新城疫抗体测定技能

新城疫的抗体检测某些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力, 称为病毒的血凝, 利用这种特性设计的实验称血球凝集试验, 以此来推断被检材料中有无病毒存在, 是非特异性的, 但病毒的血凝可为相应的抗体所抑制, 即血球凝集抑制实验（HI）, 通过血凝与血凝抑制试验, 可用已知血清来鉴定未知病毒, 也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

一目的意义1免疫监测（1）免疫效果评价（2）免疫时机确定2诊断疾病（根据有无抗体或抗体的高低）3流行病学调查二试验仪器与试剂1试验仪器离心机、离心管两支、50ml量筒一个、V型微量反应板、微量加样器（移液器）、塑料吸头（黄色）若干、1ml吸管1支、胶头滴管两支、微量振荡器、电热恒温培养箱、托盘天平。

2试验试剂鸡新城疫抗原、流感H5.H9抗原、1%鸡红细胞、生理盐水、3.8%柠檬酸钠抗凝剂、待检血清。

三方法1病毒的血凝试验1.1 3.8%柠檬酸钠抗凝剂的配制: 用托盘天平称取柠檬酸钠3.8克溶于100ml蒸馏水或纯净水中, 摇匀使其充分溶解即可, 有条件的可121℃高压蒸汽灭菌20分钟, 冷却至室温后置4℃冰箱中保存备用。

1.2 1%鸡红细胞制备过程：事先用5ml（或10ml）的注射器吸入抗凝剂若干（其量为所需血量的1/5）,从健康公鸡（未经新城疫疫苗注射）的心脏或翅下静脉采取2-4毫升血液,以2000转每分钟, 离心5分钟, 吸去上清液（注意要将血细胞泥表面的一种薄膜吸净）。

然后用生理盐水（用量为血细胞泥的5-10倍）洗红细胞, 离心5分钟, 弃去上清液, 如此反复洗3-5次, 直至上清液透明清亮为止, 最后一次要用生理盐水将血细胞泥稀释成1%浓度, 然后置4℃冰箱备用（一般可保存3天）。

1.3 红细胞凝集试验（血凝试验）操作方法（见表1）:（1）取一块洁净的96孔V型微量血凝反应板, 用微量移液器从第一列第一孔开始依次加入生理盐水, 每孔25微升, 直至加到第十五孔（第一列12孔, 第二列3孔）。

鸡新城疫抗体水平测定技能大赛培训总结作者：杨永倩张勃伟成梦玲来源：《安徽农业科学》2016年第20期摘要根据近年来全国新城疫抗体测定技能大赛，探索高职学生参加技能大赛的培训方法，主要从培训的组织、培训的过程和培训的效果等方面进行了总结，以期为广大学生和指导教师今后参赛提供参考。

关键词新城疫抗体测定；技能大赛；培训中图分类号 S-01文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）20-240-02Abstract The training method of technical competition for college students were explored according to the recent Newcastle disease antibody detection contest. Training organization， process and effects were summarized， so as to provide references for the majority of students and tutors.Key words Newcastle disease antibody determination； Technical ability contest； Training鸡新城疫抗体水平测定是一项具有典型代表性的试验技能，已作为高职教育技能大赛中一项固定的赛项内容。

笔者曾两度指导学生参加省级鸡新城疫抗体水平测定技能大赛，对大赛培训的组织、培训过程和培训效果进行了总结。

1 技能操作参照标准鸡新城疫抗体水平测定技能大赛以教育部颁布的职业学校相关专业教学指导方案和国家职业标准《动物疫病防治员》（三级）规定的知识和技能要求为基础，依据《新城疫诊断技术》（GB/T16550—2008）标准[1]及技能型人才培养要求，确定比赛内容及方式。

在训练中要求学生严格按照国标操作。

附件-12019年河北省高等职业院校鸡新城疫抗体水平测定技能大赛竞赛规程一、比赛的职业、标准、形式和内容（一）职业：动物疫病防治员。

（二）标准：（三）比赛形式1.本赛项内容由理论测试与技能测试两部分组成，其中理论知识占总分30%，技能操作占总分70%。

2. 实际操作比赛要求在规定时间内进行操作，到达预订比赛结束时间，停止一切操作，所占比重为总成绩的70%；3. 参赛代表队由6名选手组成，每个代表队设领队1人，指导教师1人，不得超出。

（四）比赛内容本竞赛重点考查参赛选手鸡新城疫抗体水平测定的实践操作能力，具体包括：1. 配制1%鸡红细胞悬液采血方法规范、熟练、抗凝剂量使用合理；天平使用、离心机使用、灭菌生理盐水洗涤红细胞操作规范、熟练；正确配制1%鸡红细胞悬液。

2. 血凝试验移液器加样规范；倍比稀释时混匀充分，试剂不滴加到孔外,吸头更换操作规范；1%红细胞悬液加之前应充分混匀，边滴加边震荡混匀。

准确判定完全凝集的病毒的最高稀释倍数作为1个血凝单位。

3.准确计算并配制4个血凝单位病毒溶液10-20ml, 微量移液器吸取和打出液体操作规范。

4.血凝抑制试验移液器加样规范；倍比稀释时混匀充分，试剂不滴加到孔外，吸头更换操作规范；1%红细胞悬液加之前应充分混匀，边滴加边震荡混匀。

感作时间适宜，结果无跳孔现象，判读结果准确。

二、竞赛用仪器、设备与材料仪器设备按《新城疫诊断技术》（GB/T16550-2008）标准要求配制。

本赛项三、参考资料四、评分规定理论测试：理论测试时间为60分钟，满分100分，主要测试动物疫病防治员岗位相关理论知识。

占总评成绩30%。

技能测试：鸡新城疫抗体水平测定技能比赛时间为180分钟，评分为六个部分：试验器材准备、配制1%鸡红细胞悬液、血凝试验、配制4个血凝单位病毒溶液、血凝抑制试验、抗体滴度报告,共计总分为100分，占总评成绩70%。

（一）评分标准（二）个人成绩的计算取参赛选手理论考试成绩乘以0.3，再加上其实际操作成绩乘以0.7，二者之和即为参赛选手的总成绩。

附件1：高职农林牧渔专业类鸡新城疫抗体水平测定赛项技能竞赛规程、评分标准及选手须知一、竞赛内容本项目为鸡新城疫抗体水平测定（微量法），测定方法按《新城疫抗体诊断技术》（GB/T16550-2008）标准进行。

本赛项不设理论考试，只对技能操作进行综合考核，技能竞赛题为公开试题，见本赛项规程的主要技术规程及要求。

二、竞赛方式本赛项为2人小组赛，以院校为单位组队参赛，不得跨校组队。

三、竞赛时量比赛时间为3小时。

比赛时由参赛队自行确定分工完成相关竞赛内容。

四、名次确定办法本赛项满分100分，采用分项计分法。

按总分由高到低排序，总分相同按完成时间先后排序，用时少者列前；若二项均相同，则按抗体滴度报告、西凝试验得分高低依次排序。

五、评分标准与评分细则1．评分标准及分值项目技能竞赛评分标准及分值见表1。

表1项目技能竞赛评分标准及分值2．评分细则项目技能竞赛评分细则见表2。

表2项目技能竞赛评分细则六、赛点提供的设施设备仪器清单仪器设备按《新城疫诊断技术》（GB/T16550-2008）标准要求配制，且均为常用仪器、设备与材料。

本赛项所用的仪器、设备与材料见表3。

表3项目竞赛用仪器、设备与材料七、选手须知（一）主要技术规程及要求鸡新城疫抗体水平测定（微量法）按《新城疫抗体诊断技术》（GB/T16550-2008）标准进行，具体步骤及其分值如下:（一）试验器材准备（占总成绩的8%）按照操作规程进行器材准备，要求器材摆放有序，物品标识合理，桌面整洁（二）配制1%鸡红细胞悬液（占总成绩的18%）按照操作规程进行采血、离心、洗涤、配制1%鸡红细胞悬液，要求采血规范、熟练、采血量适量、离心机使用规范、洗涤次数及洗涤时间适宜等。

（三）血凝试验（占总成绩的20%）按照操作规程，用微量移液器在96孔V型血凝反应板滴加稀释液、新城疫标准抗原，充分混匀，倍比稀释后，添加1%鸡红细胞悬液，充分振荡混匀，正确判定抗原的血凝效价。

要求微量移液器使用规范、倍比稀释操作规范、结果正确等。

新城疫抗体测定的规范操作作者：向双云，周珍辉来源：《江西畜牧兽医杂志》 2013年第2期向双云，周珍辉（北京农业职业学院，北京房山 102442）1 测定的器材及使用方法1.1 托盘天平托盘天平测量开始前，必须先将游码移到标尺左端的零刻度处，然后才开始调节平衡螺母，使天平平衡。

若将平衡螺母左右移至尽头天平仍不得平衡，则应检查原因，不能移动游码来达到平衡。

1.2 离心机离心机使用时离心管液体不能装得太满，对称放置的试样必须配平。

1.3 移液枪移液枪吸头装配时需将移液器垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可，切勿用移液器反复撞击吸头来上紧。

1.4 移液器移液器吸液时应垂直吸液，吸头尖端侵入液面3 mm以下，吸液时枪头应预润湿，然后再正式移液。

吸液可将按钮按到第一档吸液，释放按钮。

放液时先按下第一档，打出大部分液体，再按下第二档，将余液排出。

吸取的过程应该做到“慢吸快打”，在吸液时要慢、准，放液时对准后速度要快，可以避免打完后吸头下存留液体，保证加入的液体体积一致。

2 规范的采血方法采血前采血者先将注射器内吸入3.8%的枸橼酸钠。

采血时，一人将鸡侧卧保定，一人固定鸡的头部和脚；从侧翅膀采血，一手固定采血部分，一手采血；采血完毕后采血者一手将抗凝剂和血液轻轻摇匀，一手用干棉球按压采血部位止血。

采血部位最好从翅静脉丛刺入，比较容易采血成功且不容易淤血。

3 红细胞悬液的配制血液采集完毕需取下针头，把血液沿离心管的管壁缓慢注入离心管中，防止红细胞的破坏。

然后轻轻来回晃动离心管，使血液与抗凝剂充分混合，配平后置于离心机中开始离心。

离心完毕，应先选用5 mL的移液器吸取上面的液体，然后再选用1 mL或200 μL的移液器吸取，最好以画圈的方式吸取，比较容易把白细胞和血小板吸干净。

最后一次离心完毕，按照计算量用移液器从离心管底部吸取红细胞放入加好生理盐水的烧杯中，再反复回用生理盐水将移液器吸头里的红细胞洗下来，保证配制红细胞浓度的准确性。

新城疫的血凝和血凝克制试验高若开一、实验目的1.掌握血凝和血凝克制试验的基来源理、操作方法和结果判断方法。

2.剖析血凝和血凝克制试验的影响要素，用以确立最正确免疫时间、判断免疫成效和协助疾病诊疗。

二、实验内容1.血凝试验 (HA) 检测新城疫抗原2.血凝克制试验 (HI) 检测新城疫抗体三、实验原理1.血凝试验（ HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝聚，这类凝聚红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反响。

病毒红颗细粒胞2.血凝克制试验（ HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这类抗体的量足以克制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不可以与病毒颗粒或血凝素直接接触。

这时红细胞的凝聚现象就被克制，称为红细胞凝聚克制（HI ）反响，也称血凝克制反响。

抗原抗体I am late！四、实验资料离心计、恒温箱、冰箱、振荡器、 96 孔血凝版（ 5 块）、微量移液器（ 20-100 （若干）、洗耳球、离心试管、一般试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、微升可调）、吸液尖ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。

五、实验步骤（一）抗凝剂的配制将 1 克柠檬酸钠用25 毫升生理盐水稀释备用。

1 毫升抗凝剂可用于收集9 毫升血液。

（二） 10%红细胞悬液的配制1、用注射器汲取 0.5 毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞 4.5 毫升。

2、 1500 转离心 5 分钟，吸弃上清液。

3、用 5-10 倍生理盐水 1500 转清洗 3 次，前两次 5 分钟，后一次10 分钟。

4、吸弃上清液，用吸量管汲取红细胞，配制成10%红细胞悬液。

5、 2-6 摄氏度储藏，备用。

（三）血凝试验（ HA)1.在血凝板上第一排的1－ 12 孔内各加入 50ul 生理盐水2.将系苗用生理盐水 5 毫升稀释，在第 1 孔内加入 50ul 病毒抗原，而后挨次倍比稀释至第11 孔，最后弃 50ul。

162019年第 49卷·第5期本赛项由学校、行业、企业共同设立。

通过采取全国统一标准进行技能竞赛，有效促进全国高职院校畜牧兽医类专业之间的交流，引领专业建设与课程改革；能进一步深化学校与企业之间的合作交流，为专业建设和课程改革增添了新的思路，同时通过本赛项的资源转化，可以向社会展示畜牧兽医类专业的师生风采和建设成果，提高专业的教学水平，提升人才培养质量[1,2]。

１　比赛对照标准鸡新城疫抗体水平测定技能大赛赛项是以教育部颁布的国家职业标准《动物疫病防治员》（高级）为基础，以国家标准GB/T16550-2008[3]《鸡新城疫诊断技术》为依据，严格按照大赛组委会赛项规定[4]，进行结果判定和评分。

1.1 实验仪器的准备以2018年全国职业院校技能大赛赛项规程为例。

实验器材的准备占实验总成绩的8%。

主要要求参赛选手按照操作规程进行器材准备，要求器材选择正确、摆放有序，物品标识合理，桌面整洁等。

由赛组委会提供的项目竞赛用仪器、设备与材料共计34项。

但在实际操作过程中并不是所有的全部选用，选择仪器设备要以“使用合理的前提下够用”为原则。

在仪器与材料准备时要检查清点，并要做好清晰合理的标识。

使用的烧杯、离心管、离心管盖和血凝板都要进行标识。

实验器材的摆放要严格遵守分区摆放的原则，明确污染区和洁净区各自物品的数量和用途。

摆放完毕尽可能的不要去来回挪动器材，尽可能的做好各区域之间的互不干扰。

该赛项中主要用到的仪器有不同规格的精准微量移液器及相应的配套材料、离心机、托盘天平、微型震荡器，用到的实验材料及动物有非免疫公鸡、禽用采血器、96孔微型反应板、烧杯等。

对仪器的操作和使用要掌握其工作的原理，尤其要做好规范操作和合理使用。

1.2 1%鸡红细胞悬液配制1%鸡红细胞悬液的配置情况直接影响到实验的进度和实验结果的准确性。

而配置过程中采血是否成功是最为关键的。

在配置1%鸡红收稿日期：2019-03-26作者简介：张春霞（1989-），女，青海湟中人，讲师，主要研究方向为动物疫病防控。

2019年安徽职业院校技能大赛高职组鸡新城疫抗体水平测一、简介2019年安徽职业院校技能大赛高职组鸡新城疫抗体水平测是一项专门针对鸡新城疫的技能比赛，旨在检测参赛选手对于鸡新城疫的了解和技能水平。

二、比赛原理和流程比赛原理：选择参赛选手在比赛现场采集的鸡血样本，进行检测鸡新城疫抗体水平，从而评判参赛选手对鸡新城疫的掌握情况。

比赛流程如下：1.选手准备：参赛选手需要提前了解比赛规则和对鸡新城疫的知识，并准备好相关试剂和设备。

2.采集样本：参赛选手在比赛现场采集鸡血样本。

3.检测鸡新城疫抗体水平：参赛选手将鸡血样本制成血清，并使用ELISA方法进行检测鸡新城疫抗体水平。

4.结果评价：参赛选手根据检测结果，评价样本中鸡新城疫的抗体水平。

三、技能要求参赛选手需要具备以下技能：1.掌握鸡新城疫的相关知识和防治措施。

2.熟练掌握鸡血样本的采集和血清制备方法。

3.较好地了解ELISA检测方法的原理和操作步骤。

4.能够熟练使用ELISA试剂盒。

四、比赛考察内容比赛考察内容包括以下方面：1.参赛选手对于鸡新城疫知识的理解和应用能力。

2.参赛选手对于鸡血样本的采集和血清制备技能掌握情况。

3.参赛选手对于ELISA试剂盒的操作技巧和应用能力。

4.检测结果的准确性和评价能力。

五、比赛影响2019年安徽职业院校技能大赛高职组鸡新城疫抗体水平测旨在促进鸡新城疫防治技术的提高和推广，同时也可以激发参赛选手的学习兴趣和实际应用能力。

比赛的影响将包括：1.推广鸡新城疫防治知识，促进兽医学技术的提升。

2.培养参赛选手的实际操作技能和应用能力。

3.促进行业内技术的交流和合作，推动行业快速发展。

六、总结2019年安徽职业院校技能大赛高职组鸡新城疫抗体水平测是一项重要的技能比赛，旨在检测参赛选手对于鸡新城疫的了解和技能水平。

比赛要求选手具备一定的理论基础和实际操作能力，考察内容涉及鸡新城疫的防治技术、鸡血样本的采集和ELISA试剂盒的应用等方面。