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２０２４年第１期（总第４１６期）畜禽业生产指导猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗质量控制与安全性评估的技术研究梁俊武玉林市动物疫病预防控制中心，广西玉林５３７０００摘 要 在生猪养殖业的发展过程中，猪疫病对产业的健康发展产生了严重威胁。
疫苗作为生猪疫病防控的重要手段，其质量控制与安全性评估显得尤为重要。
以猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗为研究对象，从质量控制和安全性评估２个方面进行了技术分析，验证了其质量。
关键词 猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗；猪疫病；质量控制ｄｏｉ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８ ０４１４．２０２４．０１．０１００ 引言随着全球生猪养殖业的发展，猪疫病对行业的影响逐渐凸显，疫苗在保障生猪养殖业健康发展中具有重要作用。
近年来，猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗作为一种新型猪疫苗，受到了广泛关注。
而疫苗的质量安全问题直接关系到养猪业的健康发展和食品安全，因此，对猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗的质量控制与安全性评估研究具有重要意义。
１ 猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗概述猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗由内蒙古金宇保灵生物药品有限公司生产，通用名为猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗（Ｏ／Ｍｙａ９８／ＸＪ／２０１０株＋／ＧＸ／０９ ７株），商品名为保蹄灵，英文名为ｓｗｉｎｅｆｏｏｔａｎｄｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖａｃ ｃｉｎｅ，ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｔｙｐｅ０，Ｓｔｒａｉｎ０／Ｍｙａ９８／ＸＪ／２０１０＋ＳｔｒａｉｎＯ／ＧＸ／０９ ７）。
成分主要有灭活的猪口蹄疫Ｏ型病毒变异毒０／ＧＸ／０９ ７株和东南亚拓扑型缅甸 ９８毒０／Ｍｙａ９８／ＸＪ／２０１０株，灭活前１ｍＬ疫苗中病毒含量应至少为１０７ＴＣＩＤ５０或每０．２ｍＬ病毒含量应至少为１０７ＬＤ５０。
每头份疫苗对猪口蹄疫型０／ＧＸ／０９ ７株和０／Ｍｙａ９８／ＸＪ／２０１０株２个毒的效力应至少各含６个ＰＤ５０。
每头份疫苗中每个毒株病毒含量应分别不低于６００ｎｇ。
疫苗性状为淡粉红色或乳白色略带粘滞性乳状液。
此疫苗主要用于预防猪Ｏ型口蹄疫，免疫期为６个月，注射方式为耳根后肌内注射，１０～２５ｋｇ猪１ｍＬ／头（１／２头份）；２５ｋｇ以上猪用量为２ｍＬ／头（１头份）。
新型猪口蹄疫O型疫苗应用效果试验为有效防控生猪口蹄疫，我国采取了以免疫为核心的防治措施，取得了较好的效果。
20世纪90年代，以口蹄疫全病毒灭活苗为主，进入21世纪后，以浓缩苗为主。
为结合扬中市实际，制定切实有效的生猪口蹄疫免疫程序，迸一步提升生猪口蹄疫科学防治水平，2022年9月一2022年10月，我们使用0型灭活苗(o，MAY98/BY/2022株)和O型合成肽疫苗在扬中市油坊、西来桥二个镇的3个规模猪场进行了分组试验，现将试验结果报告如下。
1材料和方法1.1材料1.1.1试验猪扬中市良友畜禽养殖有限公司、扬中市众康养殖场、扬中市西来桥镇海鑫养殖场3个生猪养殖场里各选取的250头45日龄健康仔猪。
3个猪场试验猪品种均为杜某长某大。
1.1.2试验疫苗猪口蹄疫0型灭活苗（O/MAY98/BY/2022株）。
生产厂家：中农威特生物科技股份有限公司。
批号：H111268J。
猪口蹄疫0型合成肽疫苗。
生产厂家：新疆天康畜牧生物技术股份有限公司。
批号：2022028。
猪口蹄疫0型合成肽疫苗。
生产厂家：中牧实业股份有限公司兰州生物药厂。
批号：1111002。
1.1.3主要仪器与试剂酶标仪680型北京元业伯乐；单道微量加样器I0一100~1，20—200μ1；多道微量加样器50-300μl，上海大龙；电热培养箱HP某-9082MBE上海博迅；湿盆；量筒；烧杯；猪口蹄疫病毒VP，结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒。
生产厂家：上海优耐特生物医药有限公司。
批号：202212004。
猪0型口蹄疫抗体液相阻断ELISA诊断试剂盒。
生产厂家：中国农业科学院兰州兽医研究所。
批号：2022091901。
1.2试验方法1.2.1试验猪选择分别在3个养殖场随机选择250头45日龄健康仔猪作为对比试验对象。
1.2.2试验步骤将试验猪随机平均分成2组，第1组、第2组于45日龄分别注射口蹄疫合成肽疫苗、口蹄疫试验灭活苗各1ml。
65日龄前腔静脉采血5ml，同时第1组注射口蹄疫合成肽疫苗Iml，第2组注射试验灭活苗iml。
猪口蹄疫O型合成肽疫苗及其主要特点任巧玲;邢宝松;郭红霞【摘要】At present, foot-and-mouth disease is one of the animal diseases which seriously endan-ger Chinese pig industry,,and vaccination is an important prevention methord for this disease. New-ly developed Synthetic peptide vaccine of O-type foot-and-mouth disease in swine has aroused great attention for its high immunogenicity, good biological safety, differentiate infection from vacci-nation, and so on. Foot-and-mouth disease virus, the antigenic epitope of type O foot-and-mouth disease virus, and the research status of synthetic peptide vaccine of type O foot-and-mouth dis-ease of swine and its main characteristic are discussed in this article In order to provide refer-ences for the promotion and the application of this vaccination.%口蹄疫是当前严重危害我国养猪业的疾病之一，长期以来免疫接种是我国预防该病的重要措施。
分类号：单位代码：10019密级：学号：66043学位论文猪O型口蹄疫高倍浓缩灭活疫苗的工艺研究 Technical Study on Highly Concentrated Inactivated Vaccine ofSwine FMDV Type O研究生：尹忠良指导教师：陈福勇教授合作指导教师：申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：预防兽医研究方向：动物疫苗生产工艺所在学院：动物医学院2010年11月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间： 年 月 日2中文摘要口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的主要危害牛、猪、羊等偶蹄动物的烈性传染病，具有发病率高，传染性强的特点，能形成国际大流行，国际兽疫局（OIE）将其排在A类家畜传染病的首位。
世界各国政府都高度重视本病的防治工作，近一个世纪以来，许多国家成立了专门的研究机构，对口蹄疫的预防和控制进行研究，在口蹄疫疫苗的研究方面一直也是研究热点。
在我国，预防控制口蹄疫疫病的重要措施是应用疫苗进行免疫，目前主要使用不经过浓缩的病毒培养液配制的普通灭活疫苗，每头剂量2ml仅含3个PD50。
因普通疫苗的抗原未经浓缩处理抗原含量偏低，同时存在一定量的细胞碎片等非抗原蛋白成份，所以保护力低、免疫期相对较短，并有一定的副反应。
本研究通过对猪O型口蹄疫病毒抗原进行高倍浓缩等一系列手段，制备出更高标准的新型疫苗，并探索出一套口蹄疫浓缩疫苗生产工艺。
通过对口蹄疫疫苗毒株的各种生物学特性尤其是病毒毒力和免疫原性、病毒液的前处理和高倍超滤浓缩工艺、浓缩后病毒含量检测方法和标准的建立（细胞TCID50与乳鼠LD50试验平行比较）、应用国际通行标准（OIE）对疫苗进行PD50测定并与血清中和抗体相比较等研究试验，最终研制成功的三批高倍浓缩疫苗，并对该三批疫苗的安全性、效力等指标进行检验，提高安全性,动物注射疫苗后安全而无副作用；提高免疫效力，每头剂达到6个PD50以上；均达到了预先设定的各项标准。
为将来研究猪口蹄疫多价疫苗提供基础数据。
关键词：猪口蹄疫，病毒浓缩，疫苗IIIAbstractFoot and Mouth Disease (FMD), a major threat to cloven-hoofed animals such as bovine, swine and sheep, is a highly contagious disease caused by Foot and Mouth Disease Virus (FMDV). Since it has a high incidence and can easily cause an epidemic outbreak, Office International des Epizooties (OIE) ranks it in the first in all contagious diseases for domestic animals. Governments all over the world have attached great importance to the prevention and treatment of this disease.For nearly a century, many countries have established special research institutions, which research focused on the prevention and control of the outbreak and prevalence of FMD. Vaccine research in the foot and mouth disease has also been a research hotspot since vaccination was one of the major means to prevent domestic animals from this disease.In China, the way widely adopted to prevent domestic animals from the infection of FMDV is vaccination, mainly through the use of non-concentrated liquid preparation of the common viral cultures inactivated vaccine; generally, the dosage per animal is 2ml and only contains 3 PD50. Since the concentration of viral antigens in the non-concentrated crude viral preparation (common vaccine) is relatively low and it contains a trace amount of non-antigenic protein components such as the host cell debris, these make the vaccines usually in a weak protection, a relatively short duration for immune response and having some side effects.In this study, we produced a higher standard new vaccine by through a series of means to highly concentrated swine type O FMDV antigen, and explored a set of production process for concentrated FMDV vaccine. Through examining the biological characteristics of the vaccine strain especially for its virulence and immunogenicity; evaluating the pre-process for the viral culture and the concentration technology; establishing the testing standard protocol for the viral antigen content after concentration (the results from the established new testing protocol obtained from ELISA and TCID50 were consistent with the results obtained from the mouse LD50 protocol); using OIE standard to determine the PD50 and comparing the efficacy by Neutralization test, we successfully produced three batches of high-concentrated vaccines. Improving the security,Animal safety without side effects after vaccination. Enhancing the immune effect,up to 6 PD50 dose or more per head. All three have been tested their safety, efficacy, and all indicators have met the pre-set standards. Providing valuable data for the research of swine FMD multivalent vaccines.To date, these vaccines have been passed the assessment and evaluation by the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China and will be certificated for the license soon.Key words: Swine Foot and mouth disease, virus concentration, vaccineIV目录中文摘要 (III)Abstract (IV)第一章文献综述：猪口蹄疫简述及疫苗的研究现状 (7)1 病原学 (7)2 流行病学 (8)3 症状 (8)4 防制措施 (9)第二章猪口蹄疫病毒O型(OR/80)毒株的鉴定试验 (11)前言 (11)1 材料与方法 (11)1.1 材料 (11)1.2 方法 (12)2 结果 (14)2.1 猪水泡皮毒F1～F3复壮与传代结果 (14)2.2 乳鼠毒适应与传代结果 (15)2.3 BHK21细胞毒适应培养结果 (15)2.4 毒力测定结果 (16)2.5 型特异性鉴定 (20)2.6 纯净检验 (20)2.7 免疫原性试验结果 (21)3 讨论与小结 (23)第三章猪口蹄疫高倍浓缩灭活疫苗制苗工艺研究 (24)前言 (24)1 材料与方法 (24)1.1 材料 (24)1.2 方法 (25)2 结果 (27)3 讨论 (31)4小结 (31)第四章猪口蹄疫高倍浓缩灭活疫苗的制备及安全、效力试验 (33)前言 (33)1 材料 (33)V1.1 毒种 (33)1.2 BHK21细胞 (33)1.3 试验动物 (34)1.4 其它试剂及设备 (34)2 方法 (35)2.1 病毒液的繁殖扩量 (35)2.2 病毒液的检验 (35)2.3 病毒抗原液的纯化与浓缩 (35)2.4 超滤浓缩后的病毒抗原液进行过滤 (36)2.5 病毒液纯化浓缩后的病毒含量测定 (36)2.6 灭活 (36)2.7 阻断 (36)2.8 半成品检验 (36)2.9 配苗 (37)3 成品检验 (37)3.1 性状 (37)3.2 无菌检验 (37)3.3 安全检验 (37)3.4 效力检验 (38)4 结果 (38)4.1 制苗病毒液的制备 (38)4.2 半成品检验 (39)4.3 配苗 (40)4.4 成品检验 (40)5 讨论 (43)6 小结 (44)第五章结论 (45)参考文献 (47)致谢 (51)附录 (53)作者简历 (57)VI第一章 文献综述：猪口蹄疫简述及疫苗的研究现状家畜口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是一种主要感染偶蹄动物的急性、热性传染病，主要危害牛、猪、羊等偶蹄家畜。
