大豆gma-miR160o启动子的克隆及植物表达载体构建

大豆基因的克隆及表达载体的构成大豆（Glycine max）是一种重要的粮食作物和油料作物，其种子中含有高蛋白、高油、高碳水化合物等营养成分，因此在全球范围内广泛种植和应用。

为了深入研究大豆的生长发育、代谢调控等基本生物学问题，以及开发新的大豆品种，需要对大豆基因进行克隆和表达研究。

下面我们来介绍大豆基因的克隆及表达载体的构成。

一、大豆基因的克隆大豆基因的克隆是指从大豆中分离出目标基因的过程。

大豆基因的克隆方法主要有PCR扩增、基因文库筛选和基因芯片等。

其中，PCR扩增是最常用的方法之一。

PCR扩增是指利用DNA聚合酶酶链反应（PCR）技术，通过引物特异性扩增目标基因序列。

PCR扩增方法具有快速、简便、高效、灵敏等优点，适用于小片段基因的克隆。

而对于大片段基因的克隆，则需要使用基因文库筛选和基因芯片等方法。

二、大豆基因的表达载体的构成大豆基因的表达载体是指将目标基因插入到表达载体中，通过转化到宿主细胞中，使目标基因得以表达的载体。

大豆基因的表达载体构成主要包括以下几个部分：1.启动子：启动子是指调控基因转录的DNA序列，它位于基因的上游区域，与转录因子结合后启动基因的转录。

在大豆基因表达载体的构建中，常使用的启动子包括CaMV 35S启动子、nos启动子、ubi启动子等。

2.选择性标记基因：选择性标记基因是指在转化过程中，通过对宿主细胞进行筛选，选择带有表达载体的细胞的基因。

在大豆基因表达载体的构建中，常使用的选择性标记基因包括抗生素耐药基因、草酸乙酯酯化酶基因等。

3.多克隆位点：多克隆位点是指在表达载体中设置多个限制性内切酶切割位点，方便将目标基因插入到载体中。

在大豆基因表达载体的构建中，常使用的多克隆位点包括pUC19多克隆位点、pGEM-T多克隆位点等。

4.表达标签：表达标签是指将目标基因与特定的标签融合，以便于检测目标基因的表达情况。

在大豆基因表达载体的构建中，常使用的表达标签包括His标签、GST标签、FLAG标签等。

大豆GmPR10基因克隆与植物表达载体的构建陈华涛;陈新;顾和平;张红梅;袁星星;崔晓艳【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2011(027)003【摘要】为探明大豆中PR10蛋白质基因的抗大豆花叶病毒(SMV)作用机理，从抗SMV材料中克隆到GmPR10基因完整的cDNA序列，GmPR10基因的开放阅读框(ORF)全长477 bp，编码158个氨基酸。

序列比对与进化树分析结果表明：GmPR10是大豆中一个新的PR10蛋白质基因，GmPR10基因在大豆的根、茎、叶中均能表达，接种大豆SMV后该基因在大豆叶片中被强烈诱导并高效表达，推测其可能使植物本身获得系统抗性以抵抗外来病原菌的侵袭。

该研究构建了GmPR10基因的植物表达载体，为探究GmPR10基因在大豆抗病中的分子作用机理打下了基础。

【总页数】6页(P494-499)【作者】陈华涛;陈新;顾和平;张红梅;袁星星;崔晓艳【作者单位】江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏南京210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏南京210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏南京210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏南京210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏南京210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.菊花CmAP1基因克隆及其植物表达载体构建 [J], 梁芳;黄萍;袁秀云;崔波;李霞2.甘蓝型油菜GPDH基因克隆、表达分析及植物过表达载体构建 [J], 张超;付三雄;周小婴;唐容;黄莎;杨克相;戚存扣3.甘蓝型油菜GPDH基因克隆、表达分析及植物过表达载体构建 [J], 张超; 付三雄; 周小婴; 唐容; 黄莎; 杨克相; 戚存扣4.枇杷果实中NAD-MDH基因克隆及植物表达载体构建 [J], 寇燕;杨俊;高欢欢;陈旭;郭傲;郑国华5.龙眼DlZAT10基因克隆与植物超表达载体构建 [J], 李琳;王颖;李浩然;丁峰;潘介春;彭宏祥;张树伟;何新华;徐炯志;黄幸;王金英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大豆组织特异启动子的克隆与功能分析曹译文;宋阳;渠可心;王丕武【摘要】采用同源序列法克隆得到了大豆根部特异性启动子、种皮特异性启动子、种子特异性启动子,核苷酸序列大小分别为2 500bp、1 832bp、1 268bp,分别具有CANNTG-motifs、GATA-box、ACGT等启动子表达元件,并分别构建了这3个组织特异性启动子的植物报告表达载体.通过农杆菌介导法将3个表达载体转入烟草NC89,通过组织化学染色和GUS基因的相对表达量分析验证3个启动子的功能.通过转化获得了根部特异性启动子转基因烟草植株11株,种皮特异性启动子转基因烟草植株4株,种子特异性启动子转基因烟草植株8株,转35S启动子启动GUS基因的阳性烟草植株7株.GUS化学组织染色结果表明,克隆得到的根、种皮、种子特异性启动子都表现为组织特异性表达,表达水平明显高于叶片、茎部、花等部位.进一步的荧光定量PCR结果显示,根部特异性启动子GUS的相对表达量在根部最高,而在茎、叶、种子、种皮、花中表达量较低;种皮部特异性启动子GUS的相对表达量在种皮最高,而在根、茎、叶、种子、花中表达量较低;种子特异性启动子GUS的相对表达量在种子最高,而在根、茎、叶、种皮、花中表达量较低,但是与35S启动子相比,这3个特异性启动子的GUS相对表达量在相应的组织均低于35S启动子.%In this study,the soybean root specific promoter,seed specific promoter and seed coat specific promoter were cloned by homologous sequence method respectively.Their sizes were 2 500bp,1 832bp and 1268bp.They had different expression elements including CANNTG-motifs,GATA-box,ACGT.Three plant expression vectors of these tissue specific promoters were constructed and transferred into Nicotiana tabacum NC89 by Agrobacterium-mediated method to prove GUS activityof different promoters.Soybean root,seed coat and seed specific promoter nucleotide sequence were isolated by PCR method.Then 11 root specific promoter transgenic plants,4 seed coat specific promoter transgenic plants,8 seed specific promoter transgenic plants,and 7 35S-promotertransgenic plants had been obtained.GUS activity assays indicated that GUS gene expression level in root,seed and seed coat were higher than leaf,shoot and flower.Further quantitative real time PCR results showed that the expression levels of GUS gene of root specific promoter in root were higher than those in stem,leaf,seed,seed coat and flower;the expression levels of GUS gene of seed coat specific promoter in seed coat were higher than those in root,stem,leaf,seed and flower;the expression levels of GUS gene of seed specific promoter in seed were higher than those in root,stem,leaf,seed coat and flower.But the expression levels of GUS of these three tissue specific promoters were lower than those of 35S promoter in each tissues.【期刊名称】《中国油料作物学报》【年(卷),期】2017(039)006【总页数】7页(P771-777)【关键词】启动子;组织特异性;基因表达;相对表达量分析【作者】曹译文;宋阳;渠可心;王丕武【作者单位】吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118【正文语种】中文【中图分类】S565.103启动子是调控目的基因的重要顺式作用元件。

摘要氨基酸通透酶（AAP）在植物吸收和转运氨基酸的过程中发挥至关重要的作用。

拟南芥AtAAP1是植物中发现的第一个氨基酸转运蛋白，在水稻、玉米、马铃薯、豌豆、蚕豆、菜豆等农作物中也有较多报道。

目前，关于大豆GmAAP的研究却较为少见，AAP 能提高豆科植物对外源氮的吸收与利用率，增加种子内贮藏蛋白含量，进而提升大豆品质。

本研究从大豆中成功克隆出GmAAP基因，对其进行生物信息学分析和亚细胞定位，明确该基因行使功能的区域；同时分别在大豆和转基因拟南芥中对该基因的表达模式进行研究；通过20种编码氨基酸亲和试验，结合转GmAAP基因拟南芥种子中20种编码氨基酸含量的试验结果，明确GmAAP蛋白对氨基酸的吸收特性；通过单一氨基酸培养试验，测定转基因大豆发根GmAAP基因表达和氮代谢关键酶活性，旨在解析GmAAP 基因与氮代谢的关系。

试验结果可为GmAAP功能的研究奠定基础，同时也为大豆氮素的高效利用提供候选基因。

主要结果如下：1. 以大豆Williams 82为试验材料，通过RT-PCR同源克隆到GmAAP基因，其开放阅读框长度为1440 bp，编码479个氨基酸。

生物信息学分析表明，GmAAP蛋白分子量为53.286 kD，理论等电点为8.93，不稳定指数为34.04，蛋白结构稳定；各二级结构占据比例为α-螺旋（47.18%）、β-转角（2.71%）、β-折叠（15.66%）、无规卷曲（34.45%）；跨膜区与疏水性分析显示其含有10个跨膜区，且构成跨膜区的氨基酸多为疏水性氨基酸；GmAAP与野生大豆GsAAP亲缘关系最为相近，且序列比对一致性为100%，与绿豆、木豆、蒺藜苜蓿一致性依次为91.93%、90.55%、82.78%，且其10个跨膜区序列较为保守。

构建融合表达载体，利用PEG-Ca2+介导法转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析，明确了GmAAP定位在质膜上。

2. 通过荧光定量PCR分析GmAAP基因在大豆中的表达模式，发现其主要表达部位是根和叶，其次是果荚和种子，在茎和花中表达量最低。

大豆GmeR基因启动子的克隆及序列分析摘要:GmeR是一种植物酶学抗病基因,编码的蛋白质具有丝氨酸乙醛酸转氨酶(SGT)活性,受水杨酸诱导,与大豆霜霉病抗性密切相关｡为了进一步研究GmeR基因的抗病机理,我们利用染色体步移技术克隆得到长为1 036 bp的GmeR基因5′上游片段,序列分析显示此片段含有典型的TATA-box､CAAT-box､G-box和as-1顺式调控元件｡关键词:GmeR基因;启动子克隆;染色体步移技术;as-1调控元件Cloning and Sequence Analysis of the GmeR Gene Promoter from Soybean(Glycine max L.)Abstract: GmeR was an enzymatic disease resistance gene, the protein coded had the activity of serine glyoxylate aminotransferase(SGT), which was induced by salicylic acid(SA) and was closely related to soybean downey mildew resistance. In order to investigate the resistant mechanism of GmeR gene, the 1 036 bp 5′up stream region of the GmeR gene was cloned by the genome walking. Sequence analysis reveals that it contains classical TATA-box, CAAT-box, G-box, which are conserved in eukaryotic gene promoters, and other cis-regulatory elements such as as-1 regulatory element.Key words: GmeR gene; promoter cloning; genome walking; as-1 regulatory element霜霉病是一种由霜霉菌引起的真菌性植物病害｡植株从幼苗到收获各阶段均可发病,且以成株受害较重,主要危害叶片,由基部向上部叶发展｡发病初期在叶面形成浅黄色近圆形至多角形病斑,空气潮湿时叶背产生霜状霉层,有时可蔓延到叶面｡后期病斑枯死连片,呈黄褐色,严重时全部外叶枯黄死亡｡霜霉病在春末夏初或秋季连续阴雨天气最易发生,病害严重时可造成20%~40%的产量损失｡该病害在甜瓜､黄瓜､大豆等一些作物中经常发生｡以大豆霜霉病为例,我国大豆的霜霉病发生区主要分布在东北和华北地区,在大豆生育期,气候凉爽的地区发病较重｡病害严重时引起早期落叶､叶片凋枯､种粒霉烂,减产达30%~50%｡幼苗､成株叶片､荚及豆粒均可被害,带菌种子长出的幼苗可使整个植株发病｡对于霜霉病等植物病害的防治,最为根本的措施是培育抗病植株｡而与植物抗病性相关的基因则对于抗病植株的培养有着非常重要的作用｡近年来,越来越多的试验表明组成型表达的基因在植物的抗病性方面起着重要的作用｡Wang等[1]和Hao等[2]报道调节碳代谢的腺苷酸激酶(Adenosine kinase)和SNF1(Sucrose non-fermenting-1)与植物的抗病毒相关｡拟南芥中编码甘油激酶的NHO1基因是抗寄生植物抵抗Pseudomonas syringae菌必需的,而致命的P. syringae对植物的危害则是通过茉莉酸信号途径抑制NHO1基因的表达而起作用[3]｡Taler等[4]从野生型甜瓜中克隆了两种同源性很高的编码丝氨酸乙醛酸转氨酶(Ser glyoxylate aminotransferase,SGT)的基因At1和At2,氨基酸和核苷酸序列比较表明,At1和At2不属于任何一类已知的抗性基因｡At1和At2在转基因甜瓜中的表达明显提高了丝氨酸乙醛酸转氨酶､丙氨酸乙醛酸转氨酶(Ala glyoxylate aminotransferase, AGT)和乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase,GO)等植物光呼吸中的关键酶的活性和霜霉病抗性｡这些酶的抗病机制被认为是一种新的防卫机制——植物酶学抗病性(Enzymatic disease resistance,ER)｡近年来,人们在大豆的霜霉病酶学抗性方面的研究也取得了一些进展｡崔玉瑰等[5]通过将霜霉病敏感大豆材料黑农10号与抗性大豆材料绥76-5187和绥78-5035进行遗传比较分析,发现大豆霜霉病抗性是由单基因控制的｡本实验室已从大豆抗霜霉病抗性品种早丰5号克隆一个新的丝氨酸乙醛酸转氨酶基因——GmeR(GenBank accession NO. DQ167250),研究证实具有霜霉病抗性｡为了更好的研究丝氨酸乙醛酸转氨酶抗病机理,从大豆抗性品种早丰5号提取总DNA,利用Genome walking克隆了GmeR基因的上游序列并对其结构进行了分析,为进一步了解GmeR基因的表达调控机制打下基础｡1材料与方法霜霉病抗性品种早丰5号种于中国农业科学院生物技术研究所网室,该种子由国家作物种质中心秋丽娟博士惠赠｡大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α菌株由本实验室保存｡Genome WalkerTMUniversal Kit购于Clontechs公司,pMD18-T Vector和限制性内切酶均购自于TaKaRa公司｡大豆基因组DNA的提取方法为:取25~100 mg新鲜大豆叶片,加液氮碾成粉末,转入1.5 mL离心管中｡加450 μL提取缓冲液(100 mmol/L Tris-Cl,500 mmol/L NaCl, 10 mmol/L β-巯基乙醇,50 mmol/L EDTA,pH值8.0) 及100 μL 10% SDS,剧烈振荡｡65℃水浴30 min,加160 μL 3 mol/L NaAc(pH值 5.2), 置冰上20 min｡12 000 r/min 4℃离心15 min,取上清｡加2倍体积的预冷的无水乙醇,颠倒混匀以利于DNA析出｡用玻棒挑出丝状DNA,置于1.5 mL小离心管中,70%乙醇漂洗数次后晾干备用｡基因组DNA步移文库的构建参照Genome WalkerTM Universal Kit 中的说明书进行｡基因组DNA 分别采用DraⅠ､Eco RV､PvuⅠ和StuⅠ平末端酶消化,酶切产物与接头连接,构建了4个基因组步移文库(DL1､DL2､DL3 和DL4)｡参照我们克隆并已登陆在GenBank中的GmeR基因的cDNA序列(Accession NO. DQ167250)和Genome WalkerTM Universal Kit的要求,设计两个特异引物PGSP1(5′-AAGAGATGGTTTCTTCCTGGTGCATTG-3′)和PGSP2(5′-TTCCCTGCCTTCAAATTTCAAACCTC-3′)｡引物由上海生工生物工程有限责任公司合成｡大豆GmeR基因启动子克隆分两轮PCR反应｡第一轮PCR反应:在4个0.5 mL的EP管(C1~C4)中分别以构建好的DNA文库(DL1､DL2､DL3 和DL4)为模板,以基因特异引物PGSP1和接头引物(GenomeWalkerTM Universal Kit提供)AP1(5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)在热循环仪(BIO-RAD)上进行PCR反应｡反应程序为: 95℃预变性5 min;紧接着7个循环为94℃ 25 s,72℃ 3 min;然后接着32个循环,94℃ 25 s,67℃ 3 min;最后67℃延伸7 min｡反应完成后, 将上述4管PCR产物稀释50倍(D1~D4)用作第二轮PCR 扩增的模板｡第二轮PCR 反应: 以基因特异引物PGSP2和接头引物AP2 (5′- ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′)进行PCR 扩增,反应程序为:首先94℃ 25 s, 72℃ 3 min扩增5个循环;紧接着94℃ 25 s, 67℃ 3 min扩增20个循环,最后67℃延伸7 min｡为了便于结果的分析,我们根据Genome WalkerTM Universal Kit 中的方法增加了阴性对照和它提供的阳性对照｡所得最终PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,通过胶回收纯化后与pMD18-T Vector连接,转化E. coli DH5α,筛选重组子酶切鉴定,验证后送中国农业科学院重大工程楼测序部测序｡GmeR基因5′上游片段序列调控元件用植物顺式调控元件数据库PlantCARE 和PLACE分析｡2结果与分析2.1大豆GmeR基因上游DNA序列的克隆用4个内切酶(DraⅠ､Eco RV､PvuⅠ和StuⅠ)对大豆基因组进行消化,酶切产物与接头连接用染色体步移技术,经两轮PCR扩增后,从步移文库DL2中克隆启动子的片段(图1)｡2.2序列分析通过测序及序列比较发现该片段与GmeR基因cDNA序列的5′端部分片段重合,是大豆GmeR 基因5′上游区域,片段长度为1 036 bp｡采用PLACE网站(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)和Neural Network Promoter Prediction软件以及植物顺式调控元件数据库PlantCARE对克隆的大豆GmeR启动子序列进行了分析｡结果显示,在+1处C为可能的转录起始密码子｡预测转录起始位点上游含有3个TATA-box(-17bp､-47bp和-196bp),3个CAAT-box(-23bp､-227bp､-341bp)和有3个G-box(-139bp､-214bp､-547bp)｡并且克隆的片断内AT 碱基含量较高,占67.5%｡通过分析发现与生物抗病相关的顺式作用元件为as-1(激活序列1)顺式调控元件｡该元件位于转录起始位点下游有+236bp和+273bp处(图2,方框表示),它们的共有序列为TGAC｡3小结与讨论植物启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子特异结合､决定基因转录起始的DNA序列｡植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子ATG(图2,箭头表示)上游｡植物启动子由核心元件和上游元件构成,如TATA-box(Goldberg-Hogness框或Hogness框)和起始因子(Initiator)｡从序列分析可以看出,克隆得到的大豆GmeR基因上游片段含有典型的植物启动子核心元件｡植物启动子按其转录方式可以分为组成型､组织特异型和诱导型启动子｡当植物受到真菌､细菌､病毒等病原微生物侵染时,植物体内编码相关保护蛋白质的基因被激活,从而消除有害代谢产物对植物自身的伤害,调控这类保护蛋白质的基因表达的启动子为生物胁迫诱导型启动子[6]｡通过前期的研究发现,GmeR基因编码的丝氨酸乙醛酸转氨酶与植物抗霜霉病有关,GmeR基因的表达受到水杨酸的诱导,对大豆GmeR基因启动子的序列分析发现含有as-1顺式调控元件,推测其可能是水杨酸应答元件,该启动子为诱导型启动子｡水杨酸是一种植物在逆境反应中起关键性作用的激素[7]｡当病原菌侵染植物时,体内的水杨酸含量急剧增加而激活抗性基因的转录和表达抗体,从而形成有效的防御性应答[8],Garretón等[9]研究发现水杨酸通过活性氧作用于as-1顺式调控元件从而诱导抗病性基因的转录和表达｡Redman等[10]研究发现as-1顺式调控元件还可以被化学逆境激活,如除草剂､农药､杀虫剂等,并且有组织的特异性,尤其是在子叶中高效表达｡研究为进一步了解GmeR基因的表达调控机制和植物抗病机理打下了一定的理论基础｡参考文献:[1] WANG H,HAO L,SHUNG C Y,et al. Adenosine kinase is inactivated by geminivirus AL2 and L2 proteins[J]. Plant Cell, 2003,15:3020-3032[2] HAO L, WANG H, SUNTER G, et al. Geminivirus AL2 and L2 proteins interact with and inactivate SNF1 kinase[J]. Plant Cell, 2003,15:1034-1048.[3] KANG L, LI J, ZHAO T, XIAO F, et al. Interplay of the Arabidopsis nonhost resistance gene NHO1 with bacterial virulence[J]. Proc Natl Acad Sci, 2003,100:3519-3524.[4] TALER D, GALPERIN M, BENJAMIN I, et al. Plant eR genes that encode photorespiratory enzymes confer resistance against disease[J]. Plant Cell, 2004,16:172-184.[5] 崔玉瑰, 姜成喜, 吕德昌,等. 大豆霜霉病(Peronospora manschurica)抗病性遗传分析[J]. 大豆科学,1992,11:31-35.[6]MOU Z, FAN W, DONG X. Inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPR1 function through redox changes[J]. Cell, 2003,7:935-944.[7] FEYS B J, PARKER J E. Interplay of signaling pathways in plant disease resistance[J]. Trends Genet, 2000,16: 449-455.[8] Brodersen P, Malinovsky F G, Hematy K, et al. The role of salicylic acid in the induction of cell death in Arabidopsis acd11[J]. Plant Physiology, 2005,138:1037-1045.[9] GARRETON V, CARPINELLI J, JORDANA X, et al. The as-1 promoter element is an oxidative stress-responsive element and salicylic acid activates it via oxidative species[J]. Plant Physiol, 2000,130(3):1516-26.[10] REDMAN J, WHITCRAFT J, JOHNSONC, et al. Abiotic and biotic stress differentially stimulate as-1 element activity in Arabidopsis[J]. Plant Cell Rep, 2002,21:180-185.。

大豆贮藏蛋白基因启动子的克隆与功能分析的开题
报告
1. 研究背景和意义：
大豆是我国传统农产品之一，具有高蛋白、高营养、高附加值等优点，在国内外市场上的竞争力也越来越高。

大豆贮藏蛋白是大豆种子储
存的主要蛋白质，起到营养保障的作用。

因此，探究大豆贮藏蛋白基因
的调控机制，有助于对大豆蛋白质的合理利用和优化生产过程，能够对
我国大豆产业的发展起到积极的促进作用。

2. 研究内容和目的：
本研究的主要内容是对大豆贮藏蛋白基因启动子的克隆与功能分析。

通过PCR克隆大豆贮藏蛋白基因启动子序列，并构建相应的植物表达载体，转化到拟南芥中进行功能验证，确定启动子的启动能力及其响应外
界环境因素的特性。

3. 研究方法：
（1）PCR克隆大豆贮藏蛋白基因启动子序列。

（2）构建植物表达载体，将启动子与报告基因GUS或荧光蛋白等
结合，形成特定表达载体，并在大肠杆菌中进行验证。

（3）利用农杆菌介导法将载体转化到拟南芥中。

（4）利用相应的荧光探针或GUS染色法验证启动子在不同生长阶段、不同组织等特定条件下的表达活性，评价启动子的特性及启动能力。

4. 研究预期结果：
预计通过对大豆贮藏蛋白基因启动子的克隆与功能分析，发掘该启
动子的在不同环境条件下的表达特性，深入探究其响应外界环境因素的
机制和生物学意义；为大豆基因工程研究和新品种的选育提供科学基础；还有望为其他植物启动子研究提供有益的实验思路和方法。

用于大豆植物内瞬时表达系统的方法和组合物引言大豆（G ly ci ne ma x）是一种广泛种植的重要经济作物，具有丰富的蛋白质和油脂含量。

为了改良大豆的品种和增加其生产效率，人们对大豆植物内瞬时表达系统的研究日益深入。

本文将介绍一种用于大豆植物内瞬时表达系统的方法和组合物，以期为大豆的遗传改良提供一种高效、可行的策略。

方法和材料大豆基因转染首先，我们需要制备适用于大豆的转染载体。

我们采用的是p C AM BI A1300载体，该载体包含了适用于植物的41S启动子，可在大豆中实现高效的表达。

然后，将目标基因插入载体中，并利用冷冻冻融转化的方法将构建好的载体导入大豆的叶片细胞。

大豆原生质体提取为了获得足够的原生质体，我们需要选择适宜的大豆品种，并将其种子进行表面消毒处理。

接着，将种子切碎并用入激素的培养基中进行养殖。

在培养的过程中，通过适当地调节培养基的成分和条件，可以提高原生质体的提取效率。

原生质体转染和选择性筛选将构建好的转染载体与原生质体进行共培养，使目标基因能够被原生质体吸收并表达。

转染后，将携带目标基因的原生质体进行选择性筛选，以便筛选出成功转化的株系。

结果与讨论经过上述的步骤，我们成功地构建了用于大豆植物内瞬时表达系统的方法和组合物，并实施了基因转染和选择性筛选。

通过检测转化后的大豆株系，我们发现目标基因在转染后得到了高效的表达。

这表明我们所设计的方法和组合物在大豆植物内具有良好的功能和效果。

结论本文介绍了一种用于大豆植物内瞬时表达系统的方法和组合物。

通过使用适宜的转染载体和培养条件，我们成功地实现了对大豆中目标基因的高效表达。

这一方法和组合物的应用，将为大豆的遗传改良提供了一个可行的策略，并有望促进大豆产业的发展和提高产量。

参考文献1.张三,李四.(2010).大豆遗传改良的新策略.农业科学进展,10(3),123-130.2.王五,赵六.(2015).大豆植物内瞬时表达系统的研究进展.遗传学报,42(5),432-438.。

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(11): 2706 2714 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail:***************本研究由海南省重点研发计划项目(ZDYF2022XDNY135), 中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ZDRW202201)，国家重点研发计划项目(2021YFD1201603-2)和国家自然科学基金项目(31601302)资助。

This study was supported by the Key Research and Development Program of Hainan Province (ZDYF2022XDNY135), the Agricultural Sci-ence and Technology Program for Innovation Program (CAAS-ZDRW202201), the National Key Research and Development Program of China (2021YFD1201603-2), and the National Natural Science Foundation of China (31601302).*通信作者(Corresponding authors): 张辉,E-mail:******************;胡正,E-mail:*****************同等贡献(Contributed equally to this work)第一作者联系方式: 陈向前,E-mail:***********************;姜奇彦,E-mail:******************Received (收稿日期): 2021-11-26; Accepted (接受日期): 2022-02-25; Published online (网络出版日期): 2022-03-08.URL: https:///kcms/detail/11.1809.S.20220305.1514.002.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14220大豆多基因编辑表达载体的构建及应用陈向前** 姜奇彦** 孙现军 牛风娟 张慧媛 胡 正* 张 辉*中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081摘 要: 大豆基因家族往往存在多个功能相似的基因, 开发多基因编辑载体对多基因或基因家族进行编辑, 对遗传转化效率低的大豆的基因编辑及基因功能研究具有重要的应用价值。

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(2): 216 223/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2010CB125906)资助。

*通讯作者(Corresponding author): 喻德跃, E-mail: dyyu@, Tel/Fax: 025-********第一作者联系方式: E-mail: woshijjw@Received(收稿日期): 2010-07-02; Accepted(接受日期): 2010-09-28.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00216大豆丙二烯氧化物合酶基因(GmAOS )及其启动子的克隆与分析吴娟娟1,2 吴 倩1 喻德跃1,*1南京农业大学国家大豆改良中心 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京210095; 2 南通大学医学院生化教研室, 江苏南通 226001摘 要: 利用RT-PCR 、RACE 和LA PCR 相结合的方法, 从大豆中克隆了GmAOS 基因及其启动子序列(登录号为 EU366252), GmAOS 基因共1 789 bp 碱基, 等电点8.97, 分子量58.3 kD, 在3种不同抗性大豆材料中均有2个拷贝。

生物信息学分析表明, GmAOS 酶的N 末端有典型叶绿体定位信号肽, 基因序列上有多个丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的磷酸化位点。

该研究克隆到ATG 上游472个碱基的GmAOS 基因启动子部分序列, 其含有赤霉素的响应元件(TAACAA), 可诱导性抗性基因响应元件(W box), 细菌和盐诱导的响应元件(GAAAAA), 茉莉酸诱导的响应元件(G box)。

GmAOS 能强烈响应茉莉酸的诱导, 且在黄皮小青豆(高抗斜纹夜蛾)中表达量高于徐疃大豆, 两种材料抗虫性的差异可能是由GmAOS 基因受诱导后的表达量差异引起的, 即GmAOS 基因与作物抗虫性相关, 可作为培育高诱导抗性材料的候选基因。