【导与练】2015届高考生物一轮总复习 1.比较微生物的碳源和氮源
教师用书配套素材
考点归纳
1.比较微生物的碳源和氮源
营养要素来源最适来源功能
碳源自养型微生物
无机碳源(CO2、NaHCO3、
CaCO3等含碳无机物)
异养型微生物
有机碳源(即含碳有机
物):糖、脂类、蛋白质、
有机酸等和天然含碳物
质(石油)
糖类(尤其是
单糖),其次
是醇类、有机
酸、脂类
(1)用于构成微生物
的细胞物质和一些
代谢产物;(2)既是
碳源又是能源
氮源氨基酸自养型(将非氨
基酸类的简单氮源合
成所需的氨基酸,如所
有的绿色植物和很多
的微生物)
无机氮:NH3、铵盐、硝
酸盐、N2
铵盐、硝酸盐
将无机氮合成菌体
蛋白或含氮的代谢
产物(如氨基酸等)
氨基酸异养型(从外界
吸收现成的氨基酸,包
括所有的动物和大量
异养型微生物)
有机氮:复杂蛋白质(如
牛肉膏、蛋白胨)、核酸、
尿素、一般氨基酸
复杂蛋白质、
核酸
合成微生物的蛋白
质、核酸等
1
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生 物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 操作步骤 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 熏蒸 称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完
全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法） 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 基本原理（茚三酮比色法）
土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用·L-1K 2SO 4 提取液提取 的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物 碳的基本方法：该方法用·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取 液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换 系数K EC (取值来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为（Vance等，1987）和（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不 同，其值变化为（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表 明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层0-20cm土壤的K EC 为，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（·L-1）：取分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法） 1、试剂配制 去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。 硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。 六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。 过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。 磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。 邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。 2、仪器设备 土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。 1–真空干燥器，2–装土壤烧杯，3–装氯仿烧杯4–磨口三通活塞5–真空表 6–缓冲瓶7–抽真空管8–增压泵9–控制开关10–进水口11–出水口 （图6–1 土壤熏蒸抽真空装置） 3、操作步骤 （1）土样前处理 新鲜土样应立即进行前处理或保存于4℃冰箱中。测定前先仔细除去土样中可见的植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2mm）并混匀。如土样过湿，应在室内适当风干至土样含水量约为田间持水量（Water-holding capacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不
§1 微生物的营养要求P75 营养：微生物摄取和利用营养物质的过程。 营养物质：能满足微生物生长、繁殖和进行各种生理活动需要的物质。 微生物细胞培养收集湿菌体 烘干至恒重 干细胞灰分 无机物（盐） 有机物 蛋白质、糖、脂类、核酸、 维生素等及其降解物 分析方法：课本P79水分：70－90％离心、过滤、洗涤高温烘干105℃；低温真空干燥；红外线快速烘干。550℃焚烧 一、微生物细胞 的化学组分 2.细胞化合物的组成： 糖类、脂类、蛋白质、水、无机盐、生长因子、核酸 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” 3.化学元素组成： 主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁 微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” 4.微生物细胞的化学组分特点 (1)、不同的微生物细胞化学组分不同 （2）、同一种微生物在不同的生长阶段，其化学组分也有差异 二、营养物质及其生理功能 P76 1.根据营养物质在机体中的生理功能不同进行分类 五大类（武大）：碳源、氮源、水、无机盐、生长因子 六大类（周德庆）:碳源、氮源、水、无机盐、生长因子、能源 1、碳源(carbon source) 为微生物提供碳素来源的物质。 1、功能 （1、构成微生物细胞物质，如糖、蛋白质、核酸等
（2、形成代谢产物，如酒精、乳酸等 （3、提供生命活动的能源 2、可作碳源的物质（P80表4－2） 糖类，蛋白质，有机酸，醇类，脂类，烃，CO2，碳酸盐等 碳源谱 必须利用有机碳源无机碳源为（唯一）主要碳源 自养微生物 异养微生物 最适碳源糖类优于其它化合物 单糖优于双糖、多糖 己糖优于戊糖 葡萄糖、果糖优于其他己糖 同一微生物对不同碳源的利用差别－速效碳源和迟效碳源 如葡萄糖和半乳糖同时存在于培养基中时，大肠杆菌先利用葡萄糖（速效碳源），再利用半乳糖（迟效碳源） 不同微生物的碳源谱相差很大 双功能营养物异养微生物的碳源兼作能源 2、氮源(nitrogin source) 为微生物提供氮素来源的物质。 1、功能 （1、构成微生物含氮物质，如蛋白质、核酸等 （2、形成代谢产物，如谷氨酸等 (3、一般不做能源 2、可作氮源的物质（P81表4－3） 蛋白质及其降解物（胨、肽、氨基酸）、硝酸盐、氨盐、N2、尿素、嘌呤、嘧啶、氰化物等 3、异养微生物氮的利用顺序 C.H.O.N> C.H.O.N.x >N.H > N.O 培养基中最常用的有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏 3、速效氮源和迟效氮源 实例：土霉素发酵生产中添加的玉米浆和花生饼粉 玉米浆：以较易吸收的蛋白质降解产物形式存在，易被利用（速效氮源） 花生饼粉：以大分子蛋白质形式存在，不易被利用（迟效氮源） 发酵生产中的作用不同：前者有利于菌体生长，后者有利于代谢产物形成保持适当的比例，协调菌体生长期和产物形成期，提高土霉素的产量 4、生理酸性盐与生理碱性盐： 以(NH4)2SO4等氨盐作为氮源培养微生物时，由于NH4+被吸收，会导致培养基的pH下降，因而将其称为生理酸性盐； 以NO3-为氮源培养微生物时，由于NO3-被吸收，会导致培养基pH升高，因而将其称为生理碱性盐。 3、无机盐（mineral salts 大量元素：Ca、K 、Mg、Fe等生长所需浓度在10－3-10－4mol/l 微量元素:Zn、Cu、Mn、Co、Mo等生长所需浓度在10－6-10－8mol/l
枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选 ========= （+++++农业与生物技术学院++ 111111） 摘要：本实验通过福林试剂法检测枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶的活性，旨在筛选出培养枯草芽孢杆菌时的最优碳源和掌握培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制，为今后进一步提高枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶提供可靠地参考数据。 关键词：酶活、最优碳源、碱性蛋白酶。 引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力[4]。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口
[6]。本实验通过碳源优化枯草芽孢杆菌发酵培养基和探究培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。 1.材料与方法 1.1菌株：枯草芽孢杆菌 1.2材料与试剂 酪氨酸、福林试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙、酵母浸粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、蛋白胨 1.3仪器与设备 恒温水浴锅、分光光度计、高速离心机、摇床、超净工作台、15L 发酵罐、PHS-25型酸度计、振荡培养箱、压力灭菌锅。 1.4 培养基 种子培养基(g/L)：胰蛋白栋5g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 18g/L ,pH 值自然，121℃蒸气灭菌20min； 发酵培养基(g/L)：酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，115℃与发酵罐一起进行实消，20min。 1.5方法 1.5.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌的影响 1.5.1.1配制培养基（20mL/150mL） 准确秤取0.2g酵母浸粉、0.06g柠檬酸钠、0.2g磷酸氢二钾、0.06g 氯化钙5份分别加入0.6g蔗糖、0.6g麦芽糖、0.6g葡萄糖、1.1g乳
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制： (1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、 五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶 解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体 积比100:2加入混合指示剂） (5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加 热）定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗 中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。 2.试验步骤：。 （1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。 （2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算
二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法 1．主题内容与适用范围 本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。 2．方法提要 土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K 2SO 4 溶液浸提，提取液一部分用K 2 CrO 7 （重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H 2SO 4 消煮、碱化蒸馏法测定微生 物量氮。 3．提取液的制备 3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量： 0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的 冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜 3.2试剂的制备：0.5 M K 2SO 4 溶液（化学纯）、 无醇氯仿（提纯方法：用1N H 2SO 4 溶液与氯仿(CHCl 3 三氯甲烷)按体积比2:1 于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1 混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无 水硫酸钠，保存） 3.3分析步骤： 3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。 另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。 3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。用注射器注入每 瓶50ml 0.5M K 2SO 4 溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸 过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。 4．生物量碳的测定—K 2CrO 7 氧化法 4.1仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、1500W电炉两 个、变压器两个、滴定管（25ml） 4.2试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K 2CrO 7 标准溶 液 邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N）K 2CrO 7 溶液（19.6125g/L，分析纯） 0.02M (NH 4) 2 Fe(SO 4 ) 2 溶液：取15.69g/L溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸（98%， 分析纯）酸化，而后定容至1L、4.3分析步骤： 4.3.1吸取2ml 0.4 N K 2CrO 7 溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加入等量的 玻璃球（约一小药匙，10个）。吸取步骤（3.2.2）中的过滤液8~10ml（根据含碳量多少而
微生物的营养类型 1. 内容 根据微生物生长所需要的主要营养要素即能源和碳源以及电子供体的不同，微生物的营养类型可分为：光能无机自养型、光能有机异养型、化能无机自养型、化能有机异养型。 1.光能无机自养型：以光作为能源，以CO2为基本碳源，还原CO2的氢供体是还原态无机化合物（H2O、H2S或Na2S2O3等）。 2.光能有机异养型：以光为能源，以有机碳化合物（甲酸、乙酸、丁酸、甲醇、异丙醇、丙酮酸和乳酸等）作为碳源与氢供体营光合生长，在只有无机物的环境中不能生长，所以有别于利用CO2作为唯一碳源的自养型。 3.化能无机自养型：利用无机化合物氧化过程中释放出的能量，并以CO2为碳源。它们能在完全无机的环境中生长。 4.化能有机异养型：以有机碳化合物作为能源，碳源和氢供体也是有机碳化合物。有机碳化合物是兼有能源与碳源功能的双重营养物。如淀粉、蛋白质等大分子物质以及单糖、双糖、有机酸和氨基酸等简单有机物。 营养缺陷型：某些菌种发生突变（自然突变或人工诱变）后，失去合成某种（或某些）对该菌株生长必不可少的物质（通常是生长因子如氨基酸、维生素）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。相应的野生型菌株称为原养型。 2. 练习 一、选择题 1. 大多数微生物的营养类型属于：（） A. 光能自养 B. 光能异养 C. 化能自养 D. 化能异养 答案：D 2．蓝细菌的营养类型属于：（） A．光能自养 B. 光能异养 C．化能自养 D. 化能异养 答案：A 3. 自养型微生物和异养型微生物的主要差别是：（） A. 所需能源物质不同 B. 所需碳源不同 C. 所需氮源不同 答案：B 二、填空 1. 光能自养菌以__________作能源，以__________作碳源。
碳源物质 凡是可以被微生物利用，构成细胞代谢产物碳素来源的物质，统称为碳源物质，碳源物质通过细胞内的一系列化学变化，被微生物用于合成各种代谢产物。 微生物对碳素化合物的需求是极为广泛的，根据碳素的来源不通，可将碳源物质氛围无机碳源物质和有机碳源物质。糖类是较好的碳源，尤其是单糖（葡萄糖、果糖），双糖（蔗糖、麦芽糖、乳糖），绝大多数微生物都能利用。此外，简单的有机酸，氨基酸，醇类，醛，酚等含碳化合物也能被许多微生物利用。所以我们在制作培养基时常加入葡萄糖，蔗糖作为碳源。淀粉、果胶、纤维素等，这些有机物质在细胞内分解代谢提供小分子碳架外，还产生能量供合成代谢需要的能量，所以部分碳源物质既是碳源物质，同时又是能源物质。 在微生物发酵工业中，常常根据不通微生物的需求，利用各种农副产品如：玉米粉、米糠、麦麸、马铃薯、甘薯以及各种野生植物的淀粉，作为微生物生产廉价的碳源。这类碳源往往包含了几种营养要素。 氮源物质 微生物细胞中大约含氮5%~13%，它是微生物细胞蛋白质和核酸的主要成分。氮素对微生物的生长发育有着重要的意义，微生物利用它在细胞内合成氨基酸和碱基，进而合成蛋白质，核酸等细胞成分，以及含氮的代谢产物。无机的氮源物质一般不提供能量，只有极少数的化能自养型细菌如：硝化细菌可以利用铵态氮和硝态氮在提供氮源的同时，通过氧化生产代谢能。 微生物营养上要求的氮素物质可以氛围三个类型： 1、空气中分子态氮只用少量具有固氮能力的微生物（如自生固氮菌、根瘤菌）能利用。 2、无机氮化合物如铵态氮（NH4+），硝态氮（NO3—）和简单的有机氮化物（如尿素），绝大多数微生物可以利用。
3、有机氮化合物大多数寄生性微生物和一部分腐生性微生物需以有机氮化合物（蛋白质、氨基酸）为必需的氮素营养。 在实验室和发酵工业生产中，我们常常以铵盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、血粉、蝉蛹粉、豆饼粉、花生饼粉作为微生物的氮源。
土壤水解性氮的测定(碱解扩散法) 土壤水解性氮，包括矿质态氮和有机态氮中比较易于分解的部分。其测定结果与作物氮素吸收有较好的相关性。测定土壤中水解性氮的变化动态，能及时了解土壤肥力，指导施肥。测定原理 在密封的扩散皿中，用1.8mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液水解土壤样品，在恒温条件下使有效氮碱解转化为氨气状态，并不断地扩散逸出，由硼酸(H3BO3)吸收，再用标准盐酸滴定，计算出土壤水解性氮的含量。旱地土壤硝态氮含量较高，需加硫酸亚铁使之还原成铵态氮。由于硫酸亚铁本身会中和部分氢氧化钠，故需提高碱的浓度(1.8mol/L，使碱保持 1.2mol/L 的浓度)。水稻土壤中硝态氮含量极微，可以省去加硫酸亚铁，直接用1.2mol/L氢氧化钠水解。 操作步骤 1.称取通过18号筛(孔径1mm)风干样品2g(精确到0.001g)和1g硫酸亚铁粉剂，均匀铺在扩散皿外室内，水平地轻轻旋转扩散皿，使样品铺平。(水稻土样品则不必加硫酸亚铁。) 2.用吸管吸取2%硼酸溶液2ml，加入扩散皿内室，并滴加1滴定氮混合指示剂，然后在皿的外室边缘涂上特制胶水，盖上毛玻璃，并旋转数次，以便毛玻璃与皿边完全粘合，再慢慢转开毛玻璃的一边，使扩散皿露出一条狭缝，迅速用移液管加入10ml1.8mol/L氢氧化钠于皿的外室(水稻土样品则加入10ml1.2mol/L氢氧化钠)，立即用毛玻璃盖严。 3.水平轻轻旋转扩散皿，使碱溶液与土壤充分混合均匀，用橡皮筋固定，贴上标签，随后放入40℃恒温箱中。24小时后取出，再以0.01mol/LHCl标准溶液用微量滴定管滴定内室所吸收的氮量，溶液由蓝色滴至微红色为终点，记下盐酸用量毫升数V。同时要做空白试验，滴定所用盐酸量为V0。 结果计算 水解性氮(mg/100g土)= N×(V-V0)×14／样品重×100 式中： N—标准盐酸的摩尔浓度； V—滴定样品时所用去的盐酸的毫升数； V0—空白试验所消耗的标准盐酸的毫升数；14—一个氮原子的摩尔质量mg/mol； 100—换算成每百克样品中氮的毫克数。注意事项(1)滴定前首先要检查滴定管的下端是否充有气泡。若有，首先要把气泡排出。 (2)滴定时，标准酸要逐滴加入，在接近终点时，用玻璃棒从滴定管尖端沾取少量标准酸滴入扩散皿内。 (3)特制胶水一定不能沾污到内室，否则测定结果将会偏高。 (4)扩散皿在抹有特制胶水后必须盖严，以防漏气。主要仪器 扩散皿、微量滴定管、1/1000分析天平、恒温箱、玻璃棒毛玻璃、皮筋、吸管(2ml和10ml)，腊光纸、角匙、瓷盘。 试剂 (1)1.8mol/L氢氧化钠溶液。称取化学纯氢氧化钠72g，用蒸馏水溶解后冷却定容到1000ml。 (2)1.2mol/L氢氧化钠溶液。称取化学纯氢氧化钠48g,用蒸馏水溶解定容到1000ml。 (3)2%硼酸溶液。称取20g硼酸，用热蒸馏水(约60℃)溶解，冷却后稀释至1000ml，用稀盐酸或稀氢氧化钠调节pH至4.5(定氮混合指示剂显葡萄酒红色)。 (4)0.01mol/L盐酸标准溶液。先配制1.0mol/L盐酸溶液，然后稀释100倍，用标准碱标定。 (5)定氮混合指示剂。与土壤全氮的测定配法相同。 (6)特制胶水。阿拉伯胶(称取10g粉状阿拉伯胶，溶于15ml蒸馏水中)10份、甘油10份，饱和碳酸钾5份混合即成(最好放置在盛有浓硫酸的干燥器中以除去氨)。 (7)硫酸亚铁(粉状)。将分析纯硫酸亚铁磨细保存于阴凉干燥处。
第18卷第1期2004年2月 水土保持学报 Journal of So il and W ater Conservati on V o l.18N o.1 Feb.,2004 氮磷肥对黑土玉米农田生态系统土壤微生物量碳、氮的影响Ξ 王继红1,2,刘景双1,于君宝1,王金达1 (1.中国科学院东北地理与农业生态研究所,长春130021;2.吉林农业大学,长春130118) 摘要:通过田间氮磷肥配施试验研究了氮磷配施对黑土玉米农田生态系统玉米不同生育时期微生物量碳、氮的 影响。微生物量随玉米不同生育期的动态变化表明,氮磷肥对微生物量碳和微生物量氮的动态影响并不同步,微 生物量碳和微生物量氮变化最显著的时期均是授粉期,但此时微生物量碳是最低的谷值,而微生物量氮是最高的 峰值。不同氮磷配比对微生物量碳影响的回归分析表明,氮肥是影响微生物量碳的主导因素,无论是适量施用还 是过量施用都是氮肥对微生物量碳的影响较大。不同氮磷配比对微生物量氮影响的回归分析表明,过量氮肥的施 用减少了土壤微生物量氮的含量。磷肥无论高量和低量均能增加微生物量氮的含量,但随着施用量的增加对微生 物量氮的正效应减小。氮磷配合施用可增加土壤的微生物量氮,由此可见无论单施氮肥还是单施磷肥,过量施用 对微生物量氮的增加都是不利的,只有氮磷配合施用才是增加土壤微生物量氮的有效途径。 关键词:玉米; 黑土; 农田生态系统; 氮磷肥; 土壤微生物量 中图分类号:S154.3;S143.1;S143.2 文献标识码:A 文章编号:100922242(2004)0120035204 Effect of Fertil iz i ng N and P on So il M icrob i a l B ioma ss Carbon and N itrogen of Black So il Corn Agroecosystem W AN G J i2hong1,2,L I U J ing2shuang1,YU Jun2bao1,W AN G J in2da1 (1.Institu te of N ortheast Geog rap hy and A g ricu ltu re E cology,Ch inese A cad e m y of S ciences,Chang chun130021; 2.J ilin A g ricu ltu ral U niversity,Chang chun130118) Abstract:A field experi m en t w as conducted to study the effects by m atch fertilizer N and P on m icrob ial b i om ass C and N of b lack so il agroeco system.T he resu lt of the variati on of m icrob ial b i om ass in differen t grow th p eri ods show s that the effects of fertilizer N and P on m icrob ial b i om ass C is no t sam e as on m icrob ial b i om ass N,incubati on peri od is the m o st obvi ou sly varied peri od of m icrob ial b i om ass C and N,the m icrob ial b i om ass C is at its low est bu t m icrob ial b i om ass N is at its h ighest.T he regressi on analysis indicated that fer2 tilizer N is the m ain facto r in affecting the m icrob ial b i om ass C,It show ed that the excessive u se of fertilizer N decrease the con ten t of m icrob ial b i om ass N,and fertilizer P can increase the con ten t of m icrob ial b i om ass N though it w as app lied p rop erty o r excessive,the effect decrease fo llow the increase of u se the fertilizer P. T he m atch of fertilize N and P can increase the m icrob ial b i om ass N,so w e can say that it is no t a effective w ay in increase the quan tity of m icrob ial b i om ass N by app lying fertilizer N o r fertilizer P singly,the effec2 tive w ay to increase so il m icrob ial b i om ass N is by m atch app lying of N and P Key words:co rn; b lack so il; agroeco system; fertilizer N and P; so il m icrob ial b i om ass 土壤施入化学肥料后,土壤微生物与植物之间存在既相互依存又相互制约的关系。微生物不但能把有机养分矿化为植物可利用的无机养分,还可通过同化作用保存一部分养分。与此同时微生物不仅在矿化同化过程中造成养分的损失,有时还存在着与植物争夺有效的无机养分。土壤微生物是土壤有机质和土壤养分转化循环的动力,而土壤微生物量C、N是土壤碳素和氮素养分转化和循环研究中的重要参数,它们较为直观地反映了土壤微生物和土壤肥力状况。因此土壤微生物量对了解土壤养分转化、循环具有重要的意义[1]。同时由于微生物生长繁殖所需的最适温度、湿度及养分条件与植物相似,故可以综合反映土壤的肥力和环境质量状况[2]。因此土壤微生物量的研究近年来已经成为养分循环和生态环境保护方面研究的热点[3～6]。 本文研究了不同氮磷配比条件下玉米不同生育期、微生物量C、N的变化,了解氮磷肥向农田生态系统的输入对碳、氮循环以及环境后果的作用,为寻求适合的氮磷肥配比和用量,使作物既有较高的产量又能保持较好的土壤环境质量。 Ξ收稿日期:2003211220 基金项目:国家重大基础规划项目(1999011804-05)和吉林省科技厅资助项目(20020666) 作者简介:王继红,女,生于1966年,副教授,在读博士。主要从事土壤环境生态方面的研究工作。
微生物：一切肉眼看不见或者看不清的，必须借助显微镜观察和研究的微小生物的总称。 混合培养物：含有多种微生物的培养物。 纯培养物：只有一种微生物的培养物。 二元培养物：培养物中含有二种微生物，而且有意思地保持二者直接的特定的关系的培养物。 分辨率：指辨别两点之间最小距离的能力。 反差：指样品区别于背景的程度。 菌落：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 平板：即培养平板，融化的固体培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板，用于分离、培养微生物。 原核微生物：是指一大类细胞核无核膜包裹，只有称作核区的裸露DNA的原始单细胞生物。包括细菌和古生菌两大类。 古生菌：在进化谱系上与细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与细菌较为接近，同属于原核生物。 细胞壁：是位于细胞最外的一层厚实、坚韧的外被，主要由肽聚糖构成，有固定细胞外形和保护细胞等多种生理功能。 脂多糖：位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物A、O--核心多糖和特异侧链或称O-多糖或O-抗原）三部分组成。 L型细菌：细菌在某些环境条件下（实验室或宿主体内）通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异型。 原生质体：在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。 球状体：和原生质体的处理方法相同，是针对革兰氏阴性细菌处理后而获得的残留部分细胞壁（外壁层）的球形体。 支原体：在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。因它的细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇，所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度。 细胞质膜：又称质膜、细胞膜或内膜，是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约7～8 nm，由磷脂（占20%～30%）和蛋白质（占50%～70%）组成。 芽孢：某些细菌在其生长发育后，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢。 微管二联体：由A、B两条中空亚纤维组成，A是完全微管，13个微管蛋白亚基组成，B是10个，与A共用3个亚基。A上伸出两条动力蛋白臂（能被Ca2+、Mg2+激活的ATP酶），水解ATP，提供鞭毛运动能量。 鞭毛与纤毛：有些真核微生物细胞表面长有或长（长者叫鞭毛）或短（短的叫纤毛）的毛发状细胞器，具有运动功能。 细胞核：真核生物都有形态完整，有核膜包裹的细胞核，对细胞的生长、发育、繁殖和遗传、变异起着决定性的作用。 核被膜：核被膜由核膜和核纤层组成，其上有许多核膜孔。核膜孔是细胞核与细胞质进行物质交换的选择性通道。核膜由两层膜组成，两膜中间叫核周间隙。核纤层位于核膜内侧，成分为核纤层蛋白。 营养物质:那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质。 营养：微生物获得和利用营养物质的过程。 迟效氮源：蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用，这种氮源叫迟效氮源。 速效氮源：无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源。 营养缺陷型：多数微生物可以利用无机含氮化合物作为氮源，也可以利用有机含氮化合物作为氮源。但有些微生物没有将无机氮合成有机氮的能力，它们不能把尿素、铵盐等这些无机氮源自行合成他们生长所需的氨基酸，而需要从外界吸收现成的氨基酸作为氮源才能生长，这类微生物叫做氨基酸异养型微生物，也叫营养缺陷型。微量元素：是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要