合细菌，还有很多细菌是异养型生物，如大肠杆菌。有的细菌营腐生生活，在生态系统中是分解者，如圆褐固氮菌，有的细菌营寄生生活，在生态系统中是消费者，如使人致病的结核杆菌。所以，关于细菌的代谢类型和生活方式不能一概而论。答案选D。 例2．控制细菌合成抗生素性状的基因，控制放线菌主要遗传性状的基因，控制病毒抗原特异性的基因依次位于（） ①核区大型环状DNA上②质粒上③细胞核染色体上④衣壳内核酸上 A．①③④ B．①②④ C．②①③ D．②①④ 解析：细菌的核区里有一个大型环状的DNA分子，细胞质的质粒也是小型的环状DNA分子。其中，大部分的性状由核区DNA上的基因控制，而控制细菌合成抗生素的基因、抗药性基因和固氮基因等却在质粒上；放线菌也是原核生物，核区内也有大型的DNA分子，控制着放线菌主要的遗传性状，病毒的基因只在核酸上，而蛋白质外壳没有基因。以上三类生物都没有染色体。答案选D。 例3．“非典”的病原体SARS病毒是RNA病毒，据报道，SARS疫苗的研究已取得突破性进展，
不久将进行临床实验。下列关于SARS病毒及疫苗的叙述正确的是（） A．SARS病毒的遗传物质的组成中含有5种碱基，8种核苷酸 B．接种SARS疫苗能增强人体免疫力是因为接种了SARS抗体 C．可用含碳源、氮源、生长因子、水、无机盐的普通培养基培养SARS病毒 D．决定其抗原特异性的是SARS病毒的衣壳 解析：SARS病毒是RNA病毒，因此组成它遗传物质的碱基有A．U．C．G4种，只有4种核苷酸。而病毒只能寄生在活细胞内，因此，用普通培养基是不能培养病毒的；决定病毒抗原特异性的是衣壳部分。若SARS疫苗研制成功，它可能是经过处理的已经没有毒性或毒性极弱的SARS 病毒或者是其衣壳部分，注入人体能起到抗原作用，即能刺激人体产生抗体；因此，接种的是抗原而不是抗体。本题容易错选为C，主要是没有正确掌握病毒的生活方式。答案选D 例4．下列关于病毒的叙述，正确的是（） A．病毒都含单链RNA或单链DNA B．侵染宿主细胞前，病毒自身不带有任何酶 C．病毒结构成分中只有蛋白质和核酸 D．病毒结构中有时可能装配有寄主细胞中的某些成分 解析：病毒的核酸只有一类，有的是DNA，有的RNA；有的病毒DNA是双链的，有的病毒DNA 是单链的。有的病毒RNA是单链的，也有的病毒RNA是双链的；有的病毒在侵染宿主细胞前带有一些酶，如艾滋病病毒自身带有逆转录酶，T2噬菌体带有溶菌酶。简单的病毒如烟草花叶病毒的结构成分只有蛋白质和核酸，而有些病毒如流感病毒除了核衣壳外，还带有囊膜，因此，组成成分中除了蛋白质和核酸外，还有少量脂质和糖类。所以，病毒结构成分不是只有蛋白质和核酸。因为，衣壳和核酸的组装在寄主细胞中进行，所以，有时可能装配有寄主细胞中的某些成分。答案选D 例5．下列有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（） A．作为碳源的物质不可能同时是氮源 B．凡是碳源都能提供能量 C．除水以外的无机物只提供无机盐 D．无机氮源也能提供能量 解析：碳源是指能给微生物提供碳元素的物质，而氮源是指能给微生物提供氮元素的物质，有的物质如氨基酸中，即有碳元素又有氮元素，因此可作为异养微生物的碳源和氮源。自养微
什么是碳源、氮源？ 碳源 碳源是微生物生长一类营养物，是含碳化合物。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸及有机酸酯和小分子醇。根据微生物所能产生的酶系不同，不同的微生物可利用不同的碳源。 碳源对微生物生长代谢的作用主要为提供细胞的碳架，提供细胞生命活动所需的能量，提供合成产物的碳架。 氮源 作为构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的材料。把从外界吸入的氮素化合物或氮气，称为该生物的氮源。能把氮气作为氮源的只限于固氮菌、某些放线菌和藻类等。高等植物和霉菌以及一部分细菌，仅能以无机氮素化合物为氮源。动物和一部分细菌，不用有机氮化合物作为氮源就不能生长。 作为植物的氮源最重要的是无机化合物的硝酸盐和氨盐。硝酸盐一般需还原成氨盐后才能进入有机体中，但由于生物的性质和环境条件的不同，作为氮源来说，有时氨盐适宜，有时硝酸盐适宜。如浓度适宜，亚硝酸盐、羟胺等也可作为氮源。作为氮源的有机化合物有氨基酸、酰胺和胺等。特殊的细菌，也有时需要以极其特殊的氮素化合物作为唯一的氮源来进行培养。 碳源和氮源的合理性 合理的碳源和氮源，直接影响作物的生长，碳源含量高，作物生长受到抑制，根系生长比较快，茎叶收到缓慢，可能直接降低作物的茎秆高度等。氮源含量，作物发生旺长，叶片茎秆生长有劲，可能提高作物之身的高。碳源和氮源合理，作物生长平稳，根系和果实、叶片都处在健康状态。 碳氮比一般在25:1比较合理，因此，合理补充土壤中的碳源、氮源比较关键，部分碳源由作物腐烂的茎叶和根系来补充，氮源由植物吸收空气的中的氮作物补充。但是，碳源来源不稳定，根据作物的收货的目的，碳源一般比较缺乏，补充碳源可以选择标美力克肥业有限公司“碳神奇”作为碳源补充剂，提高土壤中碳源的含量，增加土壤团粒结构。
二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法 1．主题内容与适用范围 本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。 2．方法提要 土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K 2SO 4 溶液浸提，提取液一部分用K 2 CrO 7 （重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H 2SO 4 消煮、碱化蒸馏法测定微生 物量氮。 3．提取液的制备 3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量： 0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的 冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜 3.2试剂的制备：0.5 M K 2SO 4 溶液（化学纯）、 无醇氯仿（提纯方法：用1N H 2SO 4 溶液与氯仿(CHCl 3 三氯甲烷)按体积比2:1 于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1 混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无 水硫酸钠，保存） 3.3分析步骤： 3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。 另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。 3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。用注射器注入每 瓶50ml 0.5M K 2SO 4 溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸 过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。 4．生物量碳的测定—K 2CrO 7 氧化法 4.1仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、1500W电炉两 个、变压器两个、滴定管（25ml） 4.2试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K 2CrO 7 标准溶 液 邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N）K 2CrO 7 溶液（19.6125g/L，分析纯） 0.02M (NH 4) 2 Fe(SO 4 ) 2 溶液：取15.69g/L溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸（98%， 分析纯）酸化，而后定容至1L、4.3分析步骤： 4.3.1吸取2ml 0.4 N K 2CrO 7 溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加入等量的 玻璃球（约一小药匙，10个）。吸取步骤（3.2.2）中的过滤液8~10ml（根据含碳量多少而
微生物的营养类型 1. 内容 根据微生物生长所需要的主要营养要素即能源和碳源以及电子供体的不同，微生物的营养类型可分为：光能无机自养型、光能有机异养型、化能无机自养型、化能有机异养型。 1.光能无机自养型：以光作为能源，以CO2为基本碳源，还原CO2的氢供体是还原态无机化合物（H2O、H2S或Na2S2O3等）。 2.光能有机异养型：以光为能源，以有机碳化合物（甲酸、乙酸、丁酸、甲醇、异丙醇、丙酮酸和乳酸等）作为碳源与氢供体营光合生长，在只有无机物的环境中不能生长，所以有别于利用CO2作为唯一碳源的自养型。 3.化能无机自养型：利用无机化合物氧化过程中释放出的能量，并以CO2为碳源。它们能在完全无机的环境中生长。 4.化能有机异养型：以有机碳化合物作为能源，碳源和氢供体也是有机碳化合物。有机碳化合物是兼有能源与碳源功能的双重营养物。如淀粉、蛋白质等大分子物质以及单糖、双糖、有机酸和氨基酸等简单有机物。 营养缺陷型：某些菌种发生突变（自然突变或人工诱变）后，失去合成某种（或某些）对该菌株生长必不可少的物质（通常是生长因子如氨基酸、维生素）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。相应的野生型菌株称为原养型。 2. 练习 一、选择题 1. 大多数微生物的营养类型属于：（） A. 光能自养 B. 光能异养 C. 化能自养 D. 化能异养 答案：D 2．蓝细菌的营养类型属于：（） A．光能自养 B. 光能异养 C．化能自养 D. 化能异养 答案：A 3. 自养型微生物和异养型微生物的主要差别是：（） A. 所需能源物质不同 B. 所需碳源不同 C. 所需氮源不同 答案：B 二、填空 1. 光能自养菌以__________作能源，以__________作碳源。
长沙环境保护职业技术学院毕业论文小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 姓名： 学号： 606073119 指导教师姓名：蔡水文老师 指导教师姓名：吕立获生物技术部主管 浙江普洛家园医药科技有限公司系部名称：环境科学系 专业名称：生物技术及应用 班级名称：0731班 论文提交日期：2010年6月12号
目录 摘要 (3) 引言 (4) 1实验部分 (4) 1.1 实验材料 (4) 1.2 培养过程 (4) 1.3 测定方法 (5) 2 结果与分析 (5) 2.1 50 L发酵罐培养结果与分析 (5) 3 结论 (9) 参考文献 (9) 致谢 (10)
摘要 单细胞绿藻在医疗保健、环境保护、生物能源领域等众多领域由很大的用途，并且具有很大的经济效益。但是现在在的小球藻生产工艺还欠成熟，主要问题是其产量不高发酵周期较长，因此如何高效培养出超高细胞浓度小球藻各个企业与实验室想突破的问题。小球藻培养是一个具有高度非线性、时变性和迟滞性的过程，其内在机理非常复杂，传统的培养方法难以实现对小球藻高产的目的，因此对培养、发酵过程进行优化培养很困难。本文主要研究的是对小球藻培养过程中流加与不流加葡萄糖、硝酸钾对小球藻发酵的影响。经过实验结果得知在对数生长期控制葡萄糖浓度与硝酸钾浓度在20g/L、2.2-2.5g/L可以大大提高生长速率与产量。 关键词：小球藻培养；流加；葡萄糖；硝酸钾
小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 引言 单细胞绿藻在水产养殖、环境保护、人类健康食品和重要生命活性物质生产等众多领域的研究与应用得到不断扩展，而如何高效培养出超高细胞浓度小球藻来满足各个应用领域的需要是我国急待解决的藻类生物技术关键课题。本文主要针对小球藻的发酵培养流加碳源与氮源的研究，从而得出最佳流加浓度培养条件达到高产的目的。 1实验部分 1.1实验材料 实验所用菌种是由华中理工大学提供，实验过程中采用食品级葡萄糖和分析纯硝酸钾分别作为小球藻生长的碳源和氮源，其他所用试剂均为分析纯。 1.2 培养过程 首先采用三角瓶，在温度30℃和摇床转速200 r／rain条件下异养批量培 养小球藻，培养3d左右后收获直接作为50 L半自控发酵罐的藻种。 在批量和发酵培养过程中所用培养基成分和含量均由华中理工大学自主研制，初始pH为6．50左右。根据小球藻的不同生长期，采用700 g／L葡萄糖不同量的流加，氮源、微量元素适情况添加。 实验所用培养基和容器均经过121℃、30min的高温、高压灭菌，发酵培养的控制条件是：温度为30℃，灌压0.05Mp,50L、1.5 m3／(L·h) ，培养过程中根据所消耗氧的量来调节通气量和电机频率进而提高氧的含量液中（培养液中氧的含量不低于20%，否则无法正常生长），调一次通气量调一电机频率，交替进行。
第18卷第1期2004年2月 水土保持学报 Journal of So il and W ater Conservati on V o l.18N o.1 Feb.,2004 氮磷肥对黑土玉米农田生态系统土壤微生物量碳、氮的影响Ξ 王继红1,2,刘景双1,于君宝1,王金达1 (1.中国科学院东北地理与农业生态研究所,长春130021;2.吉林农业大学,长春130118) 摘要:通过田间氮磷肥配施试验研究了氮磷配施对黑土玉米农田生态系统玉米不同生育时期微生物量碳、氮的 影响。微生物量随玉米不同生育期的动态变化表明,氮磷肥对微生物量碳和微生物量氮的动态影响并不同步,微 生物量碳和微生物量氮变化最显著的时期均是授粉期,但此时微生物量碳是最低的谷值,而微生物量氮是最高的 峰值。不同氮磷配比对微生物量碳影响的回归分析表明,氮肥是影响微生物量碳的主导因素,无论是适量施用还 是过量施用都是氮肥对微生物量碳的影响较大。不同氮磷配比对微生物量氮影响的回归分析表明,过量氮肥的施 用减少了土壤微生物量氮的含量。磷肥无论高量和低量均能增加微生物量氮的含量,但随着施用量的增加对微生 物量氮的正效应减小。氮磷配合施用可增加土壤的微生物量氮,由此可见无论单施氮肥还是单施磷肥,过量施用 对微生物量氮的增加都是不利的,只有氮磷配合施用才是增加土壤微生物量氮的有效途径。 关键词:玉米; 黑土; 农田生态系统; 氮磷肥; 土壤微生物量 中图分类号:S154.3;S143.1;S143.2 文献标识码:A 文章编号:100922242(2004)0120035204 Effect of Fertil iz i ng N and P on So il M icrob i a l B ioma ss Carbon and N itrogen of Black So il Corn Agroecosystem W AN G J i2hong1,2,L I U J ing2shuang1,YU Jun2bao1,W AN G J in2da1 (1.Institu te of N ortheast Geog rap hy and A g ricu ltu re E cology,Ch inese A cad e m y of S ciences,Chang chun130021; 2.J ilin A g ricu ltu ral U niversity,Chang chun130118) Abstract:A field experi m en t w as conducted to study the effects by m atch fertilizer N and P on m icrob ial b i om ass C and N of b lack so il agroeco system.T he resu lt of the variati on of m icrob ial b i om ass in differen t grow th p eri ods show s that the effects of fertilizer N and P on m icrob ial b i om ass C is no t sam e as on m icrob ial b i om ass N,incubati on peri od is the m o st obvi ou sly varied peri od of m icrob ial b i om ass C and N,the m icrob ial b i om ass C is at its low est bu t m icrob ial b i om ass N is at its h ighest.T he regressi on analysis indicated that fer2 tilizer N is the m ain facto r in affecting the m icrob ial b i om ass C,It show ed that the excessive u se of fertilizer N decrease the con ten t of m icrob ial b i om ass N,and fertilizer P can increase the con ten t of m icrob ial b i om ass N though it w as app lied p rop erty o r excessive,the effect decrease fo llow the increase of u se the fertilizer P. T he m atch of fertilize N and P can increase the m icrob ial b i om ass N,so w e can say that it is no t a effective w ay in increase the quan tity of m icrob ial b i om ass N by app lying fertilizer N o r fertilizer P singly,the effec2 tive w ay to increase so il m icrob ial b i om ass N is by m atch app lying of N and P Key words:co rn; b lack so il; agroeco system; fertilizer N and P; so il m icrob ial b i om ass 土壤施入化学肥料后,土壤微生物与植物之间存在既相互依存又相互制约的关系。微生物不但能把有机养分矿化为植物可利用的无机养分,还可通过同化作用保存一部分养分。与此同时微生物不仅在矿化同化过程中造成养分的损失,有时还存在着与植物争夺有效的无机养分。土壤微生物是土壤有机质和土壤养分转化循环的动力,而土壤微生物量C、N是土壤碳素和氮素养分转化和循环研究中的重要参数,它们较为直观地反映了土壤微生物和土壤肥力状况。因此土壤微生物量对了解土壤养分转化、循环具有重要的意义[1]。同时由于微生物生长繁殖所需的最适温度、湿度及养分条件与植物相似,故可以综合反映土壤的肥力和环境质量状况[2]。因此土壤微生物量的研究近年来已经成为养分循环和生态环境保护方面研究的热点[3～6]。 本文研究了不同氮磷配比条件下玉米不同生育期、微生物量C、N的变化,了解氮磷肥向农田生态系统的输入对碳、氮循环以及环境后果的作用,为寻求适合的氮磷肥配比和用量,使作物既有较高的产量又能保持较好的土壤环境质量。 Ξ收稿日期:2003211220 基金项目:国家重大基础规划项目(1999011804-05)和吉林省科技厅资助项目(20020666) 作者简介:王继红,女,生于1966年,副教授,在读博士。主要从事土壤环境生态方面的研究工作。
微生物：一切肉眼看不见或者看不清的，必须借助显微镜观察和研究的微小生物的总称。 混合培养物：含有多种微生物的培养物。 纯培养物：只有一种微生物的培养物。 二元培养物：培养物中含有二种微生物，而且有意思地保持二者直接的特定的关系的培养物。 分辨率：指辨别两点之间最小距离的能力。 反差：指样品区别于背景的程度。 菌落：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 平板：即培养平板，融化的固体培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板，用于分离、培养微生物。 原核微生物：是指一大类细胞核无核膜包裹，只有称作核区的裸露DNA的原始单细胞生物。包括细菌和古生菌两大类。 古生菌：在进化谱系上与细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与细菌较为接近，同属于原核生物。 细胞壁：是位于细胞最外的一层厚实、坚韧的外被，主要由肽聚糖构成，有固定细胞外形和保护细胞等多种生理功能。 脂多糖：位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物A、O--核心多糖和特异侧链或称O-多糖或O-抗原）三部分组成。 L型细菌：细菌在某些环境条件下（实验室或宿主体内）通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异型。 原生质体：在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。 球状体：和原生质体的处理方法相同，是针对革兰氏阴性细菌处理后而获得的残留部分细胞壁（外壁层）的球形体。 支原体：在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。因它的细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇，所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度。 细胞质膜：又称质膜、细胞膜或内膜，是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约7～8 nm，由磷脂（占20%～30%）和蛋白质（占50%～70%）组成。 芽孢：某些细菌在其生长发育后，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢。 微管二联体：由A、B两条中空亚纤维组成，A是完全微管，13个微管蛋白亚基组成，B是10个，与A共用3个亚基。A上伸出两条动力蛋白臂（能被Ca2+、Mg2+激活的ATP酶），水解ATP，提供鞭毛运动能量。 鞭毛与纤毛：有些真核微生物细胞表面长有或长（长者叫鞭毛）或短（短的叫纤毛）的毛发状细胞器，具有运动功能。 细胞核：真核生物都有形态完整，有核膜包裹的细胞核，对细胞的生长、发育、繁殖和遗传、变异起着决定性的作用。 核被膜：核被膜由核膜和核纤层组成，其上有许多核膜孔。核膜孔是细胞核与细胞质进行物质交换的选择性通道。核膜由两层膜组成，两膜中间叫核周间隙。核纤层位于核膜内侧，成分为核纤层蛋白。 营养物质:那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质。 营养：微生物获得和利用营养物质的过程。 迟效氮源：蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用，这种氮源叫迟效氮源。 速效氮源：无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源。 营养缺陷型：多数微生物可以利用无机含氮化合物作为氮源，也可以利用有机含氮化合物作为氮源。但有些微生物没有将无机氮合成有机氮的能力，它们不能把尿素、铵盐等这些无机氮源自行合成他们生长所需的氨基酸，而需要从外界吸收现成的氨基酸作为氮源才能生长，这类微生物叫做氨基酸异养型微生物，也叫营养缺陷型。微量元素：是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要
1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪 一、方法原理 土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。 1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。 2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。 直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。 二、主要仪器 振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。 二、试剂 1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。 2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57g分析纯K2SO4定溶至1L。 四、操作步骤 称取过2mm筛的新鲜土样12.5g六份，置于小烧杯中。将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。 将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30min，过滤。未熏蒸土样操作相同，同时做空白。 五、结果计算 土壤微生物量碳 =（熏蒸土壤有机碳-未熏蒸土壤有机碳）/0.45 式中：0.45——将熏蒸提取法提取液的有机碳增量换算成土壤微生物生物量碳所采用的转换系数（kEc)。 一般量容法采用的kEc值为0.38，仪器分析法kEc 取值0.45。 六、注意事项 1．氯仿致癌，操作时应在通风厨中进行。 2．打开真空干燥器时，要听声音，如没空气进去的声音，试验需重做。 3．应注意试剂的厂家，有些厂家的K2SO4试剂不宜浸提土壤微生物量碳。 4．浸提液应立即用TOC-V CPH有机碳分析仪测定或在-18℃下保存。 1.23.2土壤微生物量氮的测定 一、方法原理 土壤微生物态氮是土样在CHCl3熏蒸后直接浸提氮含量，并进行测定，以熏蒸和不熏蒸