第三章固定化酶与固定化细胞

第三章-固定化酶与固定化细胞

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2017高考生物一轮复习教案：专题27考点二 固定化酶和固定化细胞 含解析 精品

考点二固定化酶和固定化细胞 基础点 1固定化酶 (1)应用实例——果糖生产：葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为果糖。 (2)固定化酶技术：将酶固定在颗粒状的载体上，再将酶颗粒装到反应柱内，反应柱底端的孔应满足酶颗粒无法通过而反应溶液可以自由通过。 2固定化细胞技术 (1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。 (2)方法：包埋法、化学结合法和物理吸附法。 (3)制备固定化酵母细胞的操作流程：酵母细胞的活化→配制0.05 mol/L CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞→冲洗→发酵。 重难点 1制备固定化酵母细胞及用固定化酵母细胞发酵 2直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较

易错警示(1)固定化技术对酶的影响：固定化酶改变了酶的存在状态，不改变酶的特性，因此利用固定化酶仍要严格控制温度、pH 等环境条件，以利于酶发挥作用。 (2)正确理解固定化酶的优点：固定化酶能够连续使用，但不是永久使用。酶是具有生物活性的大分子，因此随着使用次数的增多，酶活性也会降低，如果酶活性降低到一定程度，就会失去使用价值。 1．思维辨析 (1)反应产物对固定化酶的活性没有影响。( ) (2)固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应。( ) (3)从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小。( ) (4)将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl 2和杂菌。( ) (5)刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液。( ) (6)利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物。( ) 答案 (1)× (2)× (3)√ (4)√ (5)× (6)× 2．酶在大规模产业化应用中的核心问题是固定化技术，而酶固定化所依据的基本原理在于酶具有( ) A ．热稳定性 B ．催化高效性 C ．催化特异性 D ．可反复使用性 答案 D 解析 固定化酶是利用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。

第 三 章 酶(试题与答案)

第三章酶 【测试题】 一、名词解释 1．酶13．最适pH 2．固定化酶14．不可逆性抑制 3．同工酶15．可逆性抑制 4．酶的特异性16．激活剂 5．酶的活性中心17．抑制剂 6．酶原及酶原激活18．核酶 7．抗体酶19．变构酶 8．活化能20．酶的共价修饰 9．诱导契合假说21．酶的Vmax 10．初速度22．结合酶 11．Km值23．酶活力 12．最适温度24．比活力 二、填空题 25．酶是由产生的对特异底物起高效催化作用的。 26．酶加速反应的机制是通过降低反应的，而不改变反应的。 27．结合酶，其蛋白质部分称，非蛋白质部分称，二者结合其复合物称。 28．酶活性中心与底物相结合那些基团称，而起催化作用的那些基团称。 29．当Km值近似ES的解离常数K S时，Km值可用来表示酶对底物的。 30．酶的特异性包括特异性，特异性和特异性。 31．米曼二氏根据中间产物学说推导出V与[S]的数学方程式简称为，式中的..为米氏常数，它的值等于酶促反应速度达到一半时的。 32．在其它因素不变的情况下，[S]对酶促反应V作图呈线，双倒数作图呈线，而变构酶的动力学曲线呈型。 33．可逆性抑制是指抑制剂与酶进行结合影响酶的反应速度，抑制剂与酶的活性中心结合，抑制剂与酶的活性中心外的必需基团结合。 34．反竞争性抑制剂使酶对底物表观Km ，Vmax 。 35．无活性状态的酶的前身物称为，在一定条件下转变成有活性酶的过程称。其实质是的形成和暴露过程。 36．丙二酸是酶的抑制剂，增加底物浓度可抑制。 37、同工酶是指催化化学反应，而酶蛋白分子结构、理化性质及免疫学性质的一组酶。 38．辅酶与辅基的区别在于前者与酶蛋白，后者与酶蛋白。 39．肌酸激酶的亚基分型和型。 40．最适温度酶的特征性常数，它与反应时间有关，当反应时间延长时，最适温度可以。 41．某些酶以形式分泌，不仅可保护本身不受酶的水解破坏，而且可输送到特定的部位与环境转变成发挥其催化作用。 42．不可逆抑制剂常与酶以键相结合使酶失活。 43．当非竞争性抑制剂存在时，酶促反应动力学参数如下Km ，Vmax 。 44．当酶促反应速度为最大反应速度的80%时，底物浓度是Km的倍。 三、选择题 A型题 45．关于酶概念的叙述下列哪项是正确的 A.所有蛋白质都有酶的活性 B.其底物都是有机化合物 C.其催化活性都需特异的辅助因子 D.体内所有具有催化活性的物质都是酶 E.酶是由活细胞合成具有催化作用的蛋白质

固定化酶

固定化酶的制备及应用 摘要：本文主要从酶的固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中的研究进展情况，并且从医药、食品、环保、等方面其在其中的新应用出发，对固定化酶在新领域中的应用作了综述，给固定化酶研究的发展前景进行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项技术。以往用的酶绝大多数是水溶性性的酶。这些水溶性的酶催花结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。60年代后，在美学研究领域内涌现出固定化酶，最早被称为“水不容酶”或“固相酶”，此技术将水不溶性的自然酶与不溶性载体相结合，成为不溶于水的酶的衍生物。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。 利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，为酶的应用开辟了新的前景。如可使所使用的酶、细胞能反复使用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速发展。其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。 1固定化酶的优缺点 1.1 优点 （1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；

（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。 （6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保证，成本低。 1.2缺点 （1）酶固定化时酶的活力有所损失，同时也增加了固定化的成本。 （2）比较适应水溶性底物和小分子底物。 （3）不适于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。 2.固定化酶的制备原则 （1 ）必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心， 为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催 化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨 基酸残基不发生变化。这就要求酶与载体的结合部位不应当是 酶的活性部位，应避免活性中心的氨基酸残基参与固定化反应； 另外，由于酶蛋白的高级结构是凭借疏水键、氢键、盐键等较 弱的键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件，避免 那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强

第三章 固定化酶与固定化细胞

?第三章固定化酶与固定化细胞 ?第一节概述 ?第二节固定化酶的性质及其影响因素 ?第三节固定化酶的制备 ?第四节固定化细胞 ?第五节固定化辅酶和原生质体 ?第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 ?第一节概述 ?什么是固定化酶？ ?第一节概述 二．固定化酶的优缺点 ?多次使用 ?可以装塔连续反应 ?优点：纯化简单 ?提高产物质量 ?应用范围广 ?缺点：首次投入成本高 ?大分子底物较困难 ?第一节结束 ?点击返回 ?第二节固定化酶的性质及其影响因素 ?一．影响固定化酶性质的因素 ?二．固定化后酶性质的变化 ?三．评价固定化酶的指标 ?一．影响固定化酶性质的因素 1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 ?二．固定化后酶性质的变化 ?1．固定化对酶活性的影响： ?酶活性下降，反应速度下降 2．固定化对酶稳定性的影响 ?稳定性提高（原因） ?3．pH的变化（原因） ?载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 ?载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 ?催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 ?酶的pH值高；反之则低 ?固定化后酶稳定性提高的原因： ? a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 ? b. 酶活力的释放是缓慢的。 ? c. 抑制自身降解，提高了酶稳定性。 ?PH 对酶活性的影响： ?（1）改变酶的空间构象 ?（2）影响酶的催化基团的解离

?（3）影响酶的结合基团的解离 ?（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。 ?4．最适温度变化 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。 5．底物特异性变化 ?作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化 ?既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 ?特异性往往会变化。 6．米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （链接） ?米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境 Km'=Km/ρ(表观米氏常数) ?（1）载体与底物带相同电荷，Si]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。 ?（2）载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，则ρ>1,Km'

3.2制备和应用固定化酶

第三章酶的应用技术实践 3.2制备和应用固定化酶 探究目的： 1说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理 2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。探究预习： 固定化酶技术的发展也促进了固定化细胞技术的发展。20世纪70年代后期出现了固定化细胞 技术。通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，由于保留了细胞内原有的多酶系统，这对多步催化的连续反应优势就更加明显。细胞固定化的方法也有多种，主要是吸附法和包埋法两大类。 吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。 包埋法是指将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。 海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。 固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 材料用具：干酵母，聚乙烯醇，海藻酸钠，无水CaC2，蒸馏水，烧杯，玻璃棒，酒精灯，三 角架，石棉网，注射器等。 探究过程： 探究反思： 固定化酵母菌技术有哪些优点? 探究示例： 请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。 （1）细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是 （2）包埋法固定化是指___________________________________ 。 （3）_____________________________________________________________________ 包埋法固定化细胞常用的载体有 ________________________________________________________________ _______________________ 。（答出三种即可） （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的优点是 （5）制备固定化酵母细胞的步骤为: 【解析】（1）固定化细胞的方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，一般来说多采用包埋法固定化，因为个大的细胞难以被吸附或结合，且不易从包埋材料中漏出。 （2）（3）包埋法固定化即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠等。 （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的成本更低?操作更容易。 （5）制备固定化酵母细胞的程序为：酵母细胞的活化T配制CaC2溶液T配制海藻酸钠溶液T海藻酸钠溶液与酵母细胞混合T固定化酵母细胞。 【答案】（1 ）细胞个大，不易从包埋材料中漏出；（2）将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多 孔性载体中；（3）明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等；（4）成本更低，操作更容易；（5）①酵母细胞的活化②配制CaC2溶液③配制海藻酸钠溶液④海藻酸钠溶液与酵 母细胞混合⑤酵母细胞的固定化。 【矫正反馈】 1?固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，其中适合细胞固定的方法是（） A.包埋法 B.物理吸附法 C.化学结合法 D.高温冷却法 2.与固定化酶相比，固定化细胞制备的特点是（） A.成本高，但操作更容易 B.成本低，但操作更复杂 C.成本高，且操作更复杂 D.成本低，且操作更容易 3.固定化细胞技术在废水处理中有着重要作用，用于处理含氮、氨丰富的废水的固定化微生物通常是（） ①酵母菌②青霉菌③硝化菌④反硝化菌 ①③D.②④ 让酵母细胞在缺水状态下休眠 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态 5.下面为制备固定化酵母细胞的步骤，其正确的操作程序是 （） ①海藻酸钠溶液与酵母细胞混合②配制海藻 酸钠溶液③酵母细胞的活化 ⑤配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaC2溶液 A.①②③④⑤ B.③①②⑤④ C.③⑤②①④ 6 .试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似（ 7 .下列有关固定化酵母细胞制备步骤叙述，不恰当的是（） A.应使干酵母与水混合并搅拌，以利于酵母菌活化 B.配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法 C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀 D.将与酵母混匀的海藻酸钠溶液注入CaC2溶液中，会观察到CaC2溶液中有球形的凝胶珠形成 8.用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时，为了能产生酒精，下列措施错误的是（） A.向瓶内泵入氧气 B.应将装置放于适宜的条件下进行 C.瓶内应富含葡萄糖等底物 D.将瓶口密封，效果更好 探究步骤探究记录结论或解释1.实验准备准备各种实验药品和器具。 2?制备麦芽汁称取一定质量的干麦芽粉，加入其质量4倍的水，在58~65C下 糖化3-4 h。每隔一定的时间用碘液测定，如果仍显蓝色，说明糖化还不完全，继续糖化直至不显色为止，得到麦芽汁。煮沸、冷却麦芽汁后用纱布过滤，再调节pH至6.0，在121 C下灭菌15min，制成无菌麦牙汁。 3.活化酵母菌细胞称取1g干酵母放入50 mL的小烧杯中，加入蒸馏水10 mL。用玻璃棒搅拌酵母菌液，使其活化1h左右。 4.制备固定化细胞称取4g聚乙烯醇（PVA）和0.2 g海藻酸钠，加入无菌水40 mL，适当加热至完全溶化，将溶液冷却至45 C，加入预热至35C的 酵母菌培养液，混合均匀形成酵母菌谒藻酸钠胶液；将酵母菌- 海澡酸钠胶液倒入带有孔径为 2 mm喷嘴的小塑料瓶或吸入注 射针筒中；以恒定的速度滴入预先盛有50 mL饱和硼酸-氯化钙 溶液的烧杯中，采用磁力搅拌器或手摇的方法使溶液不停地旋转；酵母菌-海藻酸钠胶液在溶液中逐渐形成凝胶珠。待凝胶珠在溶液中浸泡30 min后，取出用无菌水洗涤3次备用。 5.发酵麦芽汁将固定化酵母菌细胞凝胶珠加入300 mL无菌麦芽汁中，置于 25C下发酵7~9 d。待发酵结束后品尝其味道。A.①② B.③④ C. 4 .酵母细胞的活化是指（） A.让酵母细胞恢复运动状态 B. C.让酵母细胞内酶活性加倍 D. ④固定化酵母细胞 D.③②⑤①④ ）

第五章酶与细胞固定化技术

第五章酶与细胞的固定化技术 教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的畴,半透膜包埋法。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中的局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺点的方法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革 三、基本概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间围呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。 2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间围，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。 四、固定化酶优点 增加了酶的稳定性 能降低酶的总体费用 酶的分离和回收变得容易，并可重复使用 使反应过程的连续操作成为可能 反应产物也易于提取纯化 有利于过程设计和优化 拓广了酶的应用围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等） 第二节、酶的固定化方法 一、酶的固定化方法 1、酶的固定化方法（四大类方法） 1）吸附法 2）包埋法

3）交联法 4）化学共价法 其它（酶的逆胶束包囊法） 一、酶的固定化方法 2、选择方法依据： ⑴酶的性质 ⑵载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等 ⑶制备方法简便易行 ⒊衡量依据： ⑴测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率； ⑵研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； ⑶稳定性和不稳定原因的探究； ⑷对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。 （一）吸附法 1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。 此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。 2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。 3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用； 缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的. 4、常用吸附剂 各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时，这种结合发生分解。 5、举例： 将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS 中备用。 （二）包埋法 1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶包埋法 （网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。 2、优缺点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高； 缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶。 3、海藻酸盐包埋法 海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒

固定化酶和固定化细胞技术

张 海 龙 山东教育学院 生物系 Shan Dong Institute of Education 第九章　第九章　固 固定化酶与固定化细胞技术

第一节固定化酶 ?固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。 ?酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的特点（与游离酶相比） ?（1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化； ?（2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动化； ?（3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ?（4）酶的反应过程能够严格控制； ?（5）酶的利用率提高，生产成本降低； ?（6）能够进行多酶反应； ?（7）可以增加产物收率，提高产物的质量； ?（8）增加了生产的成本； ?（9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。

一、固定化酶的制备方法 ?根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法，遵循如下原则： –（1）必须维持酶的催化活性以及专一性； –（2）有利于实现连续化和自动化； –（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以便提高产品的质量； –（4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利用； –（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应； –（6）成本要低，以便于工业使用；

实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。?（一）包埋法： –1、网格型 –2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法?（二）吸附法： –1、物理吸附法 –2、离子吸附法 ?（三）、共价偶联法 ?（四）、交联法 ?（五）、共价结合法 –1、结晶法 –2、分散法

高中生物第三章酶的应用技术实践第二节固定化酶的制备和应用学案苏教版选修1

第二节固定化酶的制备和应用 学习导航明目标、知重点难点 固定化酶和固定化细胞的应用。(重点) 固定化酶与固定化细胞的制备方法。(难点) [学生用书P43] 一、阅读教材P63分析固定化酶 1．概念：是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2．优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用，且保持了酶的催化性能，可实现酶促反应的连续化和自动化。 3．制备固定化酶的常用方法 目前，制备固定化酶的方法主要有物理吸附法、化学结合法、包埋法等。 二、阅读教材P64～65分析固定化细胞技术的应用 1．应用：固定化细胞可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 2．优点 (1)固定化细胞技术无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。 (2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 (4)细胞生长停滞时间短，反应快等。 3．缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到一定限制。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。 4．酵母菌细胞的固定化技术的主要流程 准备各种实验药品和器材 ↓ 制备麦芽汁 ↓

活化酵母菌细胞 ↓ 配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液 ↓ 制备固定化细胞 ↓ 浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤 ↓ 发酵麦芽汁 判一判 (1)酶在催化时会发生变化，不可反复利用。(×) (2)某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应。(×) (3)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作用。(×) (4)制备固定化细胞的方法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法。(×) 连一连 固定化酶技术[学生用书P44] 由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。人们针对酶的这种不足寻着改善的方法之一是固定化酶技术的应用。结合教材P63内容完成以下探究。 (1)图A为物理吸附法，它的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。 (2)图B为化学结合法，它是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中(如图C)，包埋成格子型；或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中(如图D)，包埋成微胶囊型。 各种固定化酶方法的比较

酶与细胞固定化技术样本

第五章酶与细胞固定化技术 教学目：使学生理解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）概念及意义，掌握酶惯用固定化技术，理解固定化酶性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）范畴,半透膜包埋法。 教学办法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺陷办法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎初次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA持续生产L-AA实现酶应用史上一大变革 三、基本概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间范畴内呈闭锁状态存在酶，能持续地进行反映，反映后酶可以回收重复运用。涉及酶与不溶性载体结合“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中酶。 2、固定化细胞（原生质体）

指被限制自由移动细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范畴内，但细胞仍保存催化活性并具备能被重复或持续使用活力。 四、固定化酶长处 增长了酶稳定性 能减少酶总体费用 酶分离和回收变得容易，并可重复使用 使反映过程持续操作成为也许 反映产物也易于提取纯化 有助于过程设计和优化 拓广了酶应用范畴（多酶系统酶反映，非水相酶反映，生物传感器探头等） 第二节、酶固定化办法 一、酶固定化办法 1、酶固定化办法（四大类办法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其他（酶逆胶束包囊法） 一、酶固定化办法 2、选取办法根据： ⑴酶性质 ⑵载体来源、价格、机械性能、载体功能基团和交联度等 ⑶制备办法简便易行 ⒊衡量根据： ⑴测定固定化酶活力，以拟定固定化过程活力回收率；

第五章酶与细胞固定化技术之令狐文艳创作

第五章酶与细胞的固定化技术 令狐文艳 教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的范畴,半透膜包埋法。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中的局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺点的方法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革 三、基本概念

1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议）（Immobilized Enzyme) 指在一定空间范围内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。 2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范围内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。 四、固定化酶优点 增加了酶的稳定性 能降低酶的总体费用 酶的分离和回收变得容易，并可重复使用 使反应过程的连续操作成为可能 反应产物也易于提取纯化 有利于过程设计和优化 拓广了酶的应用范围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等） 第二节、酶的固定化方法 一、酶的固定化方法 1、酶的固定化方法（四大类方法） 1）吸附法

2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其它（酶的逆胶束包囊法） 一、酶的固定化方法 2、选择方法依据： ⑴酶的性质 ⑵载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等 ⑶制备方法简便易行 ⒊衡量依据： ⑴测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率； ⑵研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； ⑶稳定性和不稳定原因的探究； ⑷对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。 （一）吸附法 1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。 此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含

固定化酶与固定化细胞

固定化酶 水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。 固定化酶（immobilized enzyme），酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。 酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。 固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。 物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。 化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过 酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法. 其中吸附法和共价键法又可统称为载体结合法。 具体方法 吸附法 利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。 常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。 载体结合法 最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。

2016-2017学年高中生物第3章第4节酶的固定化检测

第四节酶的固定化 一、固定化酶 1．含义 通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与不溶性的载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应。 2．方法 (1)共价键结合法：通过化学反应将酶以共价键结合到尼龙等载体上。 (2)包埋法：将酶包埋到多孔性凝胶中的固定化方法。 (3)物理吸附法。 3．优点 (1)固定化酶的活性稳定，可反复使用； (2)固定化酶能与反应液分开，制品较易纯化； (3)工业化生产可实现大批量、连续化、自动化； (4)极大地降低了生产成本。 4．缺点 需要制备纯净的酶，稍有不慎，酶就会失活。 二、固定化细胞 1．含义 用适当的载体将合成酶的细胞固定起来。 2．优点 比固定化酶更简捷，使用寿命更长。 三、木瓜蛋白酶的固定化操作技术 取尼龙布浸入等体积的CaCl2溶液和甲醇溶液中10 s左右―→盐酸溶液中室温下水解45 min―→蒸馏水冲洗至中性―→室温下放入戊二醛溶液中浸泡20 min―→磷酸缓冲液(pH 为7.8)反复洗涤―→木瓜蛋白酶溶液中固定3.5 h，温度为4_℃―→用NaCl溶液洗去多余的蛋白酶。 预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中

一、酶、固定化酶与固定化细胞的比较 ①固定化细胞使用的都是活细胞，因此应提供一定的营养物质。 ②固定化细胞由于保证了细胞的完整性，因而酶的环境改变较小，酶活性受外界影响也较小。 二、固定化酶的制备及利用 1．酶的固定化：(1)18.6%的CaCl2溶液和甲醇溶液处理(10 s)，冲洗、吸干。 (2)3.65 mol/L的盐酸水解(45 min)，蒸馏水冲洗至中性。 (3)在5%的戊二醛溶液中浸泡(20 min)。 (4)0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤，(多次)吸干。 (5)放1 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中(4 ℃处理3.5 h)。 ↓ 2．检验酶的活性：(1)用固定化酶在适宜温度下分解蛋白质(10 min) (2)用双缩脲试剂检验 ↓ 3．酶的再利用：用取出的固定化酶再分解蛋白质