白色念珠菌生物被膜形成和由其产生的耐药机制专业班级：生物制药姓名：邓海艳课程名称：微生物学摘要：白色念珠菌以生物被膜方式生长是相对于其悬浮生长状态而言的另一种独特的生长形式，其最具特征的表型是对多种抗真菌药物表现出高度耐药。
本文对近年来白色念珠菌生物被膜形成的分子机制及其产生的耐药机制的研究进展进行综述。
关键词：白色念珠菌；生物被膜；抗真菌药物；耐药真菌近20多年来，由于免疫抑制剂和广谱抗生素的使用、各种生物装置的体内置入和导管的留置、艾滋病患者的不断增加等，使得以念珠菌为主的深部真菌感染率逐年上升。
在美国流行的院内获得性感染中，念珠菌引起的感染在血源性感染中位居第4位，在导管相关性感染中居第3位，即便使用了抗真菌药物，其死亡率仍高达40%。
在所有念珠菌性感染中，白色念珠菌感染率占45%[1]。
从患者体内取出的导管或生物装置表面可见念珠菌以生物被膜的形式黏附生长。
对体外建立的白色念珠菌形成生物被膜的模型进行抗真菌药物敏感性试验时发现，菌株对常用药物均表现为高度耐药。
因此，以生物被膜形式生长并表现出高度耐药性的体内导管或生物装置相关性白色念珠菌感染给临床治疗带来很大难度，迫使临床医师在进行抗真菌治疗的同时必须从患者体内取出导管或生物装置，从而影响到患者的预后。
因此，对白色念珠菌生物被膜的形成和由此引发的耐药机制的研究具有重要的临床价值。
本文就近年来对白色念珠菌生物被膜形成过程、耐药机制以及有关防治方面的研究进展进行综述。
1．生物被膜的定义生物被膜是一个微生物聚集群体，是微生物不可逆地与无活力物体或活组织表面接触，由自身产生的细胞外基质包裹着活菌细胞形成的微生态，其具有高度耐药性的特异表型[2]，是相对于单个分散游离状态真菌细胞而言的另一种独特的微生物生存方式。
2.白色念珠菌生物被膜的结构与特征典型的白色念珠菌形成的生物被膜为基底数层酵母样细胞黏附于无活力物体或活组织表面，其上方有细胞外基质覆盖，内有大量菌丝样细胞生长。
与细菌形成的生物被膜相似，白色念珠菌形成的生物被膜也是细胞黏附于物体表面，外面包裹着细胞外多糖，同时表现出高度的耐药性。
但白色念珠菌的生物被膜有其独特的特点。
Chandra等使用共聚焦显微镜分别观察了白色念珠菌在聚甲基丙烯甲酯条和硅胶上形成生物被膜的过程，发现典型生物被膜的形成需要经历3个时段：早期中期成熟期。
3.白色念珠菌生物被膜形成的分子机制白色念珠菌黏附生物材料后表现出了和游离培养条件下截然不同的表型。
这是细胞启动了特殊的转录机制，并随之引起复杂生理变化的结果。
这期间经历了黏附和聚集、信号传导、细胞内基因的选择性表达等过程。
Garcia-Sanchez等使用基因芯片对其进行检测后发现，白色念珠菌在形成生物被膜时有325个基因表达发生了变化。
下面从几方面对生物被膜形成过程的分子机制的主要表现进行阐述。
3.1与黏附有关的分子生物材料表面具有疏水性是生物被膜形成的重要条件[3]。
念珠菌的最外层是细胞壁，因此其表面的蛋白质在黏附中起重要作用，而且这种作用是由基底层的酵母样细胞完成的。
起黏附作用的蛋白质分子需借助疏水结构域通过非极性键和材料表面结合。
酵母特异性细胞壁蛋白YWP1在酵母样细胞的黏附作用中起负调节作用，故ywp1基因缺失株形成的生物被膜的黏附能力增强[4]。
与黏附有关的als基因家族成员在生物被膜形成中表达水平不一，如als1、als3上调，als7下调，而als5和als10的表达无明显变化。
其中对als3研究比较深入，其过度表达均能使bcr1缺失株在体内外形成成熟的生物被膜，因此对该家族的每一个基因进行详尽的研究有助于进一步了解生物被膜的形成。
黏附分子HWP1缺失在体内外均不能形成成熟的生物被膜[5]。
EAP1能帮助无黏附作用的酿酒酵母和efg1缺失的念珠菌(该菌株无黏附功能)黏附在293细胞，其表达受efg1的调控，目前尚无关于EAP1在生物被膜形成中的作用的研究报道。
CSH1是一个功能未明的细胞壁蛋白，当csh1基因缺失时，整个细胞表面的疏水性明显降低。
Cao等使用法尼醇(farnesol)抑制白色念珠菌形成生物被膜时，csh1的表达下降，并且呈负相关关系，提示其可能在生物被膜中起黏附作用。
CSA1也是一种细胞壁蛋白，具有半胱氨酸富集的疏水结构域，推测其可能参与黏附过程。
3.2群体感应群体感应(quorum sensing)是微生物生物被膜形成过程中的调控机制之一，其能避免细胞过度增殖[6]。
目前在白色念珠菌生物被膜研究中发现2种群体感应分子，即法尼醇和酪醇。
酪醇在生物被膜形成中的作用不明，法尼醇则能抑制生物被膜的形成，并呈量效关系。
Cao等发现，使用法尼醇抑制白色念珠菌生物被膜形成时伴有274个基因的表达水平发生改变，其中包括有关细胞壁蛋白、菌丝生长、外排泵及热休克蛋白等基因。
目前认为法尼醇对生物被膜的抑制作用是通过组氨酸激酶(CHK1)的表达或激活来实现的[7]。
4.白色念珠菌形成生物被膜后的耐药机制细菌形成生物被膜是导致其高度耐药的重要原因之一，也是临床医师最关注的问题。
白色念珠菌形成生物被膜后，对常用唑类药物氟康唑的耐药性增高100倍以上，对两性霉素B的耐药性提高20～30倍以上。
2个采用不同检测方法的独立性研究发现，已形成生物被膜的白色念珠菌对药物的耐药性在细胞黏附后2 h内就已开始增高，而且其耐药性随着生物被膜的成熟而增大。
近年来的研究发现，多种机制参与了白色念珠菌生物被膜的形成以及耐药性的提高。
4.1细胞外基质形成的机械屏障成熟的生物被膜形成后，在共聚焦显微镜下可以见到厚达450μm的细胞外基质，因此药物难以穿透该机械屏障到达细胞曾被认为是白色念珠菌产生耐药性的主要机制。
Baillie等利用白色念珠菌在静止和振荡条件下形成的生物被膜，并根据其细胞外基质产生量达到最低和最高时的特点，分别检测其对抗真菌药物的敏感性，结果两者无明显差异。
Al-Fattani等证实，抗真菌药物能穿透生物被膜，使细胞表面的药物浓度达到MIC的数倍。
此外，Ramage等将生物被膜内的白色念珠菌分离出来进行游离培养，发现其仍对氟康唑耐药。
以上研究结果均提示，细胞本身的内在特性决定其耐药性，而细胞外基质不是耐药的主要机制。
4.2生物被膜内细胞的生长速率人们曾经认为，生长在基质内的细胞由于得不到充分的营养而导致细胞生长速率低下是引起其耐药的机制。
然而多项研究比较了生物被膜内和游离培养时的细胞生长速率，发现二者之间并没有差异。
此外，Baillie等证实，形成了成熟生物被膜的菌株对AmB的耐药性与细胞的生长速率和培养基营养成分并不相关。
4.3细胞的异质性典型生物被膜的重要特征之一是大量菌丝细胞的存在，但其在细菌耐药机制中的作用尚不明了。
虽然目前有很多研究将决定菌丝形成的基因敲除或使用药物干扰，结果细胞在硅胶或聚氯乙烯等表面不能形成成熟的生物被膜，仅见稀疏的酵母样细胞黏附，但是没有进行相应的药敏检测。
然而，Ramage等发现，efg1缺失突变株和cph1/efg1双缺失突变株形成的生物被膜虽然不典型，但是仍然对AmB和氟康唑耐药。
因此菌丝细胞在耐药机制中的作用尚需进一步研究。
5.白色念珠菌生物被膜感染的治疗白色念珠菌形成生物被膜后，由于外排泵活性增加、细胞膜甾醇代谢异常等因素，对常用的唑类药物(包括新一代的伏立康唑、伊曲康唑等)产生耐药，目前临床上对白色念珠菌形成的生物被膜感染尚无理想对策，一旦发生，通常需要取出生物装置。
但以下的研究结果提示，有些药物可能成为治疗白色念珠菌生物被膜感染的有效手段。
5.1卡泊芬净卡泊芬净属于棘白菌素类抗真菌药物，能特异性地作用于真菌细胞壁，抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶。
已有多项试验证实，其在治疗浓度范围内时能抑制体外和动物体内白色念珠菌形成生物被膜。
其作用机制可能和抑制真菌细胞与生物材料的黏附、改变被膜内细胞的形态和代谢状态有关，此外还可能通过抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶影响细胞外基质发挥作用。
与其同类的药物——米卡芬净(micafungin)也有类似作用。
5.2AmB的脂质复合物白色念珠菌形成生物被膜后对AmB耐药，但是AmB的脂质复合物在体外被证实有明显抑制白色念珠菌形成生物被膜的作用，其具体作用机制尚不明了。
5.3针对某些作用靶位采取治疗Kumamoto在研究MKC1p在白色念珠菌形成生物被膜中的作用时发现，当敲除mkc1基因后，变异株不能形成典型的生物被膜，而且对氟康唑敏感；将外源mkc1基因转染mkc1缺失突变株并表达，则又能形成成熟的生物被膜，而且对氟康唑的耐药性同野生株相似。
因此可针对该信号传导通路设计药物。
此外，Alem等[8]发现，阿斯匹林及其他环氧化酶抑制剂能不同程度地抑制白色念珠菌形成生物被膜，但由于缺乏药敏试验数据的支持，仍需进一步研究以确证其是否可用于临床。
法尼醇作为群体感应分子能使白色念珠菌形成的生物被膜仅见稀疏的酵母样细胞黏附，如果相关的药敏试验能够证实细胞的耐药性消失，则不失是一种有效药物。
5.4大环内酯类药物大环内酯类药物可以抑制细菌生物被膜黏附活动所必需的藻酸盐合成酶——甘露糖脱氢酶，减少藻酸盐的合成，影响细胞外多糖蛋白复合物的生成，使细菌间的黏液成分减少，生物被膜形成受阻，从而使抗菌药物容易透过被膜接触细菌，杀菌疗效增强[9]。
由于念珠菌生物被膜的成分目前不明，而且已有研究证实细胞外基质形成的机械屏障不是细胞耐药的主要机制，因此理论上该类药物不能增强抗真菌药物的疗效，目前还未见该方面的研究报道。
总结白色念珠菌生物被膜的形成和耐药机制非常复杂，但是目前对白色念珠菌的基因组测序和注释已完成。
随着对生物被膜研究的深入，在充分了解白色念珠菌在黏附有机物表面或活组织后是如何将信号传导到细胞核导致基因进行协调表达的详细过程后，将能设计出用于治疗白色念珠菌感染的新型抗真菌药物。
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