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神经系统条件性基因敲除研究进展
徐瑛;周常文
【期刊名称】《中国优生与遗传杂志》
【年(卷),期】2008(16)2
【摘要】近十几年来发展起来的条件性基因敲除技术,克服了传统基因敲除所导致的胚胎期致死等不足,为更精细的基因功能研究创造了条件。
从1996年起该技术开始,应用于神经系统相关基因功能与疾病的研究,研究者以神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠为基础,制备了许多条件性基因敲除小鼠,为神经系统疾病相关基因功能研究及疾病的发生、发展和治疗提供了重要线索。
本文从条件性基因敲除原理,神经系统特异性Cre转基因小鼠的研究,及该技术在神经性疾病中的应用及进展做一简要综述。
【总页数】3页(P1-3)
【关键词】神经系统;条件性基因敲除;Cre转基因小鼠;神经性疾病
【作者】徐瑛;周常文
【作者单位】福建医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学系
【正文语种】中文
【中图分类】R394.3
【相关文献】
1.Presenilin-1/2双基因条件性敲除小鼠作为阿尔兹海默病动物模型的研究进展[J], 薛小琳;王霆;孟博;林龙年;梅兵
2.CGI-58基因条件敲除对小鼠中枢神经系统功能的影响 [J], 孙玉风;尚静;郑震林
3.条件性基因敲除:骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因小鼠的建立和基因型鉴定 [J], 郝海邦;杨承忠;岳碧松
4.神经系统SARM1条件性敲除小鼠的构建及其应用 [J], 项鲁丹;孙焕坤;吴仟;汪伟;黄智慧;于欣
5.神经系统SARM1条件性敲除小鼠的构建及其应用 [J], 项鲁丹;孙焕坤;吴仟;汪伟;黄智慧;于欣
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怎样构建条件性基因敲除小鼠模型？作为研究基因体内实验的利器，基因敲除小鼠对于科研人员来说自然不是一个陌生的领域。
然而，全身性基因敲除的小鼠存在着无法忽视的缺陷，即不能特异性地研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能。
此外，全身性基因敲除小鼠有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩，或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡，或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。
因此，条件性基因敲除小鼠（conditional gene knock out or knock in）应运而生了（well，人就是那么聪明！）。
条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。
它们都是位点特异性重组酶系统。
这里以Cre/LoxP系统为例。
比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。
将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。
此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
LoxP 的方向由中间这8个碱基决定。
这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。
令一个组成部分是Cre重组酶。
它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。
Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。
如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。
跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠的制作方法基因敲除小鼠是一种常用的遗传工具，在科学研究中被广泛应用于功能基因组学和疾病模型研究。
基因敲除是指通过特定技术手段，将小鼠体内的目标基因完全沉默或失活，从而研究该基因在发育、生理以及疾病机制中的功能。
本文将介绍基因敲除小鼠的制作方法，包括设计目标基因的敲除载体、胚胎干细胞的筛选和注射、外显子敲除策略的选择等。
1.设计目标基因的敲除载体敲除载体是嵌入目标基因的重要工具。
它通常包含正向与反向的同源臂（homology arms）以及选择标记（如抗生素抗性基因）。
同源臂的长度通常在2-5 kb之间，确保在同源重组时准确而有效地替代目标基因。
此外，敲除载体中还应该包含可诱导甲基化的Cre-loxP重组体系或者FLP-FRT重组体系，以用于后续的基因定向敲除或基因重新组装。
2.筛选胚胎干细胞胚胎干细胞是从内胚层发育而来的多潜能细胞，可以分化为整个鼠体的各种组织和器官。
敲除载体首先需要通过电转或霰粒枪等手段转染到胚胎干细胞系中。
转染后，胚胎干细胞需要进行抗生素筛选，以过滤未转染的细胞。
为了确保目标基因的敲除率，可以使用增强绿色荧光蛋白（eGFP）等标记基因，通过荧光显微镜观察转染细胞的表达情况。
3.敲除载体注射到小鼠受精卵中一旦确认胚胎干细胞中存在敲除载体，接下来就是将胚胎干细胞植入小鼠受精卵。
这个步骤一般由经验丰富的研究人员或者专业公司进行。
首先，选择合适的受精卵（通常为C57BL/6J小鼠品系），然后利用显微操作技术，将敲除载体注射到受精卵的核酸注入腔。
注射后，将受精卵转入对应营养液中培养一定时间，以期达到最佳着床率。
4.敲除鼠胚移植到配子体内经过培养后，将敲除的胚胎植入雌性激素准备好的代孕小鼠（通常为白色的株系，如ICR）。
移植后，将代孕小鼠继续养育，直至分娩。
5.验证敲除小鼠的敲除效果通过提取敲除小鼠的DNA，可以利用PCR、Southern blot和DNA测序等技术验证敲除效果。
..一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout）常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。
这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。
此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。
该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。
当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠（Knockin）基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。
获得嵌合体及之后品系纯化详细流程：基因敲除其他方法：一、ZFN技术制作基因敲除鼠ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。
随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。
利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
![Tecrl敲除小鼠模型的构建方法及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/d07774a782d049649b6648d7c1c708a1284a0ad9.png)
专利名称：Tecrl敲除小鼠模型的构建方法及其应用
专利类型：发明专利
发明人：侯翠兰,肖婷婷,谢利剑,林舒嘉,郑钧敏,陈顺,邱庆竹申请号：CN202210041961.1
申请日：20220114
公开号：CN114480508A
公开日：
20220513
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种Tecrl敲除小鼠模型的构建方法及其应用，所述Tecrl敲除小鼠模型的构建方法为：A、根据基因敲除的靶点，设计针对Tecrl基因的sgRNA；B、将Cas9mRNA及sgRNA同时注射入实验小鼠的受精卵中，得到Tecrl基因成功敲除的F0代小鼠。
本发明首次构建了一种Tecrl敲除小鼠模型，并发现该先天的小鼠基因缺陷导致小鼠在早期的时候就会出现心脏收缩和舒张功能的受损，为研究左心功能提供了模型。
且该Tecrl敲除小鼠在肾上腺素和咖啡因的诱导下出现了多形性及双向性室速，模拟了临床上CPVT患者在运动或压力状态下出现的临床表现，为儿茶酚胺敏感性室速的病理生理机制研究提供有力的工具。
申请人：上海市儿童医院
地址：200062 上海市普陀区泸定路355号
国籍：CN
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转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
基因敲除小鼠鉴定解读基因敲除小鼠鉴定解读，这事儿就像一场神秘的探索之旅。
咱们先得知道啥是基因敲除小鼠。
简单来说，就好比是在小鼠这个小世界里，我们用特殊的手段把某个基因像拆除小零件一样给去掉了。
这时候的小鼠就成了研究这个基因功能的绝佳模型。
那怎么知道这个基因是不是真的被敲除了呢？这就需要鉴定啦。
鉴定基因敲除小鼠，就像检查一件精心打造的艺术品有没有瑕疵。
一种常见的方法是通过基因测序。
这就像是给小鼠的基因密码本进行逐字逐句的校对。
测序的结果就像是一把钥匙，如果发现原本应该存在的基因片段不见了，那很可能这个基因就被成功敲除了。
不过，这可不是唯一的办法哦。
还有一种办法叫PCR检测。
这PCR检测呀，就像是一场基因的放大镜游戏。
我们通过特定的引物，就像是专门寻找特定宝藏的小钩子，去钓出我们感兴趣的基因片段。
如果在基因敲除小鼠里钓不到这个片段，而在正常小鼠里能钓到，那这也是基因敲除成功的一个标志。
这感觉是不是有点像寻宝呢？那鉴定出来之后，又怎么解读这些结果呢？这可就更有趣了。
如果确定基因敲除成功了，就像是我们找到了打开一扇神秘大门的钥匙。
这个时候，我们就能观察小鼠的各种表现了。
比如说，要是敲除的是一个和毛发颜色有关的基因，那小鼠的毛发颜色可能就会变得很奇怪。
这就像一幅画里原本该是红色的花朵，我们把负责红色的颜料给拿走了，那花朵就不是红色的了。
从行为上也能看出很多东西。
假如敲除的基因和小鼠的运动能力有关，那这只基因敲除小鼠可能就会比正常小鼠跑得慢或者动作不协调。
这就好比一辆汽车，如果我们拆掉了发动机里的某个关键零件，汽车肯定就跑不起来或者跑得歪歪扭扭的。
但是呢，解读结果也不是那么简单的事儿。
有时候可能会出现一些假象。
就像我们在雾里看花一样，看起来好像基因被敲除了，但实际上可能还有一些残留的基因功能在悄悄发挥作用。
这时候就需要我们更加仔细地去分析。
比如说，小鼠的某个表型变化可能不仅仅是因为这个基因被敲除了，还可能受到其他因素的影响。
条件性基因敲除：骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因小鼠的建立和基因型鉴定郝海邦;杨承忠;岳碧松【期刊名称】《四川动物》【年(卷),期】2011(30)6【摘要】Ncol2是新发现的参与免疫调节的重要因子,Ncol2基因骨髓细胞特异性敲除小鼠的建立,能够有针对性的研究Ncol2基因缺失后对免疫系统的影响.根据条件性基因敲除的原理,本文利用loxp转基因小鼠和在骨髓细胞特异性表达Cre重组酶的LysMcre小鼠,繁殖建立了骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因的小鼠,并提供了用鼠尾做基因型鉴定的简便方法.【总页数】3页(P961-963)【作者】郝海邦;杨承忠;岳碧松【作者单位】四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室,四川大学生命科学院,成都610064;四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室,四川大学生命科学院,成都610064;四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室,四川大学生命科学院,成都610064【正文语种】中文【中图分类】Q959.837;Q95-33【相关文献】1.瘦素(Leptin)受体基因敲除小鼠繁育及子代小鼠基因型鉴定 [J], 季爱兵;严亮;彭文书;刘聪;龚婉莹;王桥美2.补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化 [J], 郑静;李丽梅;阳泰;刘阳;刘进;李敏惠;杨淑霞;邹强3.血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠与非基因敲除小鼠在急性肺损伤肺组织病理改变以及肺微血管通透性变化的比较 [J], 胡国栋;陈英华;佟万成;程远雄;张琳;张磊;蔡绍曦4.Bmal1时钟基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定 [J], 李纳;陈志彦;王力杰;刘哲;郭炳彦;李拥军5.miR-100基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定 [J], 乔思源;江文刚;汪思应因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
广东医学 2019 年 9 月第40 卷第 18 期 Guangdong Medical Journal Sep. 2019, Vol. 40, No. 18・2563・基石出硏究条件性骨细胞Tscl 基因敲除小鼠的初步研究：胡乐，刘文张武镐张月南方医科大学基础医学院（广东广州510515）【摘要】目的 构建骨细胞九cZ 基因条件性敲除小鼠，并进行表型鉴定，为进一步研究TSC1在骨细胞 中飽作用奠定基础。
方法 利用Tscl"和DMP\-Cre *转基因小鼠进行饲养和杂交;对繁殖产生的第1代小鼠进行基因型鉴定,获得Tscl 问-DMPl-Cre * ,待其成年后，同Tsc 严皿小鼠合笼，得到第2代小鼠，通过 PCR 鉴定出基因型为Tscl" DMP1 - Cre * ；此为本实验所需要构建模型小鼠。
应用H-E 染色、光学显微镜观察10周龄小鼠骨细胞的改变。
结果2种转基因小鼠繁殖产生的第2代小鼠基因型符合孟德尔遗传定律，交配后获得Tsc 严皿DMP1 - Cre *小鼠。
TscZ 基因通过Cre/loxP 系统被成功敲除。
结论 该方法成功构建可以在骨细胞条件性敲除九“基因的小鼠，并进行敲除后鉴定。
*国家自然科学基金青年科学基金资助（编号:31600964）△通信作者。
张武镐，E-mail ： smuzhangwj @ qq. com ；刘文，E- mail : 1402241007 @ qq . com【关键词】TSC1； Cre/loxP 系统；条件性敲除；骨细胞【中图分类号】R394.3；Q812【文献标志码】ADOI ： 10.13820/j. cnki. gdyx. 20186808A preliminary study of conditional osteocyte Tscl knockout mice. HU Le , LIU Wen , ZHANG Wu - ju, ZHANGYue. School of Basic Medical Sciences , Southern Medical University , Guangzhou 510515 , Guangdong , ChinaCorresponding author : ZHANG Wu -ju, E - mail : smu^iangivj@ qq. com ； LIU Wen, E - mail : 1402241007@ qq. com[Abstract ] Objective To generate and phenotypic identify osteocyte Tscl conditional knockout mice, and to lay afoundation for further study on the role of TSC1 in osteocyte. Methods心小"°〃处 and DMP1 - Cre * transgenic micewere bred and hybridized. The genotypic identification of the first generation offspring was performed , and Tscl^ox/ ~ DMP1 -Cre + mice were acquired. After crossing with Tscl fl ，＞x/^ox mice, mice with Tscl^7^ DMP1 一 Cre + were identified using PCR. The morphologic changes in osteocyte of Tscl Jlox/flox DM P l - Cre + mice and wild type ( WT) mice aged 10 weekswere observed using H-E staining and optical microscope. Results The genotype of the second generation offspring re produced by two kinds of transgenic mice was in accordance with Mendel's law of inheritance , and Tscl^^ DMP1 一 Cre + mice were generated. Tscl gene was successfully knocked out by using Cre/loxp recombination system. ConclusionHomozygous mice with osteocyte Tscl gene conditional knockout are successfully generated , which serve as ideal model for functional study of TSC1.[Key words ] TSC1 ； Cre/loxP recombination system ； conditional knockout ； osteocyte哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（the mechanistic tar get of rapamycin , mTOR ）是一种至少由2个明显的 多蛋白复合体组成的高度保守的丝氨酸-苏氨酸类激酶，是调节细胞生长、代谢、增殖、凋亡的重要因素⑴。
结节硬化症基因1（ tuberous sclerosis com-plex,TscZ ）突变会造成结节硬化症（TSC ）,这是一种严重的常染色体显性遗传病，因此Tscl 基因的功能受到了广泛的关注[2-3]o TSC1是mTOR 的上游抑 制因子⑷。
有研究表明，7WZ 基因缺失，会导致多 种严重疾病，且不同模式动物上不同细胞缺失，会导 致不同疾病。
小鼠乳腺上皮Tscl 基因的缺失会抑制乳腺导管发育⑸，小鼠软骨细胞Tscl 基因缺失会导致小鼠软骨发育不良、体长缩短⑷。
TscZ 基因敲除显著促进猪颗粒细胞增殖，抑制细胞凋亡切。
小 鼠Tscl 基因缺失导致耳蜗毛细胞早发性死亡，从而 加速听力丧失，其耳蜗表现出氧化应激和抗氧化防御功能受损的特点⑻。
但TSC1在骨细胞中的作用很少被了解。
为了进一步了解TSC1的作用，本课 题组从2015年2月至2018年8月，利用Cre/loxP 位点特异性重组酶系统，构建条件性骨细胞Tscl 基 因敲除小鼠,为后续研究提供动物模型。
1材料与方法1.1材料1. 1. 1 实验动物 Tsc 严曲（品系号：Tscl < tmlDjk >/j - 005680）小鼠购自美国Jackson 实验莹,DMP1 - Cre + （品系号：Tg （ Dmpl - cre ） ljqfe/•2564•广东医学2019年9月第40卷第18期Guangdong Medical Journal Sep.2019,Vol.40,No.18BwdJ-023047)小鼠由上海南方模式生物科技发展公司从美国Jackson实验室引进。
小鼠品系均为C57BL/6J。
繁殖与保种用野生型C57BL/6J小鼠(WT)购自南方医科大学实验动物中心。
引种后于南方医科大学实验动物中心在无特定病原体环境下饲养。
按照SPF级动物饲养标准饲养实验小鼠，环境温度为20~25T，湿度为40%-70%。
Tsc严恥小鼠为纯合子交配繁殖,DMPZ-Cre+小鼠为DMP1-Cr/八杂合子与野生型小鼠交配繁殖。
1.1.2主要试剂蛋白酶K购自美国Promega公司,DreamTaq PCR mix购自美国Thermo公司，琼脂糖粉末、DNA marker,EB替代物购自广州马可生物科技有限公司，PCR引物为上海英潍捷基有限公司合成，其他常用试剂均为国产分析纯。
鼠尾基因组DNA裂解液为自行配制，配方如下：50mmol/L KC1,2mmol/L MgCl2,10mmol/L Tris-HC1(pH= 7.4),0.1mg/mL gelatin,0.45%NP40,0.45% Tween-20,200)jLg/mL蛋白酶K。
1.2方法1.2.1条件性骨细胞TscZ基因敲除小鼠策略与流程基于Cre/loxP原则，Tsc严阿小鼠和DMP1-Cre*小鼠交配产生Tscl^-DMP1-Cre*及TsclT DMP1-Cre-2种子代;对繁殖产生的第1代小鼠进行基因型鉴定，获得TsclT DMP1-g 与TsclT小鼠杂交，得到第2代小鼠，通过PCR 反应鉴定其基因型(图1-A)。
在条件性骨细胞Tscl基因敲除小鼠的体内，骨细胞中缺失Tscl等位基因，而其他细胞中仍然含有7\＜严"加等位基因(图1-B)。
ADMPl-CreXB在骨细胞中等位基因缺失在体内其他细胞中的Zkc严曲等位基因A：敲除小鼠宏观繁殖流程;B：敲除小鼠基因改变图1条件性骨细胞Tscl基因敲除小鼠策略与流程1.2.2小鼠基因组DNA提取取3〜4周龄的小鼠，剪取鼠尾组织约0.2cm3置于1.5mL离心管,加入150piL鼠尾裂解液，放入55%金属浴中12h 进行充分裂解。
放入96%金属浴，使裂解液中的蛋白酶K失活，之后进行12000r/min离心10min,取上清作为基因鉴定的DNA模板，-20七保存备用。
广东医学2019年9月第40卷第18期Guangdong Medical Journal Sep.2019,Vol.40,No.18・2565・1.2.3九cZ基因组的基因型鉴定使用恥“弘〃“引物(表1)扩增鼠尾基因组DNA,鉴定其是否含有loxP位点。
进行PCR反应。
反应体系(总体积20 |1L)：2x PCR mix10»L,上游引物2pL(终浓度: 100|imol/L),下游引物2|xL(终浓度：100^mol/ L),模板4pL,超纯水2p.L o PCR反应程序：(1) 94T预变性3min；(2)94七变性40s；(3)65t退火45s；(4)72T：延伸1min；(5)72*C延伸2min,其中(2)-(4)循环37次。
以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，含有loxP位点的Tscl基因扩增大小为227bp,而野生型Tscl基因扩增大小为193bp。
1.2.4Cre重组酶转基因的鉴定使用DMPZ-Cre+引物(表1)扩增鼠尾基因组DNA,鉴定其是否含有Cre重组酶。
进行PCR反应。
反应体系(总体积20|xL)：2x PCR mix10piL,上游引物2|jl L(终浓度：100pmol/L)，下游引物2jxL(终浓度：100 jimol/L),模板4pL,超纯水2讥。
