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猪口蹄疫O型合成肽疫苗及其主要特点任巧玲;邢宝松;郭红霞【摘要】At present, foot-and-mouth disease is one of the animal diseases which seriously endan-ger Chinese pig industry,,and vaccination is an important prevention methord for this disease. New-ly developed Synthetic peptide vaccine of O-type foot-and-mouth disease in swine has aroused great attention for its high immunogenicity, good biological safety, differentiate infection from vacci-nation, and so on. Foot-and-mouth disease virus, the antigenic epitope of type O foot-and-mouth disease virus, and the research status of synthetic peptide vaccine of type O foot-and-mouth dis-ease of swine and its main characteristic are discussed in this article In order to provide refer-ences for the promotion and the application of this vaccination.%口蹄疫是当前严重危害我国养猪业的疾病之一，长期以来免疫接种是我国预防该病的重要措施。
猪口蹄疫（O型）灭活疫苗质量标准本品系用口蹄疫O型病毒（猪源毒株）接种BHK－21细胞培养，收获培养物，经二乙烯亚胺（BEI）灭活后，加矿物油佐剂混合乳化制成。
用于预防猪O型口蹄疫。
【性状】外观为乳白色或淡粉红色的乳剂。
久置后，上层有少量油析出，振摇后呈均与乳剂。
剂型为水包油包水型。
用一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5ml。
【安全检验】1．用小动物检验用体重350～450g的豚鼠2只，各皮下注射疫苗2ml；用体重18～22g的小白鼠5只，各皮下注射疫苗0.5ml。
连续观察7日，应不出现由疫苗引起的死亡或明显的局部和全身反应。
2．用猪检验用30～40日龄仔猪（细胞中和抗体效价不高于1:8、ELISA效价不高于1:8或乳鼠中和抗体效价不高于1:4）2头，各两侧耳根后肌肉分点注射2头份疫苗，逐日观察14日。
应不出现由疫苗引起的口蹄疫症状或明显的局部和全身不良反应。
【效力检验】用体重40kg左右的健康易感架子猪（细胞中和抗体效价不高于1:8、ELISA效价不高于1:8或乳鼠中和抗体效价不高于1:4）15头，分为3组，每组5头。
将疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别于耳根后肌肉注射5头猪。
接种28日后，连同对照猪2头，每头猪耳根)。
连续观察10日。
对照猪后肌肉注射猪O型口蹄疫病毒强毒1.0ml(含103.0ID50均应至少1蹄出现水泡或溃疡。
免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。
出现。
发病猪后要及时进行隔离。
按Reed－Muench法计算。
每头份疫苗应至少含6PD50【规格】（1）20ml/瓶（2）50ml/瓶（3）100ml/瓶。
【贮藏】在2～8℃保存，有效期为12个月。
【作用与用途】用于预防猪O型口蹄疫。
注苗后15日产生免疫力。
免疫期为6个月。
【用法与用量】根据厂家推荐的用法与用量使用。
摘要：口蹄疫是我国比较多发的一类动物疫病，口蹄疫的检测诊断是做好口蹄疫防控工作的关键。
为了更好更快地检测和诊断口蹄疫，本研究在口蹄疫血清3ABC 检测阳性的基础上尝试建立一种快速灵敏的PCR 检测技术。
通过查询基因序列、引物设计、引物合成、PCR 反应条件摸索和优化、PCR 扩增、凝胶电泳成像，最终在待测样品中成功地扩增出A 型口蹄疫病毒预期大小的条带，可以快速检测出A 型口蹄疫病毒。
O 型和Asia I 型因没有阳性病原学样品或标准毒株，未能扩增出相应的目的条带。
关键词：口蹄疫；检测技术；聚合酶链式反应（PCR ）口蹄疫PCR 检测技术的建立张红梅1，王雅媛2,3，曹文琴1，白崇生1*，权富生3*（1.榆林市畜牧兽医服务中心陕西榆林719000；2.榆林市农业宣传信息中心陕西榆林719000；3.西北农林科技大学陕西杨凌712100）doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2023.08.003收稿日期：2022-12-10作者简介：张红梅（1981.7—），女，陕西榆阳人，本科，兽医师，主要从事畜牧兽医相关工作。
*通信作者口蹄疫（foot-and-mouth disease ，FMD ）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV ）引起的一种急性、烈性、水泡性病毒传染病，主要感染牛、羊、猪等70多种偶蹄科动物，典型的临床特征主要表现为机体发热，口腔黏膜、唇部、蹄部及乳房皮肤出现烂斑或水疱性病理变化[1-3]。
FMD 被世界动物卫生组织（WOAH ）和联合国粮农组织（FAO ）列为A 类传染病的首位。
我国亦将FMD 排在动物疫病病种名录的第一位[4]。
FMD 的诊断技术从大的方面分为临床诊断和实验室诊断。
单纯的临床诊断不能作为FMD 确诊的依据[5]。
目前，检测技术方法虽然层出不穷，但是，由于FMD 血清型种类繁多和FMDV 很容易发生变异，给本病诊断带来一定困难。
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease Virus, FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性并可快速远距离传播的动物疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国规定为一类动物疫病。
其主要感染偶蹄兽，患病动物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位发生水疱，破溃形成烂斑。
1 FMD-畜牧业的大敌猪、牛、羊等主要的家畜均可感染此病，并能形成大规模流行，该病的发病率几乎达100%，犊牛、仔猪以及动物发生恶性病型时，死亡率可达50%～100%。
由于该病传染性极强，对病畜和怀疑处于潜伏期间的同群动物必须紧急处理，对疫点周围的广大范围必须隔离封锁，禁止动物移动和畜产品调运流通。
由此导致该地区甚至该国家的畜产品进出口贸易停止，造成巨大的经济损失和政治影响。
2010年，日本因该病造成直接经济损失10亿美元，韩国11.41亿美元，是发达国家近10年来最严重的疫情。
我国每年因口蹄疫造成的损失平均在110亿～120亿元之间，约占畜牧业平均增加量的17%～18%。
FMDV 宿主广泛，变异性强，危害公共卫生；引起疫源争论，社会秩序混乱，进出口限制，造成不良社会影响；还是国际禁止生物武器核查对象，有一定军事危害。
2 病原口蹄疫病原是口蹄疫病毒，属小RNA 病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthavirus)，病毒粒子直径为20～25nm，呈大致的圆形或六角形，无囊膜。
FMDV 有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia 1型7个血清型，猪口蹄疫的免疫与疫苗应用张淑刚，周绪斌（新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，乌鲁木齐 830023）每个血清型又包含若干个亚型。
该病毒不仅在各型间没有交叉免疫性，同血清型的各亚型之间也仅有部分交叉免疫性[1]。
口蹄疫病毒在环境中有一定的存活能力，病毒在干燥粪便中存活14 d，泥浆中存活6个月，尿中存活39 d。
目录摘要 (III)关键词 (III)Abstract (III)Key words (IV)英文缩略词表 (IV)1前言 (1)1.1口蹄疫的基本特征 (1)1.1.1口蹄疫病毒基本概念 (1)1.1.2口蹄疫病毒生物学特征 (1)1.1.3口蹄疫病毒危害 (1)1.2泛素蛋白及其对抗原的影响 (2)1.3 siRNA干扰机制 (3)1.4 γ干扰素与口蹄疫免疫 (4)1.5 FMD疫苗研究进展 (5)1.6本实验研究的目的与意义 (6)2实验材料 (6)2.1菌种、毒株、载体与质粒 (6)2.2主要药品与试剂 (6)2.3主要培养基及配制 (7)2.4缓冲液及其配制 (7)2.5其他溶液 (7)2.5空斑筛选与纯化相关试剂 (8)2.6寡核苷酸引物 (8)3实验方法 (8)3.1转移载体PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建策略 (8)3.1.1限制性内切酶酶切反应 (9)3.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测 (9)3.1.3酶切产物的回收 (9)3.1.4回收产物的去磷酸化反应 (9)3.1.5目的基因与载体的酶连反应 (10)3.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化 (10)3.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） (10)3.2.2质粒的转化 (10)3.2.3质粒的小量制备（OMEGA试剂盒） (10)3.2.4质粒的大量制备（OMEGA试剂盒） (11)3.2.5阳性质粒的酶切鉴定 (12)3.3以PRV为载体表达FMDV抗原蛋白基因P1，泛素蛋白与抗原P1的融合基因Ubi- P1，RNA干扰基因shRNA，干扰素基因IFN-γ的重组病毒的构建 (12)3.3.1细胞的培养、冻存与复苏 (12)3.3.2 PRV TK-/gE-/LacZ+基因组DNA的提取 (12)3.3.3脂质体介导的共转染 (13)3.3.4重组病毒空斑纯化和PCR鉴定 (13)3.3.5鉴定用PCR模板处理 (14)3.3.6重组病毒PCR鉴定 (14)4结果与分析 (15)4.1转移质粒PIECMVUbiP1的构建 (15)4.2转移质粒PIECMVUbiP1P1的构建 (15)4.3转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建 (16)4.4共转染产物接毒第三代PCR鉴定 (17)4.5重组病毒的空斑纯化及PCR鉴定 (18)4.5.1空斑的形成 (18)4.5.2在PK-15细胞上的第一轮空斑筛选 (19)4.5.3在Vero细胞上的第一轮空斑筛选 (20)4.5.4 重组病毒的空斑筛选结果 (20)5讨论 (20)5.1 载体的构建 (20)5.2 细胞的传代培养 (21)5.3 空斑筛选实验 (21)5.3.1 空斑筛选细胞的选择 (21)5.3.2 RNA干扰对空斑筛选结果的影响 (22)5.3.3干扰素γ对空斑筛选结果的影响 (22)参考文献： (22)致谢 (24)猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建The construction of recombinat Virus for Generating a Novel Genetic Engineering Vaccine Agansit O Type FMDV ofPig摘要口蹄疫是一种急性、高度传染性的病毒性传染病，虽自20世纪初口蹄疫疫苗已经在世界部分地区应用，但目前全球口蹄疫疫情依然严重，也构成了世界动物及动物产品贸易的障碍。
由本实验室构建的猪伪狂犬病毒基因缺失株PRV TK-/gE-/LacZ+作为一种病毒载体，具有安全性好、容量大、重组效率高等优点，本研究用人工合成的O型口蹄疫P1基因作为抗原基因，用和泛素（Ub）融合的UbiP1作为另一个抗原基因同时达到增强细胞免疫效果，再将针对口蹄疫3B基因设计的shRNA和具有抗病毒及免疫调节效果的猪IFN-γ与以上两个功能基因串联，构建了具有四个功能基因的转移载体，将此转移载体和PRV缺失株TK-/gE-/LacZ+共转染细胞，发生基因重组后进行了空斑纯化，经鉴定，初步得到了含有P1基因、UbiP1、shRNA、IFN-γ四个功能基因的重组伪狂犬病毒，为进一步构建新型基因工程疫苗打下基础。
关键词：抗原基因；泛素蛋白基因；干扰素基因；重组病毒AbstractFoot and mouth disease (FMD) is an acute, highly contagious virul infection disease. Although vaccines, available since the early 1900s, have been used in parts of the world, the disease still is a serious globe outbtreak and become sanitary barrier to the commerce of animals and animal products. The vector virus PRV TK-/gE-/LacZ+ , constructed by our laboratory , has the advantages of safety, high capacity, high restructuring efficiency. This study we selecte synthetic O type FMDV P1 gene as antigen gene, P1 and ubiquitin (Ub) fusion gene UbiP1 as another antigen gene to enhance cellular immune effect. Then use shRNA designed for 3B gene of FMD, IFN-γ gene of porcine has anti-viral and immunomodulatory effects tandem with the above two function gene, constructed transfer vector with four functional gene. Making the transfer vector and the PRVTK-/gE-/LacZ+ cotransfected in cells. After the occurrence of recombinant, plaques were purified, identified, initially received recombinant pseudorabies virus with four functional genesof P1 gene, UbiP1, shRNA and IFN-γ, in order to further build a new foundation for the construction of genetic engineering vaccine.Key words：antigen gene; ubiquitin; interferon gene; recombinant virus英文缩略词表AbbreviationFMDV Ub UPS RNAi siRNA shRNA SIF IFNγPRV NCS Amp DMEM LB PBS PCR SDS EB OD EDTA PK Vero DMSO MEM Foot-and-Mouth disease virusUbiquitinUbiquitin-proteasome systemRNA interferenceRNA interference geneRNA interference geneInterference gene fragmentγ-interferon genePseudorabies virusNewborn calf serumAmplicillumDulbecco's Modified Eagle MediumLuria-Bertani mediumPhosphate buffer solutionPolymerase chain reactionSodium dodecylsulphateEthidium bromideOptical densityEDTA Disodium SaltPig kidney cellsAfrican green monkey kidney cellsDimethyl sulfoxideMinimal Essential Medium口蹄疫口蹄疫病毒泛素泛素蛋白酶系统小RNA干扰小RNA干扰基因小RNA干扰基因干扰基因区段γ干扰素基因伪狂犬病病毒新生牛血清氨苄青霉素改良Eagle培养基LB培养基磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠溴化乙锭光密度乙二胺四乙酸猪肾细胞非洲绿猴肾细胞二甲基亚砜微小型培养基1前言1.1口蹄疫的基本特征1.1.1口蹄疫病毒基本概念口蹄疫(Foot-and-month disease, FMD)是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus, FMDV）感染引起的人畜共患的急性、烈性传染病，该病全世界分布广泛，主要感染偶蹄类，一旦爆发常造成巨大的经济损失。
由于存在制作灭活苗灭活不彻底和毒力返强造成的潜在危险，开发新型基因工程疫苗已引起人们的重视。
1.1.2口蹄疫病毒生物学特征口蹄疫病毒呈球形，正二十面体结构，直径20-25nm;无囊膜，对酸碱敏感，口蹄疫病毒粒子由衣壳和病毒核酸构成，衣壳由60个不对称的亚单位组成，每个亚单位含一分子的VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP4位于病毒颗粒内部。
FMDV属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，有7个血清型，即O，A，C，SAT 1, SAT 2, SAT 3和AsiaⅠ型(Rodriguez and Grubman, 2009)，各个血清型间无交叉反应（陆承平等，2005），病毒的这种特性，给其检疫、防疫带来极大的困难。
FMDV基因组为具有感染性的单股正链RNA，大小约8.5kb，只有一个开放的读码框(open reading frame, ORF)，两侧各有一个非编码区(non coding region, NCR)。
开放读码框首先翻译为一个多聚蛋白，经过蛋白酶切割为成熟的结构和非结构蛋白以及一些中间体。
FMDV基因组P1区编码结构蛋白，P12A前体物在3C蛋白酶作用下形成由VP4-VP2，VP3和VP1组成的原体。
