去甲斑蝥素对人卵巢癌细胞株AO增殖及细胞周期的影响

去甲斑蝥素衍生物Nd3对人卵巢癌细胞SKOV3增殖的作用及机制初步探讨曹菁华;徐波;李敏;武德柱;黄薇;崔景荣【期刊名称】《癌症（英文版）》【年(卷),期】2007(026)004【摘要】背景与目的:去甲斑蝥素(norcanthridin,NCTD)是斑蝥素(canthridin)的衍生物,对多种肿瘤细胞的生长均有抑制作用,但其药效较同类化疗药物小.本研究探讨NCTD衍生物Nd3对人卵巢癌细胞SKOV3的体外抗增殖作用,同时与NCTD 的作用进行比较,并初步探讨Nd3的作用机制.方法:采用增殖抑制实验分别测定Nd3和NCTD对SKOV3细胞增殖的抑制作用,流式细胞术分析Nd3对SKOV3细胞周期和细胞凋亡的改变.Western blot方法检测Nd3对SKOV3细胞周期和凋亡相关蛋白Cdc2、Cyclin B1、Bax和Bcl-2表达的影响.结果:2.5、5、10、20、30和40 μmol/L的Nd3作用SKOV3细胞48 h后,细胞抑制率依次为27.3%、34.1%、53.3%、64.3%、83.3%和96.7%,与阴性对照组比较差异有显著性(P＜0.001).Nd3作用24 h、36 h和48 h的IC50分别为(25.1±2.3)μmol/L、(21.8±2.8)μmol/L和(20.4±3.3)μmol/L.细胞周期分析证实,10、20、30、40μmol/L Nd3作用48 h后,G2/M期细胞百分数为14.3%、20.2%、26.2%和27.9%:同时30 μmol/L的Nd3作用12、24、36、48 h后,G2/M期的细胞比例分别为19.8%、26.6%、27.8%和32.0%,呈现G2/M期阻滞.此外Nd3可以诱导SKOV3细胞凋亡,40 μmol/L的Nd3作用48 h后细胞凋亡率高于对照组30%以上.Western blot结果表明,Nd3可使Bax蛋白的表达增高,而Cdc2、Cyclin B1和Bcl-2的表达则相应减少.结论:Nd3能明显抑制SKOV3细胞的增殖,其作用比NCTD强,且可阻断SKOV3细胞周期于G2/M期并诱导细胞凋亡,其作用机制与Cdc2、Cyclin B1、Bcl-2和Bax蛋白的表达变化有关.【总页数】6页(P361-366)【作者】曹菁华;徐波;李敏;武德柱;黄薇;崔景荣【作者单位】北京大学医学部天然药物与仿生药物国家重点实验室,北京,100083;北京大学医学部天然药物与仿生药物国家重点实验室,北京,100083;北京大学医学部天然药物与仿生药物国家重点实验室,北京,100083;北京大学医学部天然药物与仿生药物国家重点实验室,北京,100083;北京大学医学部天然药物与仿生药物国家重点实验室,北京,100083;北京大学医学部天然药物与仿生药物国家重点实验室,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】R737.31因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

去甲斑蝥素诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展李先茜;李晓丽【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2013(010)009【总页数】2页(P1145-1146)【关键词】去甲斑螯素;肿瘤;细胞凋亡【作者】李先茜;李晓丽【作者单位】上海市徐汇区中心医院中心实验室,200031;上海市徐汇区中心医院中心实验室,200031【正文语种】中文人类用斑蝥治疗疾病已有2000多年的历史，斑蝥为芫青科昆虫南方一大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥体，《木经》中称其味辛、热，有大毒，归肝、胃、肾、大肠和小肠，具有攻毒蚀疮，逐淤散结的功效。

斑蝥抗癌的主要有效成分为斑蝥素，主要用于治疗肝癌、食管癌及胃癌等，但斑蝥素对泌尿系统刺激作用较强烈，应用受到限制。

去甲斑蝥素（NCTD）是斑蝥素的衍生物，是从斑蝥中提取斑蝥素并经人工合成的一种新型低毒的抗癌药物，具有抗癌和升白细胞的作用，是当今国际上第一种有升高白细胞作用的抗癌药物。

随着研究的深入，人们对NCTD的抗癌作用机制有一定的了解。

细胞凋亡是近年来肿瘤治疗研究的热点之一。

细胞凋亡，是一种不同于细胞坏死的生理方式，其细胞形态和生化方面的变化主要包括DNA断裂、染色质凝聚、膜结构肿胀、细胞皱缩、凋亡小体形成等，它与细胞增殖、分化一样是细胞的基本生命活动，三者密切相关。

细胞凋亡是由一种基因调控的细胞主动死亡过程，在大多数细胞凋亡过程中，都需要有新的基因表达。

近年研究表明，与诱导细胞凋亡有关的基因有：ced－2、ced－3、ced－4、c－myc、c－fos、p53、肿瘤坏死因子α（TNFα）等；与抑制凋亡有关的基因有：bcl－2、ced－9、凋亡抑制剂（IAP）等。

由于细胞增殖、分化、凋亡三者之间的平衡失调与肿瘤的发生和发展有关。

20世纪90年代以后，细胞凋亡已成为肿瘤学研究的一个热点。

诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗癌药物的重要作用之一。

NCTD是新型抗肿瘤药物，主要用于治疗肝癌、食管癌及胃癌等，具有较强的抗肿瘤活性和独特的升高白细胞作用。

去甲斑蝥素对人胆管癌细胞系QBC939增殖和凋亡的实验
研究的开题报告
胆管癌是一种常见的肿瘤，目前的治疗手段主要包括手术切除、化疗和放疗等，但其
治疗效果并不理想。

因此，寻找新的治疗方法具有重要意义。

去甲斑蝥素是一种天然存在于咖啡因中的生物碱。

研究表明，去甲斑蝥素有抗癌作用。

本实验旨在探究去甲斑蝥素对人胆管癌细胞系QBC939增殖和凋亡的影响。

实验将采用体外细胞培养方法，选用人胆管癌细胞系QBC939作为实验对象。

首先将QBC939细胞系分为对照组和实验组，对照组细胞只加入培养基，实验组细胞加入去
甲斑蝥素。

然后对两组细胞分别进行细胞计数和细胞凋亡分析。

细胞增殖情况将通过
显微镜观察，并采用MTT法检测细胞的生长曲线。

细胞凋亡情况将采用流式细胞术检测。

预期结果为：实验组细胞增殖能力较对照组明显降低，且实验组细胞凋亡率较高。

这
表明去甲斑蝥素能够抑制胆管癌细胞系QBC939的增殖，促进其凋亡，具有一定的抗
癌作用。

本研究有望为探究胆管癌的发病机制提供新思路，同时为胆管癌的治疗提供新靶点和
新方法。

去甲斑蝥素对人肝癌HepG2细胞生长抑制作用的实验观察常城;朱尤庆;梅娟娟【摘要】目的探讨去甲斑蝥素对人肝癌HepG2细胞系抑制和诱导凋亡作用.方法采用MTT法检测细胞的生长活性,应用流式细胞仪检测、透射电镜下观察去甲斑素处理HepG2细胞后细胞周期阻滞和细胞凋亡的发生情况.结果 5～40 μg/ml去甲斑蝥素均能抑制HepG2细胞增殖(P＜0.05),其抑制率与作用时间及NCTD浓度相关.流式细胞仪检测发现,去甲斑蝥素处理HepG2细胞后,实验组G2/M细胞明显多于对照组,P＜0.05,提示细胞周期停滞于G2/M期.透射电镜下可见,HepG2细胞出现凋亡形态学改变.结论去甲斑蝥素对HepG2细胞有抑制作用,可能与阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡有关.【期刊名称】《实用癌症杂志》【年(卷),期】2010(025)005【总页数】3页(P450-452)【关键词】去甲斑蝥素;细胞凋亡;肝癌【作者】常城;朱尤庆;梅娟娟【作者单位】430071,湖北省肠病医学临床研究中心,武汉大学中南医院消化内科;430071,湖北省肠病医学临床研究中心,武汉大学中南医院消化内科;430071,湖北省肠病医学临床研究中心,武汉大学中南医院消化内科【正文语种】中文【中图分类】R73-36+1原发性肝癌作为1种发病率较高的消化道肿瘤[1]，由于患者早期无症状，大多数人就诊时已是晚期，故其预后差、死亡率高。

化疗是治疗肝癌必不可少的手段之一，但大多数化疗药物由于毒副作用大而限制了其临床应用。

因此寻找高效、低毒的抗痛药，仍是目前国内外肿瘤研究的热点。

斑蝥为芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥虫体，在《本经》中称其性味辛、寒，有大毒，归肝、肾、胃、大肠、小肠经，具有攻毒蚀疮，逐瘀散结的功效。

斑蝥(cantharidin,CA)抗癌的主要有效成分为斑蝥素，对原发性肺癌、乳腺癌、消化道肿瘤等有一定疗效，但由于对胃肠道等的毒性作用限制了其在临床上的应用。

去甲斑蝥素对大肠癌患者HT-29细胞增殖及Livin、Caspase-3表达的影响陈华;曾燕;张舟;胡丽萍;胡波;彭素梅【期刊名称】《临床合理用药杂志》【年(卷),期】2017(10)33【摘要】目的探讨去甲斑蝥素(NCTD)对大肠癌患者HT-29细胞增殖及Livin、Caspase-3表达的影响。

方法体外培养人大肠癌HT-29细胞株,采用MTT法测定NCTD对HT-29细胞的增殖抑制情况,以免疫细胞化学法和RT-PCR法检测NCTD 对HT-29细胞中Livin、Caspase-3表达的影响。

结果浓度较低10μg/ml时,NCTD对HT-29细胞的抑制不明显,随着NCTD浓度增加,HT-29细胞抑制作用逐渐增强,NCTD浓度为100μg/ml,抑制率达90.82%,IC50为65.28μg/ml。

NCTD作用12 h后即出现抑制效应,随着时间延长抑制率逐渐增强,36 h抑制率达55.84%,呈时间效应关系,最佳作用时间为36 h。

将NCTD作用HT-29细胞前设为对照组,Livin多呈阳性表达,Caspase-3多呈阴性。

IC50NCTD作用36 h后,NCTD组Livin蛋白表达显著低于对照组,Caspase-3蛋白表达高于对照组(P<0.05)。

IC50NCTD作用36 h后,NCTD组Livin mRNA表达显著低于对照组,Caspase-3 mRNA表达显著高于对照组(P<0.01)。

结论 NCTD可抑制HT-29细胞生长,能够降低细胞凋亡抑制因子Livin表达,其机制还可能与细胞凋亡信号通路中的重要环节Caspase-3有关。

【总页数】2页(P177-178)【作者】陈华;曾燕;张舟;胡丽萍;胡波;彭素梅【作者单位】国网江西省电力公司吉安供电分公司医务所;吉安市中心人民医院;吉安市第一人民医院;吉安市吉州区白塘卫生院;井冈山大学临床医学部【正文语种】中文【中图分类】R651.15【相关文献】1.去甲斑蝥素对白血病细胞系K562的增殖、凋亡、细胞周期及NF-κB活性的影响2.去甲斑蝥素对白蛋白刺激肾小管上皮细胞增殖及上调纤维连接蛋白表达的影响3.去甲斑蝥素对人卵巢癌细胞株AO增殖及细胞周期的影响4.缺氧诱导因子-1α对肺癌细胞凋亡、增殖的影响及与Livin、Caspase-3表达的相关性因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

去甲斑蝥素对卵巢癌3AO和AO细胞的体外抑制作用唐龙英;王昭梅;郑钦岳;宓鹤鸣;朱玲仙;曹颖瑛【期刊名称】《第二军医大学学报》【年(卷),期】1999(20)2【摘要】目的：观察去甲斑蝥素（ＮＣＴＤ）体外对卵巢癌３ＡＯ细胞和ＡＯ细胞的抑制作用，并初步探讨其作用机制。

方法：利用细胞培养技术，以结晶紫染色法测定ＮＣＴＤ对卵巢癌３ＡＯ和ＡＯ细胞的抑制作用，并利用流式细胞仪测定分析ＮＣＴＤ作用下两种肿瘤细胞的细胞周期变化。

结果：ＮＣＴＤ１μｇ／ｍｌ即对３ＡＯ和ＡＯ细胞有轻微抑制作用，其半数抑制剂量（ＩＣ５０）分别为２０μｇ／ｍｌ和１０μｇ／ｍｌ。

ＮＣＴＤ作用６ｈ，３ＡＯ和ＡＯ细胞生长即受到抑制，其抑制率随着药物作用时间延长而升高。

在ＮＣＴＤ作用下，３ＡＯ和ＡＯ细胞Ｇ２＋Ｍ期细胞百分比明显升高，而Ｓ期细胞百分比相应地明显降低。

结论：ＮＣＴＤ体外对卵巢癌３ＡＯ和ＡＯ细胞有明显抑制作用，其抑制作用呈剂量和时间依赖性。

【总页数】3页(P97-99)【关键词】卵巢肿瘤;细胞周期;3AO细胞;AO细胞;NCTD【作者】唐龙英;王昭梅;郑钦岳;宓鹤鸣;朱玲仙;曹颖瑛【作者单位】第二军医大学长海医院妇产科;第二军医大学药学院药理学教研室;第二军医大学药学院生药学教研室【正文语种】中文【中图分类】R737.31【相关文献】1.去甲斑蝥素对人卵巢癌细胞株AO增殖及细胞周期的影响 [J], 熊礼凤;杨江升;楼银妹;汪霖;李平儿;李华美2.hCG对人卵巢癌细胞株3AO体外生长和细胞周期的影响 [J], 邢艳;廖英;陈曼玲3.拓扑替康及其联合化疗对卵巢癌细胞系3AO及耐药系3AO/cDDP作用的实验研究 [J], 刘培淑;延俊元;侯萍;李爱华4.姜黄素及其联合化疗对卵巢癌细胞株3AO体外增殖的抑制作用 [J], 李强;季梅;季华5.拓扑替康与顺铂对bcl-2及fas在卵巢癌细胞系3AO及其耐药系3AO/cDDP表达的影响 [J], 延俊元;刘培淑;张燕玲;王翠兰;薛云霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

㊃论 著㊃[收稿日期]2018-05-10;[修回日期]2018-11-16[基金项目]河北省中医药管理局科研计划项目(2017215)[作者简介]高杨(1983-),男,河北衡水人,河北医科大学附属河北省儿童医院主治医师,医学硕士,从事血管肿瘤介入研究㊂去甲斑蝥素对人黑色素瘤A 375细胞周期、活性氧自由基及细胞凋亡的影响高 杨1,刘 岩1,丛力宁1,冯 敏2(1.河北医科大学附属河北省儿童医院介入科,河北石家庄050031;2.河北省皮肤病防治院皮肤科,河北保定071000) [摘要] 目的探讨去甲斑蝥素(N o r c a n t h a r i d i n ,N C T D )对人黑色素瘤A 375细胞周期㊁R O S 自由基及细胞凋亡的影响及其机制㊂方法培养人A 375黑素瘤细胞,分别采用10,20,40μm o l /L N C T D 预处理,培养48h 后,采用流式细胞术测定N C T D 对人A 375黑素瘤细胞周期的影响,采用免疫印迹法检测N C T D 对人A 375黑素瘤细胞蛋白C y c l i nD 1和P 21表达的影响,采用流式细胞术测定N C T D 对人A 375黑素瘤细胞R O S 及凋亡水平的影响㊂结果10,20,40μm o l /L N C T D 组G 1期细胞比例高于对照组,S 期和G 2期细胞比例低于对照组,20,40μm o l /LN C T D 组G 1期细胞比例高于10μm o l /L N C T D 组,S 期和G 2期细胞比例低于10μm o l /L N C T D 组,40μm o l /L N C T D 组G 1期细胞比例高于20μm o l /L N C T D 组,S 期和G 2期细胞比例低于20μm o l /L N C T D 组(P <0.05)㊂40μm o l /L N C T D 组处理人A 375黑色素瘤细胞48h 后,细胞周期蛋白C y c l i nD 1㊁C y c l i nA 和C D K 2低于对照组,P 21蛋白高于对照组(P <0.05)㊂10,20,40μm o /L N C T D 组细胞内R O S 水平高于对照组,20,40μm o l /L N C T D 组细胞内R O S 水平高于10μm o l /L N C T D 组,40μm o l /L N C T D 组细胞内R O S 水平高于20μm o l /L N C T D 组(P <0.05)㊂10,20,40μm o l /L N C T D 组细胞凋亡率高于对照组,20,40μm o l /L N C T D 组细胞凋亡率高于10μm o l /L N C T D 组,40μm o l /L N C T D 组细胞凋亡率高于20μm o l /L N C T D 组(P <0.05)㊂N A C 组细胞凋亡率低于对照组,N C T D 组和N A C +N C T D 组细胞凋亡率高于对照组,N A C+N C T D 组细胞凋亡率低于N C T D 组,差异均有统计学意义(P <0.05)㊂结论N C T D 通过阻滞细胞G 1周期㊁减少S 期抑制人A 375黑色素瘤细胞的增殖,通过诱导R O S 水平升高诱导细胞凋亡㊂[关键词] 黑色素瘤;去甲斑蝥素;细胞凋亡 d o i :10.3969/j.i s s n .1007-3205.2019.12.018 [中图分类号] R 739.5 [文献标志码] A [文章编号] 1007-3205(2019)12-1433-05E f f e c t s o f n o r c a n t h a r i d i no n t h e c e l l c y c l e ,r e a c t i v e o x y g e n s pe c i e s a n da p o pt o s i s i nh u m a nm e l a n o m a c e l l s t r a i nA 375G A O Y a n g 1,L I U Y a n 1,C O N GL i -n i n g 1,F E NG M i n 2(1.D e p a r t m e n t o f I n t e r v e n t i o n a lR a d i o l o g y ,A f f i l i a t e d H e b e iC h i l d r e n 'sH o s p i t a l o f He b e iM e d i c a l U n i v e r s i t y ,S h i j i a z h u a n g 050031,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t of D e r m a t o l og y ,H e b e iP r o v i n c eD e r m a t o l o g y H o s p i t a l ,B a o d i n g 071000,C h i n a )[A b s t r a c t ] O b je c t i v e T oi n v e s t i g a t et h eef f e c t so fn o r c a n t h a r i d i n (N C T D )o nt h ec e l l c y c l e ,r e a c t i v eo x yg e ns p e c i e s (R O S )a n da p o p t o s i si ni nh u m a n m e l a n o m ac e l ls t r ai n A 375.M e t h o d s T h e c e l l c y c l e o f h u m a nA 375m e l a n o m a c e l l sw a s d e t e r m i n e db y f l o wc y t o m e t r y af t e r 48h o u r s o f i n c u b a t i o nw i t h 10,20a n d 40μm o l /LN C T D.T h e e f f e c t s o fN C T Do n t h e e x p r e s s i o n o fC y c l i n D 1a n dP 21p r o t e i n w e r e m e a s u r e db y W e s t e r nb l o t .T h ee f f e c t so fr e a c t i v eo x y ge n s p e c i e s a n d a p o p t o s i s o n t h e c e l l c y c l e s o fA 375w a sm e a s u r e db yf l o wc y t o m e t r i c a s s a y.R e s u l t s F l o wc y t o m e t r y sh o w e d t h a tA 375c e l l s t r e a t e dw i t hN C T D w e r eb l o c k e d a tG 1p h a s e i n t h e c e l l c y c l e s i nad o s ed e p e n d e n t m a n n e r (P <0.05).T h ee x p r e s s i o no fC y c l i n D 1,C yc l i n A ,C D K 2㊃3341㊃第40卷第12期2019年12月河北医科大学学报J O U R N A L O F H E B E I M E D I C A L U N I V E R S I T YV o l .40 N o .12 D e c . 2019Copyright ©博看网. All Rights Reserved.p r o t e i nw a s d e c r e a s e d i nm a l i g n a n tm e l a n o m a c e l l s t r e a t e dw i t hN C T D,h o w e v e r P21p r o t e i nw a s i n c r e a s e d(P<0.05).T h e l e v e l s o f R O S a n d a p o p t o s i sw e r e i n c r e a s e d i nm a l i g n a n tm e l a n o m a c e l l s t r e a t e dw i t h N C T Di nad o s ed e p e n d e n tm a n n e r(P<0.05).W h i l et h e l e v e l so fa p o p t o s i sw a s d e c r e a s e d a f t e r t r e a t e dw i t h t h eR O Ss c a v e n g e rN-a c e t y l c y s t e i n e(P<0.05).C o n c l u s i o n N C T D c a n i n h i b i t t h e p r o l i f e r a t i o no fh u m a n A375m e l a n o m ac e l l sb y b l o c k i n g t h ec e l lc y c l eo fG1, r e d u c i n g c e l l c y c l e o f S a n d c a n i n d u c e t h e a p o p t o s i s o f h u m a nA375m e l a n o m a c e l l s b y i n d u c i n g a h i g h e r l e v e l o fR O S.[K e y w o r d s] m e l a n o m a;n o r c a n t h a r i d i n;a p o p t o s i s在我国,皮肤癌已经位居于肿瘤发病率的第8位[1],严重威胁着大众的健康[2-3]㊂去甲斑蝥素(n o r c a n t h a r i d i n,N C T D)是一种新型开发的治癌药物,对多种癌症具有较好的疗效[4-6]㊂药物的抗肿瘤作用多是通过影响细胞增殖周期达到抑制肿瘤生长的目的[7-9],且药物通过激活活性氧(r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s,R O S)诱导细胞凋亡而达到治疗癌症的目的[10-14]㊂本研究采用流式细胞术分析N C T D对人黑色素瘤A375细胞周期㊁R O S自由基生成及细胞凋亡的影响,旨在为进一步阐明N C T D 的抗肿瘤作用机制提供实验依据㊂1材料与方法1.1细胞株来源人A375黑色素瘤细胞株,来源于中国科学院上海细胞研究所㊂1.2试剂和实验仪器胰酶㊁胎牛血清㊁R P M I1640培养基(美国G i b c o公司),胰酶㊁5-F U㊁D M S O㊁D C F H-D A㊁碘化丙啶(美国S i g m a公司),P B S片剂(上海生工生物工程有限公司),R I P A蛋白裂解液及5ˑx l o a d i n g b u f f e r㊁活性氧检测试剂盒㊁A n n e x i n V-F I T C细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司), E C L发光试剂(T h e r m o f i s h e r,美国),一抗C y c l i n D1㊁C y c l i n A㊁P21㊁C D K2㊁β-a c t i n㊁二抗,A K T (S a n t aC r u z,美国),其他试剂为分析纯试剂;N C T D (美国S i g m a公司);C O2细胞培养箱(T h e r m o f i s h e r,美国),超净工作台(A i r T e c h,日本), C o u n t s t a r自动细胞技术仪(I n n o-A l l i a n c eB i o t e c h,美国),F A C SC a n t oⅡ流式细胞仪(B D,美国),多功能酶标仪(B i o T e k,美国)等㊂1.3人A375黑色素瘤细胞的培养用含10%牛血清的R P M I1640培养基,培养基使用前用37ħ水浴预温㊂在5%C O2细胞孵箱中培养,当培养基颜色偏黄的时候,需要更换细胞的培养液,将超净工作台用紫外线照射杀菌后,弃去原培养基,用P B S 洗涤1次后,重新加入37ħ水浴预温的培养基中,并置于5%C O2细胞孵箱中培养㊂待细胞密度达到80%融合状态时,需要对其进行传代,加入0.25%胰蛋白酶,对其进行消化,约每瓶105个细胞传代到25c m2,3d传代1次㊂1.4人A375黑色素瘤细胞周期的测定采用流式细胞术,取对数生长期细胞消化,调整为5ˑ104个/m L,取100μL接种于96孔板内,5%C O2孵箱中培养24h后给予不同剂量N C T D㊂设空白对照组和10,20,40μm o l/L N C T D给药组㊂置于5% C O2孵箱中分别培养48h,加入0.25%胰酶溶液消化,培养基重悬㊂用P B S洗涤2次后,用70%乙醇固定,过夜,12000g离心10m i n,用P B S洗涤3次,加入碘化丙啶与R N A酶,室温暗处静置30 m i n,上流式细胞仪完成检测㊂1.5 N C T D对人A375黑色素瘤C y c l i nD1㊁C y c l i n A㊁P21㊁C D K2表达的影响采用W e s t e r n-b l o t法,取对数生长期细胞消化,调整为5ˑ104个/m L,取100μL接种于96孔板内,设空白对照组和40μm o l/LN C T D给药组㊂5%C O2孵箱中培养24h 后给予40μm o l/LN C T D㊂置于5%C O2孵箱中分别培养48h后,吸弃培养液消化细胞,用P B S洗涤2次后,冰上放置,加入预冷的R I P A细胞裂解液,充分混匀,冰上静置30m i n,12000g离心10m i n,取上清液,B i o-R a d法蛋白定量后调整为一致的蛋白浓度㊂加入2ˑS D S上样缓冲液,煮沸10m i n使蛋白变性,配制12%S D S聚丙酰胺凝胶,每孔上样预先制备好的样品等量蛋白,电泳分离后转膜,转移至硝酸纤维素膜,用5%脱脂牛奶在摇床上封闭2 h,加入稀释过的一抗4ħ孵育过夜㊂用T B S洗涤3次后,加入稀释过的辣根过氧化物酶标记的二抗, 37ħ避光孵育1h,用T B S洗涤3次,用化学发光法检测相应蛋白条带的灰度值,各实验组与内参的比值为相应蛋白的表达量㊂1.6人A375黑色素瘤细胞R O S的测定采用流式细胞术,取对数生长期细胞消化,调整为5ˑ104个/m L,取100μL接种于96孔板内,5%C O2孵箱中培养24h后给予不同剂量N C T D㊂设空白对照组和10,20,40μm o l/L N C T D给药组㊂置于5% C O2孵箱中分别培养48h,吸弃培养液消化细胞,㊃4341㊃河北医科大学学报第40卷第12期Copyright©博看网. All Rights Reserved.用P B S 洗涤2次后,收集细胞,加入2μL 终浓度为10μm o l /L 的D C F H -D A 溶液,37ħ孵育箱中继续孵育15m i n ,P B S 洗涤2次,用流式细胞仪检测R O S 的平均荧光强度,激发波长为488n m ,发射波长为530n m ㊂由于D C F H -D A 进入细胞内,在细胞内酯酶的作用下转变为D C F H ,被细胞内的R O S 氧化,生成D C F ,D C F 是一种能发出绿色荧光的荧光物质㊂因此,根据细胞内的荧光强度就可以测出细胞内的R O S 量㊂结果用荧光强度百分比表示㊂1.7 人A 375黑色素瘤细胞凋亡水平的测定 采用流式细胞术,取对数生长期细胞消化,调整为5ˑ104个/m L ,取100μL 接种于96孔板内,5%C O 2孵箱中培养24h 后给予不同剂量N C T D ㊂设空白对照组和10,20,40μm o l /L N C T D 给药组㊂置于5%C O 2孵箱中分别培养48h 后,吸弃培养液消化细胞,P B S 洗涤2次,收集细胞,加入b i n g d i n gs o l u t i o n ,重悬细胞,取100μL 细胞液,加入A n n e x i nV10μL ,再加入碘化丙啶5μL ㊂充分混匀后,室温避光静置15m i n ,加入b i n g d i n g s o l u t i o n,充分混匀后,上流式细胞仪测定㊂1.8 R O S 清除剂N -乙酰半胱氨酸对N C T D 诱导人A 375黑色素瘤细胞凋亡的影响 取对数生长期细胞消化,调整为5ˑ104个/m L ,取100μL 接种于96孔板内,5%C O 2孵箱中培养24h 后给予不同剂量N C T D ㊂设空白对照组(0μm o l /L N C T D 组)㊁2mm o l /LN -乙酰半胱氨酸组(N A C 组)㊁40μm o l /LN C T D 组(N C T D 组)和2mm o l /L N -乙酰半胱氨酸+40μm o l /L N C T D 组(N A C+N C T D 组)㊂置于5%C O 2孵箱中分别培养48h 后,采用流式细胞术测定细胞凋亡水平㊂1.9 统计学方法 应用G r a ph P a dP r i s m5.0统计软件(S a nD i e goC a l i f o r n i aU S A )分析数据㊂计量资料比较分别采用两独立样本的t 检验㊁F 检验和S N K -q 检验㊂P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 N C T D 对人A 375黑色素瘤细胞周期的影响 采用流式细胞术分析不同浓度N C T D 作用在人A 375黑色素瘤细胞48h 后细胞周期改变㊂10,20,40μm o l /LN C T D 组G 1期细胞比例高于对照组,S 期细胞比例低于对照组,20,40μm o l /L N C T D 组G 2期细胞比例低于对照组,20,40μm o l /L N C T D组G 1期细胞比例高于10μm o l /L N C T D 组,S 期和G 2期细胞比例低于10μm o l /L N C T D 组,40μm o l /LN C T D 组G 1期细胞比例高于20μm o l /L N C T D 组,S 期和G 2期细胞比例低于20μm o l /LN C T D 组,差异均有统计学意义(P <0.05),见表1㊂表1 4组A 375细胞周期分布情况比较T a b l e 1 C o m p a r i s o no fA 375c e l l c yc l ed i s t r i b u t i o n i n4g r o u ps (n =3,x -ʃs ,%)组别G 1期S 期G 2期对照组36.13ʃ2.1148.23ʃ3.7815.69ʃ3.1610μm o l /L N C T D 组44.07ʃ3.15*43.15ʃ1.21*12.73ʃ1.6520μm o l /L N C T D 组55.37ʃ2.71*#35.87ʃ1.05*#8.66ʃ1.11*#40μm o l /L N C T D 组72.21ʃ1.12*#ә24.43ʃ3.02*#ә3.37ʃ1.27*#әF 值 130.67973.90821.997P 值 0.0000.0000.000*P 值<0.05与对照组比较 #P 值<0.05与10μm o l /L N C T D 组比较 әP 值<0.05与20μm o l /LN C T D 组比较(S N K -q 检验)2.2 N C T D 对人A 375黑色素瘤C yc l i nD 1㊁P 21㊁C yc l i nA 和C D K 2表达的影响 经W e s t e r nb l o t 检测,40μm o l /L N C T D 组处理人A 375黑色素瘤细胞48h 后,C y c l i nD 1㊁C y c l i nA 和C D K 2低于对照组,P 21蛋白高于对照组,差异均有统计学意义(P <0.05),见表2㊂表2 40μm o l /LN C T D 作用48h 后对A 375细胞周期蛋白C y c l i nD 1㊁P 21㊁C y c l i nA 和C D K 2表达的影响T a b l e 2 E f f e c t o f 40μm o /LN C T Do n t h e e x p r e s s i o no fC y c l i nD 1,P 21,C y c l i nA ,C D K 2i nA 375c e l l s (n =3,x -ʃs )组别C yc l i nD 1P 21C yc l i nA C D K 2对照组0.822ʃ0.0230.654ʃ0.0150.660ʃ0.0760.390ʃ0.02040μm o /LN C T D 组0.486ʃ0.0111.416ʃ0.0320.353ʃ0.0650.247ʃ0.070t 值27.40738.9995.8043.220P 值0.0000.0000.0040.0322.3 N C T D 对人A 375黑色素瘤细胞R O S 的影响不同N C T D 处理人A 375黑色素瘤细胞48h 后,采用流式细胞术检测不同浓度N C T D 作用在人A 375黑色素瘤细胞R O S 的水平㊂10,20,40μm o l/L N C T D 组细胞内R O S 水平高于对照组,20,40μm o l /LN C T D 组细胞内R O S 水平高于10μm o l /L N C T D 组,40μm o l /L N C T D 组细胞内R O S 水平高于20μm o l /L N C T D 组,差异均有统计学意义(P <0.05),见表3㊂2.4 N C T D 对人A 375黑色素瘤细胞凋亡水平的影响 不同N C T D 处理人A 375黑色素瘤细胞48h 后,采用流式细胞术检测人A 375黑色素瘤细胞㊃5341㊃河北医科大学学报 第40卷 第12期Copyright ©博看网. All Rights Reserved.凋亡水平㊂10,20,40μm o l/LN C T D组细胞凋亡率高于对照组,20,40μm o l/LN C T D组细胞凋亡率高于10μm o l/LN C T D组,40μm o l/L N C T D组细胞凋亡率高于20μm o l/LN C T D组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表4㊂表3不同浓度N C T D对A375细胞R O S水平的影响T a b l e3E f f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no fN C T Do nR O S l e v e l s i nA375c e l l s(n=3,x-ʃs,%)组别R O S水平对照组18.21ʃ0.3110μm o l/LN C T D组22.41ʃ1.01*20μm o l/LN C T D组39.26ʃ1.31*#40μm o l/LN C T D组53.15ʃ1.56*#әF值634.535P值0.000*P值<0.05与对照组比较#P值<0.05与10μm o l/L N C T D 组比较 әP值<0.05与20μm o l/LN C T D组比较(S N K-q检验)表4不同浓度N C T D对A375细胞凋亡水平的影响T a b l e4E f f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no fN C T Do na p o p t o s i s i nA375c e l l s(n=3,x-ʃs,%)组别凋亡率对照组7.43ʃ0.0210μm o l/LN C T D组13.67ʃ1.54*20μm o l/LN C T D组20.48ʃ1.61*#40μm o l/LN C T D组36.72ʃ1.78*#әF值266.208P值0.000*P值<0.05与对照组比较#P值<0.05与10μm o l/L N C T D 组比较 әP值<0.05与20μm o l/LN C T D组比较(S N K-q检验) 2.5 R O S清除剂N-乙酰半胱氨酸对N C T D诱导人A375黑色素瘤细胞凋亡的影响 N A C组细胞凋亡率低于对照组,N C T D组和N A C+N C T D组细胞凋亡率高于对照组,N A C+N C T D组细胞凋亡率低于N C T D组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表5㊂表5N-乙酰半胱氨酸对N C T D诱导人A375黑色素瘤细胞凋亡的影响T a b l e5E f f e c t o fN C T Da n dN A Co na p o p t o s i si nA375c e l l s(n=3,x-ʃs,%)组别凋亡率对照组7.43ʃ0.02N A C组5.13ʃ0.06*N A C+N C T D组22.39ʃ1.26*#N C T D组36.72ʃ1.78*#әF值575.909P值0.000*P值<0.05与对照组比较#P值<0.05与10μm o l/L N C T D 组比较 әP值<0.05与20μm o l/LN C T D组比较(S N K-q检验)3讨论皮肤黑色素瘤作为一种高度恶性的皮肤肿瘤,进展快,恶性程度高,转移发生早,病死率高,已受到广泛的关注㊂因此,研究新的治疗药物及其作用机制是目前黑色素瘤研究的焦点㊂N C T D是我国新型开发的治癌药物,具有升高白细胞㊁提高免疫力㊁不良反应小㊁抗癌活性高的优势[15-16]㊂既往研究显示,N C T D可抑制多种癌细胞,其机制包括可诱导细胞发生凋亡㊁调控癌基因表达㊁调控细胞周期等[17-21]㊂N C T D对人黑色素瘤A375有明显的抑制作用,并呈时间和浓度依赖性㊂低浓度(10μm o l/L)N C T D可抑制人A375黑素瘤细胞的增殖活性,而对人A375黑素瘤细胞黑色素合成及酪氨酸酶活性没有明显影响;高浓度(20~80μm o l/L)N C T D可抑制人A375黑素瘤细胞的黑色素合成及酪氨酸酶活性㊂本研究采用流式细胞术分析不同浓度N C T D作用在人A375黑色素瘤细胞48h后细胞周期改变,结果显示N C T D可调节人A375黑色素瘤细胞周期进程,使黑色素瘤细胞阻滞于G1期,且呈剂量依赖性;同时S期细胞数明显减少,表明N C T D具有调节G1期的能力㊂G1期是D N A的合成前期,此期细胞内进行着一系列极为复杂的生物合成,如合成各种R N A和核蛋白体㊂所以,G1期是细胞进入合成期的关键,当G1期受到阻滞,直接阻碍D N A的合成,导致细胞增殖受到抑制㊂说明N C T D很可能是通过诱导G1期阻滞而发挥抑制黑色素瘤细胞增殖作用的㊂本研究W e s t e r n b l o t检测结果显示,药物干扰后C y c l i nD1表达受到抑制,而P21表达增加,同时细胞C y c l i n A和C D K2表达降低㊂有研究表明,C y c l i nD1是细胞周期的启动因子,在G1期早期表达,若C y c l i nD1持续高表达,会导致细胞G1期缩短,提前进入S期,使细胞增殖[17];C y c l i nD1促进肿瘤细胞的增殖,使肿瘤组织向四周浸润和转移,P21则抑制信号冲动的传导,起到阻断细胞增殖,抑制细胞生长的负调控作用[22]㊂当C y c l i nD1含量减少,使细胞在G1期受阻,因而抑制了细胞的增殖㊂此外,当细胞从G1期进入S期时,C y c l i nA与C D K2结合,C y c l i nA/ C D K2复合物的数量增加,启动D N A复制㊂而C y c l i nA/C D K2的表达受到抑制㊂这可能正是N C T D抑制人A375皮肤黑色素瘤增殖的机制㊂本研究采用流式细胞术分析不同浓度N C T D 作用在人A375黑色素瘤细胞48h后R O S水平的改变,结果显示10~40μm o l/L N C T D作用在人㊃6341㊃河北医科大学学报第40卷第12期Copyright©博看网. All Rights Reserved.A375黑色素瘤细胞48h后,R O S水平明显高于对照组,且呈剂量依赖性,差异有统计学意义(P< 0.05)㊂文献报道,R O S水平作为细胞的第二信使促进细胞增殖㊁调控细胞增长,但是过高的R O S水平会使细胞因氧化过度而受损,导致细胞凋亡[12]㊂本研究采用流式细胞术分析不同浓度N C T D作用在人A375黑色素瘤细胞48h后凋亡水平的改变,结果发现人A375黑色素瘤细胞的凋亡率随着药物浓度的增加而增加,差异有统计学意义(P<0.05)㊂本研究观察R O S清除剂N-乙酰半胱氨酸对N C T D 诱导人A375黑色素瘤细胞凋亡的影响,发现使用R O S清除剂N-乙酰半胱氨酸后,N C T D诱导人A375黑色素瘤细胞凋亡明显有所降低(P<0.05)㊂表明N-乙酰半胱氨酸可以减弱N C T D诱导人A375黑色素瘤细胞凋亡的作用,说明N C T D可能通过诱导R O S水平升高诱导细胞凋亡㊂总之,N C T D通过阻滞细胞G1周期抑制人A375黑色素瘤细胞的增殖,通过诱导R O S水平升高诱导细胞凋亡㊂N C T D在黑色素瘤的治疗领域具有一定的发展前景,有待进行更深入的研究㊂[参考文献][1] H a m i l t o nK,K i r k p a t r i c kA,R e b a rA,e t a l.P r o t e c t i n gy o u n gc h i ld re na g a i n s t s k i n c a n c e r:p a r e n t a l b e l i ef s,r o l e s,a n d r eg r e t[J].P s y c h o,2017,26(12):2135-2141.[2] L i D,L i nB,Y u s u fN,e t a l.P r o t e o m i c a n a l y s i s a n d f u n c t i o n a ls t u d i e s o f b a i c a l i no n p r o t e i n s a s s o c i a t e dw i t h s k i n c a n c e r[J].A mJC h i n M e d,2017,45(3):599-614.[3] W a n g H,Z h a n g Y,Y u n H,e ta l.E R K e x p r e s s i o na n di t sc o r r e l a t i o n w i t h S T A T1i n e s o p h a g e a l s q u a m o u s c e l lc a r c i n o m a[J].O n c o t a r g e t,2017,8(28):45249-45258.[4]王天阳,王文斌,边伟,等.去甲斑蝥素对胆管癌R B E细胞α-T u b u l i n骨架蛋白及细胞周期的影响[J/C D].中华临床医师杂志:电子版,2013,7(21):9581-9585.[5]王天阳,吕海涛,李猛,等.去甲斑蝥素诱导胆管癌细胞凋亡及对b a x㊁b c l-2㊁半胱天冬酶3和细胞色素C凋亡相关因子影响[J].河北医科大学学报,2013,34(12):1509-1512. 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